一种酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白及其制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组鸡硫氧还蛋白及其制备方法，包括以下步骤：(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT‑MFα‑rChTRX‑His的构建；(2)pYES2/CT‑MFα‑rChTRX‑His工程菌的制备、转化；(3)含有pYES2/CT‑MFα‑rChTRX‑His的酿酒酵母工程菌的摇瓶培养、诱导表达纯化及检定。本发明制备工程菌中ChTRX基因具有酿酒酵母偏爱型特点，并含有酿酒酵母信号肽，可使ChTRX分泌表达，并且大大提高了表达产物的产量，相比大肠杆菌表达系统和其他有益菌分泌表达系统而言，获取工艺简单，成本更低。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白的制备方法。

背景技术

硫氧还蛋白(Thioredoxin,TRX)是一类高度保守的低分子量蛋白质，在细胞内可溶性、对热稳定、具有氧化还原活性的酸性小分子蛋白质，分子量约为12kDa。TRX广泛分布于植物、细菌、酵母和动物中，它与硫氧还蛋白还原酶(TR)、还原型烟酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)三者共同组成硫氧还蛋白系统(TRX系统)，是一个有效的蛋白还原系统。TRX在其保守的活化区域内含有二硫巯基和二硫键，其氧化还原活性使硫氧还蛋白具有维持体内稳定的氧化还原状态、调节细胞生长、抑制凋亡、调节基因转录影响蛋白在动物体内的含量、免疫调节等功能。

根据相关文献报道，鸡硫氧还蛋白的获取方式主要有动物内脏提取纯化、动物体内诱导和原核诱导表达的方式。动物内脏提取法依赖于动物组织的供给，不能规模化生产。如果采用原核表达和真核表达，该系统存在容易形成包涵体、获得的蛋白生物学活性较低等缺陷；而采用毕赤酵母表达则需用甲醇诱导，表达产物不能直接用作于养殖业，需要提纯后才能利用，生产成本高，因此选择酿酒酵母真核表达系统对鸡硫氧还蛋白进行外源表达。

发明内容

为克服背景技术中的问题，本发明提供了一种制备的重组鸡硫氧还蛋白的方法，包含以下步骤：

(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-MFα-rChTRX-His的构建，具体包括：

鸡硫氧还蛋白基因的人工优化，以获得质粒pMD19-T-rChTRX-His；

对质粒pYES2/CT-MFα及以上胶回收的rChTRX-His片段进行双酶切，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-rChTRX-His；

(2)pYES2/CT-MFα-rChTRX-His工程菌的制备、转化，具体包括：

酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；

将步骤(1)获得的pYES2/CT-MFα-rChTRX-His以及pYES2/CT-MFα质粒分别转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养基的培养及PCR扩增、筛选，获得阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rChTRX-His)；

(3)含有pYES2/CT-MFα-rChTRX-His的酿酒酵母工程菌的摇瓶培养、诱导表达纯化及检定，具体包括：

将步骤(2)获得的阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rChTRX-His)，通过培养、离心、收集上清液经过柱层析，得纯化后的上清蛋白液，经SDS-PAGE电泳以及鼠抗His单克隆抗体经Westernblot鉴定，均可观察到特异性条带，即为本发明获得的酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白。

进一步的，所述步骤(1)中，鸡硫氧还蛋白基因的人工优化，以获得质粒pMD19-T-rChTRX-His，具体步骤为：

根据鸡硫氧还蛋白氨基酸序列以及酿酒酵母对密码子的偏爱性，人工设计了酿酒酵母偏爱型重组鸡硫氧还蛋白基因，重组鸡硫氧还蛋白核苷酸序列为序列表1所示，重组鸡硫氧还蛋白氨基酸序列为序列表2所示；

将重组鸡硫氧还蛋白基因以ChTRX-His的顺序插入pMD19-T Simple Ve ctor的HindⅢ酶切位点和XbaⅠ酶切位点之间，其5’端HindⅢ酶切位点，3’端接XbaⅠ酶切位点，由此得到质粒pMD19-T-rChTRX-His。

进一步的，所述步骤(1)中，对质粒pYES2/CT-MFα及以上胶回收的r ChTRX-His片段进行双酶切，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-rChTRX-His，具体步骤为：

根据rChTRX-His基因的序列设计合成正向引物rChTRX-His F和反向引物rChTRX-His R，通过PCR扩增pMD19-T-rChTRX-His质粒中rChTRX-His基因，按照凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收；

用QuickCut Not I和QuickCut Xba I分别对购买的质粒pYES2/CT-MFα及以上胶回收的rChTRX-His片段进行双酶切，并分别切胶回收rChTRX-His基因片段和pYES2/CT-MFα片段，然后用T4DNA连接酶进行连接得重组质粒，将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5ɑ)，在含氨苄霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR(正向引物：rChTRX-His F；反向引物：rChTRX-His R)及双酶切(QuickCut Not I和QuickCut Xba I)鉴定，选取阳性克隆pYES2/C T-MFα-rChTRX-His。

进一步的，所述步骤(2)中，酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制，具体方法为：

YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g(制备固体培养基时另加20g琼脂粉)，溶于800ml水中，定容到1L，121℃高压灭菌20min；

SC-U液体培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水900ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；

SC-U平板培养基，6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，20g琼脂粉，加去离子水900ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；

SC-U诱导培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水800ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液和100ml过滤除菌的20％半乳糖溶液，混匀，4℃保存备用。

进一步的，所述步骤(2)中，获得阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rChTRX-His)的具体步骤为：

将10μl pYES2/CT-MFα-rChTRX-His质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中，冰浴5min，将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，PIC选项，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击，同时迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U平板培养基，30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落，单克隆菌落中含有pYES2/CT-MFα-rChTRX-His的酿酒酵母转化子，取菌落制成菌液进行PCR扩增，筛选得INVSc1/pYES2/CT-MFα-rChTRX-His阳性克隆子。

进一步的，所述步骤(3)中，通过培养、离心、收集上清液经过柱层析，得纯化后的上清蛋白液，具体步骤为：

挑取阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rChTRX-His)于30ml液体SC-U液体培养基，30℃震荡培养过夜，并测定OD

4℃、1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的SC-U诱导培养基悬浮菌体，重新接种100ml的SC-U诱导培养基中，置于30℃震荡培养96h，4℃、15000g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清经0.22μm滤膜过滤；

使用Chelating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni

设置梯度咪唑浓度的Elution Buffer(pH 8.0PBS containing 100～300mMImidazole)洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即为本发明获得的酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白。

进一步的，所述SC-U液体培养基和SC-U诱导培养基中，分别添加有2％棉籽糖和2％半乳糖。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明制备工程菌中鸡TRX基因具有酿酒酵母偏爱型特点，并含有酿酒酵母信号肽，可使鸡硫氧还蛋白分泌表达，并且大大提高了表达产物的产量，相比大肠杆菌表达系统和其他有益菌分泌表达系统而言，获取工艺简单，成本更低。

2.目前尚未有通过酿酒酵母表达系统获得重组鸡硫氧还蛋白的研究报道，因此该制备方法具有十分重要的应用价值。

附图说明：

图1质粒pYES2/CT-MFα图谱；

序列表说明：

序列表1本发明重组鸡硫氧还蛋白的核苷酸序列

序列表2本发明重组鸡硫氧还蛋白的氨基酸序列

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-MFα-rChTRX-His的构建

(1)鸡硫氧还蛋白基因的人工优化

根据鸡硫氧还蛋白氨基酸序列以及酿酒酵母对密码子的偏爱性，人工设计了酿酒酵母偏爱型鸡硫氧还蛋白基因，重组鸡硫氧还蛋白核苷酸序列为序列表1所示，重组鸡硫氧还蛋白氨基酸序列为序列表2所示

序列表1中，

将以上基因序列以ChTRX-His的顺序插入pMD19-T Simple Vector的Hi ndⅢ酶切位点和XbaⅠ酶切位点之间，其5’端接HindⅢ酶切位点，3’端接X baⅠ酶切位点，由此得到质粒pMD19-T-rChTRX-His。

(2)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-MFα-rChTRX-His的构建

根据rChTRX-His基因的序列设计合成正向引物rChTRX-His F和反向引物rChTRX-His R，通过PCR扩增pMD19-T-rChTRX-His质粒中rChTRX-His基因。

反应体系为：

PCR反应程序：95℃预变性5rain；95℃30s，58℃25s，72℃30s，35个循环；72℃延伸5min。PCR扩增产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。

用QuickCut Not I和QuickCut Xba I分别对购买的质粒pYES2/CT-MFα(质粒图谱见图1)及以上胶回收的rChTRX-His片段进行双酶切。

酶切反应体系为：

在37℃金属浴中酶切反应3h，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并分别切胶回收rChTRX-His基因片段和pYES2/CT-MFα片段，然后用T4 DNA连接酶进行连接。

连接反应体系为：

反应条件为16℃、14h，按常规方法(氯化钙法)将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5ɑ)，在含氨苄霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR(正向引物：rChTRX-His F；反向引物：rChTRX-His R)及双酶切(Quick Cut Not I和QuickCut Xba I)鉴定，选取阳性克隆pYES2/CT-MFα-rChTRX-His。

实施例2：pYES2/CT-MFα-rChTRX-His工程菌的制备、转化

(1)酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制

YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g(制备固体培养基时另加20g琼脂粉)，溶于800ml水中，定容到1L，121℃高压灭菌20min；

SC-U液体培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水900ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；

SC-U平板培养基，6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，20g琼脂粉，加去离子水900ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；

SC-U诱导培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水800ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液和100ml过滤除菌的20％半乳糖溶液，混匀，4℃保存备用。

(2)pYES2/CT-MFα-rChTRX-His转化酿酒酵母

采用电转化法将pYES2/CT-MFα-rChTRX-His以及pYES2/CT-MFα质粒分别转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞。将10μl pYES2/CT-MFα-rChTRX-His质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中。冰浴5min，擦干电击杯外壁。将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，PIC选项，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击。迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U板。30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆。在SC-U选择培养基(含氨苄)生长的为含有pYES2/CT-MFα-rChTRX-His及pYES2/CT-MFα质粒的酿酒酵母转化子，菌液PCR(正向引物：rChTRX-His F；反向引物：rChTRX-HisR)筛选INVSc1/pYES2/CT-MFα-rChTRX-His阳性克隆子。

实施例3：含有pYES2/CT-MFα-rChTRX-His的酿酒酵母工程菌的摇瓶培养、诱导表达纯化及检定

分别挑取阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-MFα-rChTRX-His)以及INVSc1(pYES2/CT-MFα)于30ml液体SC-U选择培养基(含2％棉籽糖和氨苄)，30℃震荡培养过夜，测定OD

使用GE Healthcare公司Chelating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni

综上，本发明采用基因工程技术表达重组鸡硫氧还蛋白，最终获得了显著的效果。本发明所涉及的表达重组鸡硫氧还蛋白的制备，技术简单，成本低，对养殖业具有实际应用价值，为养殖业饲料添加剂的开发提供了新思路可行性强，极大地提高了工作效率。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司

<120> 一种酿酒酵母表达重组鸡硫氧还蛋白及其制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgaaga gcgtgggcaa tctggctgat tttgaggcag aactgaaagc tgctggtgag 60

aagcttgtag tagttgattt ctctgccaca tggtgtggac catgtaaaat gatcaagcca 120

tttttccata gtctgtgtga caagtttggt gatgtggtgt tcattgaaat tgatgtggat 180

gatgcccaag atgttgctac acactgtgat gtgaagtgca tgccaacatt ccagttctac 240

aagaacggaa agaaggtgca ggaattctct ggggccaata aagagaagct ggaagagacc 300

attaaaagtc tagtctaa 318

<210> 2

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Val Lys Ser Val Gly Asn Leu Ala Asp Phe Glu Ala Glu Leu Lys

1 5 10 15

Ala Ala Gly Glu Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Cys Asp Lys

35 40 45

Phe Gly Asp Val Val Phe Ile Glu Ile Asp Val Asp Asp Ala Gln Asp

50 55 60

Val Ala Thr His Cys Asp Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Tyr

65 70 75 80

Lys Asn Gly Lys Lys Val Gln Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys

85 90 95

Leu Glu Glu Thr Ile Lys Ser Leu Val

100 105