一种利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法

摘要

本发明公开了一种利用酚‑氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法，其具体过程为：采用涡旋震荡10s的混合方式将样品与混合试剂混合均匀，其中混合试剂为体积比25:24:1的苯酚、氯仿与异戊醇的混合溶液，再利用低温冷冻离心机在12000rpm、4℃的条件下离心2min，最终提取得到黄河鲤基因组DNA。本发明改进了传统酚‑氯仿提取方法，大大缩短了实验用时，提高了实验效率。

说明书

技术领域

本发明属于黄河鲤基因组DNA提取方法技术领域，具体涉及一种利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法。

背景技术

黄河鲤（

血液是提取基因组DNA常用的材料，但抽血过多会对实验用鱼的存活及生长造成很大影响，且操作较为复杂，该方法不太适用于大量制备样品。梁利群等认为由于鱼类鳍条中上皮细胞、骨细胞等组织的存在，所含基因组DNA足够保证检测外源基因的需要。剪取鱼类鳍条与抽血、取肝脏或肌肉组织的方法相比操作更为简便，同时可以避免损伤和杀害样本。

酚-氯仿法是提取基因组DNA最经典的方法之一，该方法成本较低，提取效率相对较高，但操作步骤复杂，所用试剂较多且用时较长。刘臻等运用试剂盒法和酚-氯仿法提取鲫鱼基因组 DNA ，并对两种方法的实验结果进行了对比。马洪雨等用改进后的酚-氯仿法所提取的三种鱼类肌肉组织基因组DNA的质量显著高于传统酚-氯仿法。范慧慧等通过改进后的酚-氯仿法同样能够获得高质量的香鱼肌肉组织基因组DNA。综上，改进酚-氯仿法的部分步骤从而提高鱼类基因组DNA质量的研究已有很多，但专门针对缩短主要提取步骤的时间来提高实验效率的研究报道在鱼类基因组DNA领域还未看到，而在临床医学领域较为常见。在常规凝血实验中，Lippi Giuseppe等人为减少制备血液标本的样品处理时间，设计实验建立了一个最小合适的离心时间。根据他们的实验，在1500xg 5-10min离心时间最适合于收集常规凝血试验的初级管。Denis Monneret等人和Richard Prusa为提高医院实验室周转效率，分别就离心时间、收集时间等作了研究比较。崔明等探讨了缩短离心时间对临床常用心肌损伤标志物检测结果的影响，结果表明缩短离心时间不影响检测结果，同时可以缩短标本周转时间。本实验拟对传统酚-氯仿法部分步骤进行改进，以期在不影响实验效果的前提下尽量提高实验效率。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法，该方法优化了利用酚-氯仿法提取鲤基因组DNA的时间条件，提高了实验效率，为鲤DNA分子生物学研究提供了基础和前提。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法，其特征在于具体过程为：采用涡旋震荡10s的混合方式将样品与混合试剂混合均匀，其中混合试剂为体积比25:24:1的苯酚、氯仿与异戊醇的混合溶液，再利用低温冷冻离心机在12000rpm、4℃的条件下离心2min，最终提取得到黄河鲤基因组DNA。

本发明所述的利用酚-氯仿法快速提取黄河鲤基因组DNA的方法，其特征在于具体步骤为：

步骤S1：用灭菌后的剪刀剪取黄河鲤新鲜鳍条组织，剪碎后置于灭菌的EP管内备用；

步骤S2：在EP管内加入组织提取液和蛋白酶K，其中组织提取液的成分为：Tris-Cl10mmol/L、EDTA 100mmol/L、NaCl 100mmol/L和SDS 0.5wt%，盖上瓶盖后颠倒混匀，再放入干式恒温器中设置温度为55℃消化过夜，直至消化澄清；

步骤S3：取出EP管将样品冷却至室温，加入混合试剂，再将EP管置于涡旋震荡器上以1500r/min的转速震荡10s充分混合均匀，然后利用低温冷冻离心机在12000rpm、4℃的条件下离心2min；

步骤S4：在EP管中加入两倍于上清液体积的提前预冷的无水乙醇，上下颠倒使得乙醇和上清液完全混合均匀，然后利用低温冷冻离心机在12000rpm、4℃的条件下离心5min；

步骤S5：弃掉上清液后加入提前预冷的体积分数为70%的乙醇进行洗涤，再利用低温冷冻离心机在12000rpm、4℃的条件下离心2min将乙醇弃掉或者用移液管将乙醇吸出；

步骤S6：开盖待乙醇完全挥发后加入灭菌的超纯水溶解过夜，并于-20℃保存备用。

本发明通过对传统酚-氯仿法提取基因组DNA的部分步骤进行改进，对不同条件下各组提取的结果进行了紫外分光光度和琼脂糖凝胶电泳两种方法的鉴定，最终筛选出高效率利用酚-氯仿法提取鲤基因组DNA的方法，即溶液混匀方式由手动摇晃10min改为涡旋震荡10s后，在低温冷冻离心机中以12000rpm、4℃的条件离心2min得到鲤基因组DNA提取物。因此，本发明改进了传统酚-氯仿提取方法，大大缩短了实验用时，提高了实验效率。

附图说明

图1是不同混匀方式凝胶电泳图，对照组表示手动摇晃10min，实验组表示涡旋振荡10s；A、B、C、D表示4个不同样本，每组均有4个样本；M表示DL2000 DNA Marker。

图2是不同抽提离心时间凝胶电泳图，第1-5组分别表示抽提离心时间为2min、4min、6min、8min、10min；a、b、c、d表示四个样本，每组均有四个样本；M表示DL2000 DNAMarker。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例

为优化酚-氯仿法提取鲤基因组DNA的时间条件，本实验根据以上技术原理，拟通过对传统酚-氯仿法提取基因组DNA的部分步骤进行改进，对不同条件下各组提取的结果进行了紫外分光光度和琼脂糖凝胶电泳两种方法的鉴定，以期缩短酚-氯仿法提取鲤基因组DNA的实验用时，提高实验效率。

1、实验试剂、仪器和材料

实验试剂

组织提取液（Tris-Cl 10mmol/L、EDTA 100mmol/L、NaCl 100mmol/L和SDS0.5wt%；实验室配置）、蛋白酶K（10mg/mL）、苯酚：氯仿：异戊醇的混合试剂（体积比25:24:1；北京索莱宝科技有限公司）、无水乙醇（滁州市恒昌化工有限公司）、体积分数70%乙醇、琼脂糖（Biowest Agarose）、Loading Buffer（Takara公司）、DL2000 DNA Marker（Takara公司）、1×TAE缓冲液（实验室配置）、双蒸水、超纯水。

实验仪器

酚-氯仿法提取鲤基因组DNA时间条件的优化实验：恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司，XMTD-6000）、干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司，MK2000-2E）、低温冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司，Allegra X-30R）、电泳仪（北京市六一仪器厂，DYY-6C）、超微量分光光度计（美国Thermo公司，Nano Drop-2000）、凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司，Geldoc XR+）、涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，QL-886）、电子天平（常熟市天量仪器有限责任公司，LT302E）、移液枪（德国eppendorf公司）、微波炉（格兰仕微波炉电器有限公司，P70D20TP-C6）。

实验材料

选择河南师范大学水产养殖基地的健康鲤作为实验的样本，以鲤新鲜鳍条组织为实验材料。

2、实验方法

混匀方式实验设计

以手动摇晃10min为对照组，设置涡旋震荡10s为实验组，每组设置A、B、C、D四个样本，共八个样本。按照酚-氯仿法提取基因组DNA实验步骤进行实验，对两种混匀方式所得实验结果进行分析，得到最佳混匀方式。

离心时间实验设计

表1 离心时间实验设计

实验设置第5组（抽提离心时间10min）为对照组，第1-4组为四个实验组。每组设置a、b、c、d四个样本，每次实验共二十个样本。进行三次平行实验，共六十个样本。按照酚-氯仿法提取基因组DNA实验步骤进行实验，对上述三次平行实验的各组实验结果进行分析，在不影响实验效果的前提下，选取最适宜的离心时间。

采用酚-氯仿法提取鲤基因组DNA实验步骤：

（1）从每条鱼的鳍条组织剪取等量的五等份，置于灭过菌的EP管内，并做好标记。用灭菌后的剪刀剪碎鳍条组织，剪刀每使用一次用酒精擦拭避免污染。

（2）在每个EP管内加入500μL组织提取液，组织提取液冬天易结晶，使用前提前放置水浴锅中预热。加蛋白酶K 10μl，盖上瓶盖后轻轻颠倒混匀。然后放入干式恒温器中设置温度为55℃消化过夜（约9小时），直至消化澄清。

（3）取出样品冷却至室温。加入500μL的苯酚：氯仿：异戊醇（体积比25:24:1），将EP管置于涡旋震荡器（1500r/min）上震荡10s（或利用浮标手动摇晃10min）充分混匀。设置低温冷冻离心机为12000rpm、4℃，按照实验设计中的不同条件梯度分别离心2min、4min、6min、8min、10min。

（4）吸取适量上清液于提前标记好的EP管中。（吸取上清液时沿上清液面小心吸取，以免吸到杂质。实际每管吸取300μL。）再加入与所吸取上清等体积的酚：氯仿：异戊醇的混合试剂，重复上述（3）的后续操作。再次吸取上清液于新标记的EP管，实际每管吸取200μL。

（5）在每管中加两倍于上清体积的提前预冷的无水乙醇（400μL），上下颠倒10次，使乙醇和上清液完全混匀。12000rpm、4℃离心5min。

（6）弃掉上清后，加500μL提前预冷的体积分数70%乙醇进行洗涤，用200μL枪头进行吹打（每个样品均需要换枪头）。12000rpm、4℃离心5min后将乙醇小心倒掉或用10μL移液枪小心吸出。再重复该操作一次。

（7）开盖待乙醇完全挥发，加50μL灭菌的超纯水溶解过夜，并于-20℃保存备用。

琼脂糖凝胶电泳检测。

使用1wt%的琼脂糖凝胶在200V电压下跑胶，40min后将其放在凝胶成像分析系统下成像，保存图片。

紫外分光光度法检测

吸取每个样品DNA 1μL在超微量分光光度计下进行检测，以超纯水作为空白对照，记录每个样品的DNA浓度值、OD260/OD280比值以及OD260/OD230比值。

数据分析

通过SPSS 20.0统计分析软件计算出不同条件下数据的均值及标准差，再对各组结果进行方差齐性检验以及单因素方差分析。方差齐运用LSD（最小显著性差异法）方法对各组结果显著性进行多重检验，方差不齐则利用Tamhane方法进行分析。

3、实验结果

混匀方式实验结果

混匀方式琼脂糖凝胶电泳检测结果

不同混匀方式条件下所提取的鲤基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。主带模糊，有拖带现象，表明DNA浓度低，含杂质较多。但各样本两种条件下条带接近，各样本之间条带差异为样本个体差异所致。

混匀方式紫外分光光度法检测结果

通过DNA浓度检测结果发现本次运用酚-氯仿法抽提DNA的浓度在240.8-420.3ng/μL之间，OD260/OD280比值在1.95-2.03之间，OD260/OD230比值在1.97-2.27之间。由表2可知，实验组基因组DNA浓度高于对照组，但在统计学上两组差异并不显著，与电泳图1吻合。在统计学0.01水平上，对照组OD260/OD280的值极显著小于实验组。在统计学0.05水平上，对照组OD260/OD230的值显著小于实验组。综合电泳图可知，虽然在DNA纯度方面实验组不如对照组，但是在DNA浓度方面却高于对照组，因此在对DNA纯度要求不高的时候可以采用涡旋震荡的混合方式替代传统的手动摇晃方式，同时可以缩短抽提的时间，大大提高实验效率。

表2 不同混匀方式DNA浓度和纯度

注：

离心时间实验结果

离心时间琼脂糖凝胶电泳检测结果

不同离心时间条件下各实验组所提取的鲤基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。各个点样孔中无亮带，主带清晰明亮，无拖尾现象，没有降解，表明DNA较少受到蛋白质和RNA污染。其中，第1组和第2组基因组DNA条带相对明亮，但总体上各组之间条带差异不大。

离心时间紫外分光光度法检测结果通过DNA浓度检测结果发现本实验运用酚-氯仿法抽提DNA的浓度在100.5-489.7ng/μL之间，基因组DNA浓度均较低。OD260/OD280比值在1.81-2.03之间，OD260/OD230比值在1.81-2.35之间。以第5组（离心10min）为对照组，对数据进行方差分析和多重比较，发现第1组（离心2min）和第2组（离心4min）DNA浓度显著高于第5组。由表3可知，第1-5组各组之间OD260/OD280比值及OD260/OD230比值在统计学上均无显著差异，实验结果与电泳图2结果一致。由此认为抽提离心时间为2min和4min时实验结果较好，选用最短时间2min为最佳离心时间可以提高实验效率。

表3 不同离心时间DNA浓度和纯度

注：*表示与对照组相比差异显著（

随着基因组改良技术的发展，为了建立稳定生长的鲤家系，在其生长繁育过程中需要对其子代基因型进行大量的鉴定工作，而如何简便快速的提取出高质量的基因组DNA成为DNA分子生物学的基础。提取基因组DNA的方法最为关键的是：（1）裂解细胞壁和细胞膜从而使基因组DNA能够释放到提取缓冲液中；（2）消除并避免蛋白质、多糖等杂质的污染；（3）防止基因组DNA降解。

在实验过程中，两相之间的杂质很容易吸到，可采用切除部分尖头的蓝色枪头吸取上清，这样可以减少枪头的吸力，防止吸入蛋白质等杂质。本实验进行了两次抽提，可较好的除去蛋白质等杂质。纯净DNA样品的OD260/OD280的比值应为1.80，在1.65-1.87之间属于正常，若高于1.80，表明样品中可能含有RNA；若低于1.80，则表明样品中可能含有蛋白质或苯酚等杂质。纯净DNA样品的OD260/OD230比值应为2.5，若比值小于2.0，表明存在糖类、盐类或有机溶剂污染，若大于2.0则较为纯净。由表2-3可知，OD260/OD280均高于1.8，表明存在RNA污染。OD260/OD230均大于2.0，说明样品受到糖类等杂质污染较少。针对RNA污染的问题，马洪雨等用TE溶解DNA后，加入RNA酶作用1h，重复实验抽提沉淀步骤，可以达到进一步纯化DNA的效果。在加TE溶解DNA之后，若不加RNA酶则须开盖放置20h以上，以便使残留的RNA充分自然降解，也可达到不错的实验效果。

实验步骤中溶液混匀方式实验组DNA浓度高于对照组，但在统计学上无显著差异，而实验组OD260/OD280比值和OD260/OD230比值均显著高于对照组，表明实验组受RNA污染更多，纯度较低一些。总体上，两组电泳图谱无太大差异。综合可知，在对DNA纯度要求不高的时候，利用涡旋振荡器完全可以替代传统手动摇晃方式，弥补手动摇晃耗时费力的不足。三次平行实验结果表明，抽提时离心时间为2min和4min时实验效果最佳且两组在统计学上无显著差异。故与常规实验设置抽提离心时间为10min时相比，选用抽提离心时间为2min，可缩短冗长的实验用时，使实验更加高效。离心时间为2min时，EP管中的样品两相之间液面较为模糊，且有许多杂质挂壁，吸取上清时需格外小心，很容易吸到杂质。但此次吸取上清液过少则难以接触到含杂质地带，因此最短离心时间为2min时，亦可得到较为不错的结果。本实验通过对酚-氯仿法提取黄河鲤鳍条基因组DNA时间条件进行优化，为提高提取效率提供了参考。

5、结论

本发明通过对传统酚-氯仿法提取基因组DNA的部分步骤进行改进，对不同条件下各组提取的结果进行了紫外分光光度和琼脂糖凝胶电泳两种方法的鉴定，最终筛选出高效率利用酚-氯仿法提取鲤基因组DNA的方法，即溶液混匀方式由手动摇晃10min改为涡旋震荡10s后，在低温冷冻离心机中以12000rpm、4℃的条件离心2min得到鲤基因组DNA提取物。因此，本发明改进了传统酚-氯仿提取方法，大大缩短了实验用时，提高了实验效率。

以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都要求落入本发明的保护范围之内。