一种可提高产量的小胶质细胞原代培养方法

摘要

本发明涉及一种可提高产量的小胶质细胞原代培养方法,属于原代细胞培养技术领域。本发明细胞培养方法为：取动物，酒精消毒后取脑组织中的大脑皮层，碾碎并置于胰蛋白酶酶解，离心得小胶质单个细胞。将小胶质单个细胞重悬在DF12小胶质细胞培养基中，孵育培养，换液；重复该操作7‑14天。将小胶质细胞在37℃摇床，200rpm摇晃1‑3h，最后离心获得原代小胶质细胞。原代小胶质细胞培养过程中，添加25‑100ng/mL M‑CSF溶液，细胞孵育培养24h‑72h，得到小胶质细胞。本发明能够显著提高小胶质细胞产率，并且保留着小胶质细胞吞噬等方面功能，可用于研究细胞吞噬，炎症等方面功能。

说明书

技术领域

本发明属于原代细胞培养技术领域，尤其是指一种可提高产量的小胶质细胞原代培养方法。

背景技术

小胶质细胞原代培养方法在不同动物中都获得了成功。现有原代培养方法都是基于细胞贴壁性来分离原代小胶质细胞。通过将动物脑组织剪碎，酶解，培养，振荡后收集小胶质细胞。

小胶质细胞原代培养方法获得的小胶质细胞异常稀少，并且增殖缓慢，这极大地限制着相关的应用。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中小胶质细胞原代培养细胞稀少，增殖缓慢等问题。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种可提高产量的小胶质细胞原代培养方法。

一种可提高产量的小胶质细胞原代培养方法，其特征在于，包括以下步骤：小胶质细胞原代培养中加入M-CSF。

在本发明的一个实施例中，小胶质细胞原代培养方法中还包括小胶质单个细胞的获取，步骤为：将动物脑组织中的大脑皮层，碾碎并置于胰蛋白酶37℃酶解，离心得小胶质单个细胞。

在本发明的一个实施例中，所述动物选取出生三天的SD大鼠、C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠中的任意一种。

在本发明的一个实施例中，小胶质细胞原代培养方法中还包括如下步骤：将小胶质单个细胞重悬在DF12小胶质细胞培养基中，孵育培养24h，换液；重复该操作7-14天。

在本发明的一个实施例中，所述DF12小胶质细胞培养基含10％灭活FBS，100U/mL青霉素与100μg/mL链霉素。

在本发明的一个实施例中，小胶质细胞原代培养方法中还包括如下步骤：将单个细胞孵育培养7-14天后将小胶质细胞在摇床，200rpm摇晃1-3h，最后离心获得原代小胶质细胞。

在本发明的一个实施例中，小胶质细胞原代培养方法中还包括如下步骤：在原代小胶质细胞培养过程中，添加25-100ng/mL M-CSF溶液，细胞孵育培养24h-72h，得到小胶质细胞。

在本发明的一个实施例中，小胶质细胞原代培养方法中通过细胞换液的方式去掉M-CSF。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明通过通过添加小分子化合物M-CSF提高小胶质细胞产量。M-CSF是巨噬细胞集落刺激因子，能够诱导造血干细胞分化成巨噬细胞。同时M-CSF能够结合小胶质细胞表面CSF1R，促进小胶质细胞存活和活化，进而提高小胶质细胞产量。本发明相比现有技术，能够显著提高小胶质细胞产率，并且保留着小胶质细胞吞噬等方面功能，可用于研究细胞吞噬，炎症等方面功能，在医药等领域具有较广泛的应用前景。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明实施例1中得到的小胶质细胞原代培养荧光图。

图2是本发明实施例1添加M-CSF提高小胶质细胞产量细胞荧光图和统计柱状图。

图3是本发明实施例2中小胶质细胞吞噬酵母聚糖情况荧光图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

小胶质细胞原代培养方法：

1.出生后三天C57BL/6小鼠，75％酒精消毒后，剥离脑组织，获得大脑皮层，经过碾碎、0.25％胰蛋白酶(购于HyClone)37℃酶解20分钟、2000rpm离心5分钟获得单个细胞。

2.DF12(Gibco)小胶质细胞培养基(含10％灭活FBS(Gibco)，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Gibco))重悬细胞，培养一天后，换液。继续培养2周。

3.37℃摇床，200rpm摇晃2h，2000rpm，离心5分钟获得原代小胶质细胞。

4.添加50ng/mL小鼠M-CSF(novoprotein)培养48小时，获得大量小胶质细胞；同时设置对照组，将50ng/mL小鼠M-CSF(novoprotein)等量替换为DMSO。

5.细胞换液，去掉M-CSF，进行后续实验。

实验结果：见图1，图中，IBAI抗体标记小胶质细胞，Hoechst用来标记细胞核。由图中信息可知，本实施例中小胶质细胞培养成功。

细胞增殖结果见图2，图中使用细胞增殖标记物Ki-67抗体(CST)标记小胶质细胞，Ki-67(CST)用来标记增殖细胞，Hoechst(碧云天)用来标记细胞核。由图2可以看出，本实施例培养的原代小胶质细胞数目(cell number)和增殖潜力(Ki-67positive cell number)显著高于常规的原代小胶质细胞培养方法(DMSO对照组)。

实施例2

验证实施例1中得到的小胶质细胞是否具备吞噬功能

将实施例1中得到的原代小胶质细胞去除M-CSF后，(通过添加荧光素标记的酵母聚糖(pHrodo-labeled zymosan，ThermoFisher Scientific)研究小胶质细胞吞噬功能。)

具体步骤是：1.原代小胶质细胞接种于24孔板中，使用50ng/mL小鼠M-CSF(novoprotein)培养48小时，得到足够原代小胶质细胞。2.使用新鲜DF12培养基洗涤原代小胶质细胞，去除其中残留的M-CSF。3.添加使用PBS溶解的0.1μg/mL荧光素标记的酵母聚糖，处理24小时。4.荧光显微镜观察原代小胶质细胞吞噬效果。

实验结果见图3：图中使用0.1μg/ml荧光素标记的酵母聚糖(pHrodo-labeledzymosan，ThermoFisher Scientific)处理小胶质细胞24小时，荧光显微镜观察细胞吞噬功能。

实验结论：本发明培养的原代小胶质细胞能够正常吞噬酵母聚糖，产量提高后的小胶质细胞保留着小胶质细胞具有的吞噬功能。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。