一种由银杏淀粉制得的低聚异麦芽糖及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及生物制品技术领域，具体来说是一种由银杏淀粉制得的低聚异麦芽糖及其制备方法和应用，用银杏淀粉制备低聚异麦芽糖的方法包括：银杏淀粉的提取、调浆、液化、糖化、转苷、发酵纯化及真空冷冻干燥后处理步骤，得到低聚异麦芽糖。本发明以银杏淀粉为原料生产低聚异麦芽糖，纯化后的异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖和异麦芽四糖四种功能性糖的总和高达54％，通过比较其和市售玉米低聚异麦芽糖对植物乳杆菌的增值作用，其益生活性超过目前市售的一般低聚异麦芽糖；本发明针对银杏淀粉生产低聚异麦芽糖研究领域的不足，一方面提出了用银杏淀粉制备低聚异麦芽糖的方法，另一方面提高了银杏淀粉的利用率和经济价值，减轻了粮食资源不足的压力。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物制品技术领域，特别涉及一种由银杏淀粉制得的低聚异麦芽糖及其制备方法和应用。

背景技术

银杏是我国特有的一种多用途经济树种，我国银杏栽培面积达到300万亩，年产白果已达3000多万公斤，干青叶6000万公斤。目前银杏产业链可分成苗木培育、园林绿化和产品加工三个部分，这其中产品加工在银杏产链中起着主导作用。在银杏产品加工中，银杏果营养丰富，含有黄酮、内酯等多种生物活性成分，具有极高的医疗保健价值，作为滋补和保健食品已有1000多年的历史。然而相比于银杏叶及其提取物的保健药用功能开发，银杏果的加工利用相对薄弱，大多以鲜食、初加工品为主。并且长期以来人们认为银杏有毒而不能生食，加上其具有特殊的苦味，并且银杏果精深加工技术水平低下，造成银杏果行情持续走低，银杏果身价一落千丈，产品深加工技术的落后、产品种类的数量少等直接导致了目前银杏增产不增收的现象，银杏产业也进入了一个发展相当缓慢的阶段。面对银杏果产量大开发却有限，营养丰富产品形式却单一的现状，如何拓展其精深加工利用途径是目前银杏产业要解决的问题。

目前市场上存在一些银杏果的加工产品，比如银杏晶、银杏果软包装产品、银杏开心果等初级加工产品，但是这些产品质量参差不齐，而且由于银杏果特殊的苦味，产品的风味和口感都不能满足消费者的需求，难以在市场大规模推广，消化银杏果的能力极为有限。现有技术和产品的开发多是整果开发未能针对银杏果的特色成分进行深入研发。银杏果入口香糯，与其淀粉含量高分不开，淀粉是银杏的主要营养成分，占胚乳干重的60％-70％，而其他成分如蛋白质占到10％-20％，油脂则为2％-4％，作为淀粉资源的木本来源，银杏果丰富的淀粉含量无疑是值得关注的，然而目前国内外对银杏果的主要成分淀粉的研发还处于银杏淀粉的结构、理化性质等基础内容的起步阶段，对银杏淀粉的精深加工应用还是空白状态。

益生元是指能够选择性地刺激特定肠道菌的生长、活性而有益于宿主健康的非消化性食物成分，其一直是国内外的研究热点，如近年来我国开展的“国家公众营养改善项目”已把益生元作为重点项目进行推广；我国对于低聚糖的研究开始于20世纪80年代，随着研究的进一步加深而开始工业化生产，与国外的低聚糖产品产量和种类还有很大的差距。低聚异麦芽糖是异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖及四糖以上的低聚糖的混合物，在低聚异麦芽糖的组成成分中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖，它是体现低聚异麦芽糖功能性的主要成分，其含量高低反映了产品质量的好坏，也影响产品的价格和应用前景。

目前低聚糖的制备方法主要有从天然的原料中提取、用酸水解或碱转化法生产、微生物酶水解生产、微生物酶的转移反应制造以及人工合成等方法，在上述方法中低聚糖的制备原料一般为淀粉或糖，比如现行的工业化生产低聚异麦芽糖就是以淀粉为原料采用全酶法工艺。目前，国内生产低聚异麦芽糖虽然已有一些研究。比如：公开号CN101608197的中国发明专利(专利申请号：201010136714.7)公开了以稻米为原料生产低聚异麦芽糖的方法，制备过程中首先同步实现糖化液化，再进行异构化。公开号CN11705095的中国发明专利(专利申请号：202010545680.0)提出用小麦酶法生产低聚异麦芽糖，制备过程中首先液化再同步进行糖化转苷。公开号CN103555789B的中国发明专利(专利申请号：201310473119.6)提出用芭蕉芋淀粉为原料制备低聚异麦芽糖的方法，制备过程首先是液化，再同步进行糖化和转苷。公开号CN110229855的中国发明专利(专利申请号：201910533029.9)提出用玉米淀粉为原料生产低聚异麦芽糖的方法，制备过程中首先是液化，再进行糖化，最后转苷。但是目前国内未见以银杏淀粉为原料采用全酶法生产低聚异麦芽糖的研究，且目前文献报道的异麦芽糖生产中，糖化步骤多数采用复合酶配比的方法，参与协同的淀粉酶有真菌α-淀粉酶、普鲁兰酶、β-淀粉酶、糖化酶中不少于三种酶以上的多种酶配比生产，酶用量大、成本高。尚未见到仅仅采用普鲁兰酶和β-淀粉酶两种酶进行糖化步骤的操作。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明提供了一种由银杏淀粉制得的低聚异麦芽糖及其制备方法和应用，本发明针对银杏淀粉生产低聚异麦芽糖研究领域的空白，一方面提出了用银杏淀粉制备低聚异麦芽糖的方法，另一方面实现了银杏果的利用，减轻了粮食资源不足的压力。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用银杏淀粉制备低聚异麦芽糖的方法，包括以下步骤：

(1)银杏淀粉的提取：由银杏种仁中提取银杏淀粉；

(2)调浆：将步骤(1)的银杏淀粉配制成浓度为15-30％的悬浮液，并调节pH至5.8-6.2，于95-100℃下糊化3-5min，得到糊化液；

(3)液化：向步骤(2)的糊化液中加入耐高温α-淀粉酶并于90℃下液化20-40min，得到液化液；

其中，耐高温α-淀粉酶的添加量为10-25U/g淀粉；

(4)糖化：调节pH至4.3-4.7，向步骤(3)的液化液中加入β-淀粉酶和普鲁兰酶并于60℃下糖化反应36-48h，得到含有低聚异麦芽糖糖液；

其中，β-淀粉酶添加量为3-5U/g淀粉，普鲁兰酶添加量为0.5-2U/g淀粉；糖化液的DE值为10-15；

(5)转苷：调节pH至4.8-5.2，向步骤(4)的低聚异麦芽糖糖液中加入α-葡萄糖转苷酶并于40℃下转苷反应36-48h，得到含有低聚异麦芽糖的转苷糖液，经离心后取上清液，得到低聚异麦芽糖混合液；

其中，α-葡萄糖转苷酶添加量为1-2U/g淀粉；

(6)发酵纯化：将步骤(5)的低聚异麦芽糖混合液采用酵母菌发酵纯化，得低聚异麦芽糖发酵液；

(7)后处理：将步骤(6)的低聚异麦芽糖发酵液经浓缩、干燥后得到低聚异麦芽糖。

优选的，所述步骤(1)中银杏淀粉的提取方法为：将银杏种仁去壳，去内果皮，捣碎，加入质量分数为1％的NaOH水溶液，浸泡2-3h后离心取沉淀，重复上述操作3-5次，合并沉淀并水洗至中性后，冷冻干燥得银杏淀粉；

其中，去壳去果皮的银杏种仁与NaOH水溶液的质量比为3-4:1。

优选的，所述步骤(2)中悬浮液的溶剂为pH＝6.0的PBS缓冲液。

优选的，所述步骤(5)中离心条件为：于8000-10000r/min转速下离心10-20min。

优选的，所述步骤(6)中低聚异麦芽糖混合液发酵纯化的温度为28-30℃，摇床转速为60-80r/min，发酵时间为24-36h；

其中，酵母菌接种液的浓度为3×10

优选的，所述步骤(7)中浓缩的方法为：于转速为50-80r/min、水浴温度为45-50℃条件下旋转蒸发。

优选的，所述步骤(7)中干燥的条件为：于真空度为10-20Pa条件下冻干36-48h。

本发明还保护了所述的方法制备得到的低聚异麦芽糖。

本发明还保护了所述的低聚异麦芽糖在制备保健食品中的应用。

本发明用银杏淀粉制备低聚异麦芽糖的方法的有益效果是：

1、采用银杏淀粉为原料生产低聚异麦芽糖，一方面减轻了粮食资源不足的压力，另一方面生产工艺减少了酶的品种和用量，节省了成本，也为银杏资源的利用、提高其经济效益开辟了新的途径。

2、本发明首次提出采用α-淀粉酶液化(淀粉糊化后，由于受α-淀粉酶的作用，迅速降解成分子量较小的能溶于水的糊精，原来浆糊状的淀粉溶胶变为溶液状态，黏度急速降低，流动性增大)、β-淀粉酶和普鲁兰酶糖化(淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化)、α-葡萄糖苷酶转苷(将糖液中已游离出的葡萄糖转移至另一个葡萄糖或麦芽糖分子的α-1，6位上，生成异麦芽糖或潘糖等具有分支结构的低聚糖类)、酵母发酵法纯化这一系列工艺流程，生产过程采用全酶法，既快速又环保，且比现有工艺减少了酶的使用种类，简化生产步骤，提高了生产效率为使用银杏淀粉生产低聚异麦芽糖提供了新的方法路线。

3、本发明以银杏淀粉为原料生产低聚异麦芽糖，纯化后的异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖和异麦芽四糖四种功能性糖的含量测定是在GB/T 20881-2017的方法基础上进行了一些调整，用双柱法进行检测；采用Waters2695高效液相色谱仪配备Waters2414示差检测器，检测采用银杏淀粉制备的低聚异麦芽糖中各糖组分含量。色谱条件为：色谱柱Ⅰ：Sugarpak1(6.5mmid×300mm)；柱温：85℃；流动相：纯水：进样量：10μL:流速：0.4ml/min。色谱柱Ⅱ：Hypersil APS2(4.6mmid×250mm)；柱温：30℃；流动相：乙腈/超纯水＝70/30(v/v)；进样量：10μL；流速：1.0ml/min。以标准样品保留时间定性，以峰面积归一化定量。检测后计算四种糖含量总和高达54％，其结果见表1，该四种糖的总和超过目前市售的低聚异麦芽糖，提高了银杏淀粉的利用率和经济价值。

4、本发明还分析比较了纯化前的银杏低聚异麦芽糖(G-IMO)、本申请方法制备的纯化后的银杏低聚异麦芽糖(G-IMO-P)、市售的玉米低聚异麦芽糖(C-IMO)(型号IMO-900购自上海麦克林生化试剂有限公司)以及葡萄糖分别对植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)(购自北京北纳创联生物技术研究院(BNCC)，编号194165)和青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)(购自上海保藏生物技术中心，编号ATCC15703)的增殖效果；其结果可以看出，植物乳杆菌在以银杏低聚异麦芽糖G-IMO、G-IMO-P和玉米低聚异麦芽糖C-IMO为碳源的生长曲线明显高于在以葡萄糖为碳源的的基础培养基上的生长曲线，且G-IMO-P对植物乳杆菌的增殖作用最强，G-IMO次之，C-IMO最弱。对青春双歧杆菌的生长曲线的影响也表现出同样的结果，G-IMO-P对青春双歧杆菌的增殖作用最强，G-IMO次之，C-IMO最弱接近于葡萄糖。表明本发明制得的银杏低聚异麦芽糖其益生效果较好，且明显优于市售的产品。

附图说明

图1为本发明的银杏淀粉制备低聚异麦芽糖工艺流程图；

图2本发明生产的银杏低聚异麦芽糖发酵法纯化前后的色谱图，其中，上图为纯化前的色谱图，下图为纯化后的色谱图；

图3为不同来源低聚异麦芽糖对植物乳杆菌生长曲线的影响。

图4为不同低聚异麦芽糖对青春双歧杆菌生长曲线的影响。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例中的原料及设备说明如下：

本申请所用的银杏品种均为大佛指银杏，大佛指银杏品种原产地为江苏吴县洞庭东山镇。

α-淀粉、β-淀粉酶、普鲁兰酶和α-葡萄糖转苷酶均为上海源叶生物有限公司产品。

DD5M离心机购自长沙湘仪检测设备有限公司，电动搅拌机购自上海尚普仪器设备有限公司，Waters 1525高效液相色谱仪购自美国沃特世科技有限公司。

实施例1

一种用银杏淀粉制备低聚异麦芽糖的方法，包括如下步骤：

(1)银杏淀粉的制备：银杏种仁去壳，去内果皮，捣碎，按质量比3：1加入质量分数为1％的NaOH水溶液，浸泡2h后离心取沉淀，按上述方法重复3次；合并沉淀并水洗至中性后得到湿淀粉，采用冷冻干燥将湿淀粉干燥，密封，常温保存；

(2)调浆：称取20g以步骤(1)制得的银杏淀粉，加入至100mL、pH＝6.0的PBS缓冲液中，配制成浓度为20％的银杏淀粉悬浮液，调节pH至5.8，调节水浴锅温度为95℃，放入搅拌器搅拌5min糊化，得到糊化液；

(3)液化：向步骤(2)制得的糊化液中按10U/g淀粉的标准加入耐高温α-淀粉酶，电动搅拌器不断搅拌，恒温水浴90℃下液化30min，得DE值在10的液化液；

(4)糖化：向步骤(3)制得的液化液中按3U/g淀粉加入β-淀粉酶、按2U/g淀粉加入普鲁兰酶，电动搅拌器不断搅拌，pH控制在4.5，恒温水浴60℃下糖化反应48h，制得含有低聚异麦芽糖糖液；

(5)转苷：向步骤(4)制得的含有低聚异麦芽糖糖液中按1.5U/g淀粉加入α-葡萄糖转苷酶，电动搅拌器不断搅拌，pH控制在4.8，恒温水浴40℃下进行转苷反应48h，制得含有低聚异麦芽糖的转苷糖液；

(6)将步骤(5)所得含有低聚异麦芽糖的转苷糖液经8000r/min离心20min，去除杂质，收集上清液，得到低聚异麦芽糖混合液；

(7)发酵纯化：将步骤(6)所得低聚异麦芽糖混合液经酵母菌发酵纯化，酵母菌添加量为1％，发酵温度为30℃，摇床转速为80r/min，发酵时间为24h，去除一部分含量较高的葡萄糖和麦芽糖，得低聚异麦芽糖发酵液；

(8)后处理：将步骤(7)所得低聚异麦芽糖发酵液进行旋转蒸发浓缩，于真空度为10Pa，冻干时间为36h冷冻干燥后得到低聚异麦芽糖。

实施例2

一种用银杏淀粉制备低聚异麦芽糖的方法，包括如下步骤：

(1)银杏淀粉的制备：银杏种仁去壳，去内果皮，捣碎，按质量比3.5：1加入质量分数为1％的NaOH水溶液，浸泡2.5h后离心取沉淀；按上述方法重复4次；合并沉淀并水洗至中性后得到湿淀粉，采用冷冻干燥将湿淀粉干燥，密封，常温保存；

(2)调浆：称取以步骤(1)制得的25g银杏淀粉，加入至100mL、pH＝6.0的PBS缓冲液中，配制成浓度为25％的银杏淀粉悬浮液，调节pH至6.0，调节水浴锅温度为98℃，放入搅拌器搅拌4min糊化，得到糊化液；

(3)液化：向步骤(2)制得的糊化液中按20U/g淀粉的标准加入耐高温α-淀粉酶，以电动搅拌器不断搅拌，恒温水浴90℃下液化20min，得DE值在13的液化液；

(4)糖化：向步骤(3)制得的液化液中按4U/g淀粉加入β-淀粉酶、按1U/g淀粉加入普鲁兰酶，电动搅拌器不断搅拌，pH控制在4.3，恒温水浴60℃下糖化反应36h，制得含有低聚异麦芽糖糖液；

(5)转苷：向步骤(4)制得的含有低聚异麦芽糖糖液中按1U/g淀粉加入α-葡萄糖转苷酶，电动搅拌器不断搅拌，pH控制在5.0，恒温水浴40℃下进行转苷反应40h，制得含有低聚异麦芽糖的转苷糖液；

(6)将步骤(5)所得含有低聚异麦芽糖的转苷糖液经9000r/min离心15min，去除杂质，收集上清液，得到低聚异麦芽糖混合液；

(7)发酵纯化：将步骤(6)所得低聚异麦芽糖混合液经酵母菌发酵纯化，酵母菌添加量为1％，发酵温度为29℃，摇床转速为60r/min，发酵时间为36h，去除一部分含量较高的葡萄糖和麦芽糖，得低聚异麦芽糖发酵液；

(8)后处理：将步骤(7)所得低聚异麦芽糖发酵液进行经旋转蒸发浓缩，于真空度为20Pa，冻干时间为40h冷冻干燥后得到低聚异麦芽糖。

实施例3

一种用银杏淀粉制备低聚异麦芽糖的方法，包括如下步骤：

(1)银杏淀粉的制备：银杏种仁去壳，去内果皮，捣碎，按质量比4：1加入质量分数为1％的NaOH水溶液，浸泡3h后离心取沉淀；按上述方法重复5次；合并沉淀并水洗至中性后得到湿淀粉，采用冷冻干燥将湿淀粉干燥，密封，常温保存；

(2)调浆：称取以步骤(1)制得的30g银杏淀粉，加入100mL、pH＝6.0的PBS缓冲液，配制成浓度为30％的银杏淀粉悬浮液，调节pH至6.2，调节水浴锅温度为100℃，放入搅拌器搅拌3min糊化，得到糊化液；

(3)液化：向步骤(2)制得的糊化液中按25U/g淀粉的标准加入耐高温α-淀粉酶，以电动搅拌器不断搅拌，恒温水浴90℃下液化40min，得DE值在15的液化液；

(4)糖化：向步骤(3)制得的液化液中按5U/g淀粉加入β-淀粉酶、按0.5U/g淀粉加入普鲁兰酶，电动搅拌器不断搅拌，pH控制在4.7，恒温水浴60℃下糖化反应40h，制得含有低聚异麦芽糖糖液；

(5)转苷：向步骤(4)制得的含有低聚异麦芽糖糖液中按2U/g淀粉加入α-葡萄糖转苷酶，电动搅拌器不断搅拌，pH控制在5.2，恒温水浴40℃下进行转苷反应36h，制得含有低聚异麦芽糖的转苷糖液；

(6)将步骤(5)所得含有低聚异麦芽糖的转苷糖液经10000r/min离心10min，去除杂质，收集上清液，得到低聚异麦芽糖混合液；

(7)发酵纯化：将步骤(6)所得低聚异麦芽糖混合液经酵母菌发酵纯化，酵母菌添加量为0.5％，发酵温度为28℃，摇床转速为70r/min，发酵时间为30h，去除一部分含量较高的葡萄糖和麦芽糖，得低聚异麦芽糖发酵液；

(8)后处理：将步骤(7)所得低聚异麦芽糖发酵液进行经旋转蒸发浓缩，于真空度为15Pa，冻干时间为48h冷冻干燥后得到低聚异麦芽糖。

本发明还分析比较了发酵纯化前、发酵纯化后的银杏低聚异麦芽糖的促植物乳杆菌和青春双歧杆菌增殖效果，并与市售的玉米低聚异麦芽糖的效果对比，分别以质量分数为0.5％、1％、2％、3％、4％的纯化前的银杏低聚异麦芽糖(G-IMO)、本申请方法制备的纯化后的银杏低聚异麦芽糖(G-IMO-P)和C-IMO(市售的玉米低聚异麦芽糖，上海麦克林生化试剂有限公司IMO-900)为培养基中的碳源，考察其对植物乳杆菌和青春双杆菌的增殖效果。

表1本发明生产的银杏低聚异麦芽糖发酵法纯化前后的低聚异麦芽的含量

表1为图2各个峰的值，由表1和图2的结果表明：低聚异麦芽糖是异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖及四糖以上的低聚糖的混合物，在低聚异麦芽糖的组成成分中异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖，它是体现低聚异麦芽糖功能性的主要成分。由表1可以看出，纯化前属于低聚异麦芽的含量之和只有30.12％，而纯化后，非低聚异麦芽范畴的葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖明显降低，低聚异麦芽糖含量的总和达到54％。纯化显著提升了低聚异麦芽的含量。

由图3能够看出，植物乳杆菌在以银杏低聚异麦芽糖G-IMO、G-IMO-P和玉米低聚异麦芽糖C-IMO为碳源的生长曲线明显高于在以葡萄糖为碳源的基础培养基上的生长曲线，表明银杏低聚异麦芽糖G-IMO、G-IMO-P和玉米低聚异麦芽糖C-IMO对植物乳杆菌有增殖作用；从总体的植物乳杆菌的生长情况来看，本申请制备的银杏低聚异麦芽糖G-IMO-P对植物乳杆菌的增殖作用最强，纯化前的银杏低聚异麦芽糖G-IMO次之，而市售的玉米低聚异麦芽糖C-IMO最弱；也说明了本发明制得的银杏低聚异麦芽糖具有更优良的益生功能，对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(购自北京北纳创联生物技术研究院(BNCC)，编号194165)的培育效果好。

图4可以看出，青春双歧杆菌在以银杏低聚异麦芽糖G-IMO-P、G-IMO为碳源的生长曲线高于在以玉米低聚异麦芽糖C-IMO和葡萄糖为碳源的基础培养基上的生长曲线，表明玉米低聚异麦芽糖C-IMO和银杏低聚异麦芽糖G-IMO、G-IMO-P对青春双歧杆菌有增殖作用。从总体的青春双歧杆菌的生长情况来看，G-IMO-P对青春双歧杆菌的增殖作用最强，G-IMO次之，C-IMO最弱接近于葡萄糖。该结果与对植物乳杆菌的结果相互吻合，再次验证了本发明制得的银杏低聚异麦芽糖具有更优良的益生功能。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。