T-ALL来源诱导多能干细胞模型及其构建方法

摘要

本发明公开了一种T‑ALL来源诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：a、将携带KOS、c‑Myc和Klf4基因的病毒载体按照MOI比值为(4.5～5.5)：(4.5～5.5)：(2.5～3.5)的量转染入源自T‑ALL生物体的外周血单个核细胞中；b、将步骤a得到的转染后的细胞进行培养。本发明还公开了一种诱导多能干细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及T-ALL研究模型技术领域，特别是涉及诱导多能干细胞及其构建方法。

背景技术

急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种常见的血液系统恶性肿瘤，由造血干细胞的异常增殖和分化引起。T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)是由T细胞前体的基因改变引起的，导致胸腺、血液、骨髓和外周组织中T细胞的发育停滞和聚集。多年来，转录因子表达失调、CDKN2A/2B细胞周期调节因子的损伤和NOTCH1信号的过度激活在T-ALL的发病机制中起着重要作用。尽管T-ALL的诊断和治疗已经取得了很大的进展，但耐药、复发等难治性T-ALL的治疗仍然是临床亟待解决的问题，因此构建合适的T-ALL研究模型对于T-ALL的临床研究具有重要的作用。

发明内容

基于此，有必要提供一种T-ALL来源诱导多能干细胞及其构建方法，提供T-ALL的研究模型。

一种T-ALL来源诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：

a、将携带KOS、c-Myc和Klf4基因的病毒载体按照MOI比值为(4.5～5.5)：(4.5～5.5)：(2.5～3.5)的量转染入源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞中；

b、将步骤a得到的转染后的细胞进行培养。

在其中一些实施例中，所述病毒载体选自仙台病毒。

在其中一些实施例中，步骤a中，转染之前，包括将源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞悬浮在造血干细胞无血清培养基中，接种于培养板上，培养66小时～78小时的步骤。

在其中一些实施例中，所述造血干细胞无血清培养基含有L-谷氨酰胺、SCF、FLT3LG、IL-3和IL-6。

在其中一些实施例中，在所述造血干细胞无血清培养基中，L-谷氨酰胺的质量百分数为0.8％～1.2％，SCF为80ng/mL～120ng/mL，FLT3LG为80ng/mL～120ng/mL、IL-3为15ng/mL～25ng/mL，IL-6为8ng/mL～12ng/mL。

在其中一些实施例中，步骤b包括：将步骤a得到的转染后的细胞先在无层粘连蛋白的培养板中培养66小时～78小时；经离心、复悬之后，转移入包被层粘连蛋白的培养板上进行培养。

在其中一些实施例中，所述在包被层粘连蛋白的培养板上进行培养包括在缺乏细胞因子的培养基中进行培养。

在其中一些实施例中，所述在包被层粘连蛋白的培养板上进行培养包括在SCF≤60ng/mL，FLT3LG≤60ng/mL、IL-3为12.5ng/mL，IL-6为6ng/mL的无血清培养基中进行培养。

在其中一些实施例中，步骤b包括：在包被层粘连蛋白的培养板上培养20小时～28小时后，在胚胎干细胞培养基中进行培养。

所述的诱导多能干细胞的制备方法制备得到的诱导多能干细胞。

本发明对T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)体细胞进行重编程获得诱导性多能干细胞(iPSCs)。结果表明T-ALL来源iPSCs具有与T-ALL相同的突变，可作为T-ALL疾病研究模型。

附图说明

图1为本发明一实施例的PBMC细胞重编程为iPSC过程的显微拍摄图(40×)；

图2为本发明一实施例的iPSC克隆传代10次后的显微拍摄图(40×)；

图3为本发明一实施例的iPSC克隆的碱性磷酸酶染色结果(40×)；

图4为本发明一实施例的iPSC四种多能性标志蛋白的免疫荧光染色图；

图5为本发明一实施例的畸胎瘤的三胚层HE染色图；

图6为本发明一实施例的Notch1突变的基因组测序图，其中，H-iPS为健康人PBMC来源的iPS细胞，W10-iPS为T-ALL来源的iPS细胞；

图7为本发明一实施例的LY411575药物处理W10-iPS的IC50曲线图；

图8为本发明一实施例的非耐药W10-iPS与耐药W10-R的耐药性流式检测图；

图9为本发明一实施例的非耐药iPS和耐药iPS生信分析结果图；

图10为本发明一实施例的6种基因敲降W10-R的耐药性流式检测图；

图11为本发明一实施例的MAEL基因敲降W10-R的耐药性流式检测图；

图12为本发明一实施例的各组细胞内MAEL、MRP、LRP基因的相对表达量统计图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明实施例提供一种T-ALL来源诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：

a、将携带KOS、c-Myc和Klf4基因的病毒载体按照MOI比值为(4.5～5.5)：(4.5～5.5)：(2.5～3.5)的量转染入源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞中；

b、将步骤a得到的转染后的细胞进行培养。

本发明对T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)体细胞进行重编程获得诱导性多能干细胞(iPSCs)。结果表明T-ALL来源iPSCs具有与T-ALL相同的突变，可作为T-ALL疾病研究模型。

与传统的肿瘤模型相比，通过本实施例构建的T-ALL来源的iPSC模型具有以下优点：(1)可用于T-ALL进展的早期研究；(2)原代T-ALL来源的iPSC可再次分化为T-ALL细胞。对这一过程进行基因筛选和表观遗传学分析，有助于识别与T-ALL发生、发展相关的原癌基因突变和表观遗传学修饰；(3)由于肿瘤是一个异质性细胞群，每个iPS克隆来自单个肿瘤细胞，因此，对每个iPS克隆进行单独研究，可以全面挖掘肿瘤发生、发展的机制肿瘤发病机制复杂；(4)T-ALL来源的iPSCs能长期维持自我更新和增殖，是高通量筛选治疗药物和毒性研究的理想平台；(5)来源于T-ALL细胞的iPSCs是一种个体化的T-ALL肿瘤模型；(6)T-ALL来源的耐药iPSCs可作为T-ALL耐药研究模型，用于进一步研究T-ALL的耐药机制并开发相应药物。因此，与传统的肿瘤模型相比，iPSC模型能够更准确地揭示肿瘤发病机制和耐药机制，开发有效的肿瘤治疗方法。

诱导多能干细胞可通过在体细胞导入核程序重编因子的基因来制备。核程序重编因子可选自OCT4、SOX2、c-Myc、Klf4、NANOG、LIN28、KOS中的组合。但是，并非所有导入了这些基因的体细胞会被诱导成iPS细胞，事实上，只有其中一部分会被诱导成iPS细胞。

其中在本发明实施例中，T-ALL来源的体细胞制备诱导多能干细胞使用的核程序重编因子选自KOS、c-Myc和Klf4的组合。

用于形成诱导多能干细胞的体细胞的种类，例如，可使用诸如成纤维细胞、前体脂肪细胞、肝细胞、血细胞、皮肤角质形成细胞、间充质干细胞、造血干细胞或神经干细胞等体细胞。体细胞可以是从活体收集的任何体细胞，或者是作为细胞株系建立的体细胞。当需要将制备的多能干细胞或从这种细胞分化的细胞移植到活体中时，优选的是用采集自活体本身的体细胞诱导多能干细胞。本文所限定的细胞为不具有发育全能型的细胞，即本文限定的细胞不能够不包括胚胎干细胞、受精卵等。本发明使用的体细胞为T-ALL来源的外周血单个核细胞。

将编码核程序重编因子的基因导入体细胞中的方法，包括例如将掺入了编码核程序重编因子的基因的载体导入到体细胞中的方法。对载体没有具体限定，而是可以使用选自已知的载体的适当载体。例如，使用病毒载体的方法或者使用非病毒载体的方法中任一者都可用于本发明。这些载体的细节已在许多文献中公布，可从这些许多文献当中作出适当选择来使用载体。

对如上所用的病毒载体没有具体限定，而是通常可使用在基因转移的方法中采用的已知病毒载体，例如反转录病毒载体(包括慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、类人猿病毒载体、痘苗病毒载体或者仙台病毒载体。特别优选地，可使用反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。作为病毒载体，优选其中复制能力缺损从而不能在感染的细胞中自我复制的病毒载体。本发明的病毒载体有选自仙台病毒。

在基因转移时，可使用能提高基因转移效率的物质。能提高基因转移效率的物质的例子包括具有结合到病毒载体的能力的物质，例如诸如纤连蛋白和纤连蛋白片段的物质。可通过将编码核程序重编因子的基因掺入到一种或多种病毒载体中来使用这些基因。当使用两种或更多种反转录病毒载体或慢病毒载体时，特别是当病毒感染进行多次时，优选使用能提高基因转移效率的物质，特别是纤连蛋白或纤连蛋白片段。在一些实施方式中，可以将该提高基因转移效率的物质与携带KOS、c-Myc和Klf4基因的病毒载体一起转染，或分别转染入源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞中。

优选的，可使用具有结合到反转录病毒的活性并同时具有结合到靶标细胞(即将向其中导入基因的体细胞)的活性的功能物质，或者可将具有结合到反转录病毒的活性的功能物质和具有靶标细胞结合活性的功能物质一起使用。对具有靶标细胞结合活性的功能物质没有具体限定，不过其例子包括具有能结合靶标细胞的配体的物质。配体的例子包括细胞粘附蛋白(纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原等)或其片段、激素、细胞因子、细胞表面上的抗原的抗体、多糖、糖蛋白、糖脂、衍白糖蛋白或糖脂的糖链、或者靶细胞的代谢物。本发明的配体优选自层粘连蛋白。可通过将层粘连蛋白包被在培养板上使用。

在一些实施方式中，步骤a中，转染之前，包括将源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞悬浮在造血干细胞无血清培养基中，接种于培养板上，培养66小时～78小时的步骤。

造血干细胞无血清培养基(SFEM)用于在体外对人造血细胞的培养和扩增。

需说明的是，血清中有可能含有未知的因子、朊病毒、病毒等，因此，本发明的培养基优选不含血清作为培养基成分。

在一些实施方式中，所述造血干细胞无血清培养基含有谷氨酰胺、SCF、FLT3LG、IL-3和IL-6。

在一些实施方式中，在所述造血干细胞无血清培养基中，L-谷氨酰胺的质量百分数为0.8％～1.2％，SCF为80ng/mL～120ng/mL，FLT3LG为80ng/mL～120ng/mL、IL-3为15ng/mL～25ng/mL，IL-6为8ng/mL～12ng/mL。

在一些实施方式中，步骤b包括：将步骤a得到的转染后的细胞先在无层粘连蛋白的培养板中培养66小时～78小时；经离心、复悬之后，转移入包被层粘连蛋白的培养板上进行培养。

在一些实施方式中，所述包被层粘连蛋白的培养板上进行培养为在不充足或者缺乏细胞因子的造血干细胞无血清培养基条件下进行培养。例如SCF≤60ng/mL，FLT3LG≤60ng/mL、IL-3为12.5ng/mL，IL-6为6ng/mL的无血清培养基中进行培养。

在一些实施方式中，步骤b为在35℃～39℃，4.5％～5.5％CO

在一些实施方式中，步骤b包括：在包被层粘连蛋白的培养板上进行培养20小时～28小时后，在胚胎干细胞培养基中进行培养。

作为干细胞的培养中使用的培养基，可列举STEMPRO(注册商标)hESC SFM培养基(生命技术(Life Technologies)公司)、mTeSR1培养基(干细胞技术(STEMCELLTechnologies)公司)、TeSR2培养基(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司)、TeSR－E8培养基(干细胞技术(STEMCELL Technologies)公司)、Essencial 8培养基(生命技术(Life Technologies)公司)、HEScGRO(商标)Serum－Free Medium for hEScells(密理博(Millipore)公司)、PluriSTEM(商标)Human ES/iPS Medium(EMD密理博(EMDMillipore)公司)、NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(以色列生物工业Beit-Haemek(BiologicalIndustries Israel Beit-Haemek)株式会社)、NutriStem(商标)XF/FF Culture Medium(史迪金(Stemgent)公司)、AF NutriStem(注册商标)hESC XF培养基(以色列生物工业Beit-Haemek(Biological Industries Israel Beit-Haemek)株式会社)、S－medium(DSPharma生物医学株式会社)、StemFit(注册商标)AK03N培养基(味之素株式会社)、hESF9培养基、hESF－FX培养基、CDM培养基、DEF－CS 500Xeno－Free 3D SpheroidCultureMedium(赛拉提斯(Cellartis)公司)、StemFlex培养基(赛默飞世尔科技(ThermoFisherScientific)公司)等。在本发明中，胚胎干细胞培养基选自NutriStem hESC XF培养基。

本发明实施例还提供一种上述任一实施例所述的诱导多能干细胞的制备方法制备得到的诱导多能干细胞。

本发明的T-ALL来源iPSCs具有与T-ALL相同的突变，可作为T-ALL疾病研究模型。例如作为T-ALL耐药性的研究。

作为一种应用，本发明实施例还提供一种诱导多能干细胞，所述诱导多能干细胞源自上述任一实施例的诱导多能干细胞，所述细胞在编码MAEL的靶DNA序列中包含破坏，所述破坏使得MAEL基因的表达量下降。

短语″基因的破坏″或任何类似的短语是指天然DNA序列的位点特异性打断，从而与基因的野生型拷贝相比阻止该基因在细胞中的表达。

在一些实施方式中，所述破坏是插入突变、错义突变、移码突变或缺失突变或其任意组合造成。

在一些实施方式中，所述破坏使得所述细胞的MRP基因的表达量下降。

在一些实施方式中，所述破坏使得所述细胞的LRP基因的表达量下降。

本发明首次发现MAEL基因的高表达与T-ALL的耐药直接相关，通过MAEL基因敲降，可逆转T-ALL的多药耐药。

本发明实施例提供一种MAEL基因的特异性敲降试剂在制备预防或治疗T-ALL耐药性症状的药物中的应用。

实现基因敲降的方法有很多。基因敲降并不局限于将整个基因完整缺失或去除，而只要使基因丧失其原有功能即可。例如，可通过在基因中插入外源DNA片段，使得该基因无法表达功能性蛋白，或可通过在基因中插入或缺失一个或数个碱基，使得该基因发生移码突变，来实现对该基因的敲除。

在一些实施方式中，所述特异性敲降试剂用以执行以下任意一种方法：CRISPR/Cas9、锌指核酸酶、TALEN、MegaTAL、大范围核酸酶、Cpf1、同源重组、RNAi。

优选的，通过RNA干扰(RNAi)实现MAEL基因敲降。RNA干扰技术是近年来常用的一种抑制靶基因表达的方法，采用19-23个碱基或发卡状不同长度的双链RNA可使不同类型细胞的靶基因表达明显降低。RNA干扰技术可以作为基因下调的一项有效技术手段来弥补敲除技术的不足，从而鉴定未知功能的基因转录本。在发育生物学领域，哺乳动物由卵母细胞到受精卵再到后代个体的整个发育过程具有极大的复杂性。因此，将RNA干扰技术应用于胚胎发育领域的研究将有助于深入地揭示调节胚胎发育过程中关键分子生物学的发生机理。在哺乳动物卵母细胞及胚胎中RNA干扰已经得到了广泛应用。RNA干扰技术可以将目的基因特异、高效地下调，这一过程可以通过小干扰RNA(siRNA)以及短发夹RNA(shRNA)这两种类型小分子得以实现，siRNA是体外化学合成的双链小干扰RNA，shRNA是基于质粒的短发夹RNA。在胞内滞留时间方面，转染后48小时内，仅有部分siRNA滞留于胞内，大部分则被降解，而shRNA则可以被宿主细胞持续的合成，所以其作用更为持久，但siRNA发挥作用的速度则相对较快，因为shRNA需要一定的时间来进行转录。

在一些实施方式中，所述特异性敲降试剂包括引物或探针。

在一些实施方式中，所述特异性敲降试剂选自以下siRNA对中的至少一种：(SEQID NO:25，SEQ ID NO:26)；(SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28)；(SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30)。

以下为具体实施例。

实验步骤：

1、T-ALL来源iPSCs的制备

(1)外周血单个核细胞的分离培养

在病毒感染前3天，用淋巴细胞分离液从新鲜外周血中分离出外周血单个核细胞(PBMCs)。然后，将PBMC悬浮在StemSpan SFEM培养基中(含有1％L-谷氨酰胺、100ng/mLSCF、100ng/mL FLT3LG、20ng/mL IL-3和10ng/mL IL-6)(简称PBMC培养基)。随后，将1×10

(2)PBMCs向iPSCs的重编程

根据试剂使用说明书，用

(3)碱性磷酸酶染色

使用蓝色碱性磷酸酶(AP)底物试剂盒(SK-5300，VECTOR Laboratories)对iPSCs进行碱性磷酸酶染色。大致实验步骤如下：iPSCs用4％多聚甲醛固定后，用新鲜配制的碱性磷酸酶染色剂室温避光孵育30分钟。染色结束后，用倒置显微镜对染色iPSCs进行检查和拍摄。

(4)多能性标志蛋白免疫荧光染色检测

用免疫荧光染色抗体检测iPSCs内SOX2、POU5F1、NANOG和SSEA-4这四种多能性标志蛋白的表达情况。大致实验步骤如下：(1)固定细胞及通透处理：吸弃培养孔中的培养基，加入500ul预温至37℃的D-PBS清洗；利用4％多聚甲醛溶液对iPSCs进行固定后，用含0.1％Triton-X 100的DPBS溶液对iPSCs进行打孔。(2)封闭：加入5％BSA溶液室温孵育1小时进行封闭处理。(3)一抗孵育：分别用1％BSA稀释的兔抗Sox2抗体(1:400，A11936，Abclonal)、小鼠抗SSEA4抗体(1:500，ab16287，Abcam)、兔抗POU5F1抗体(1:400，A7920，Abclonal)、小鼠抗NANOG抗体(1:500，YM0464，Immunoway)对iPSCs进行一抗孵育，4℃过夜。(4)二抗孵育：用1％BSA稀释的Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG抗体(1:500，A0423，Beyotime)，AlexaFluor 647标记的山羊抗鼠IgG抗体(1:500，A0473，Beyotime)和4'，6-二氨基-2-苯基吲哚盐酸盐(DAPI，Sigma-Aldrich)对iPSCs进行孵育，室温放置1小时。(5)封片：抗体孵育完的iPSCs用封片剂进行封片，干燥后即可用倒置荧光显微镜进行观察拍照。

(5)畸胎瘤的形成与检测

将3×10

2、耐药iPSCs的构建

T-ALL-PBMCs来源的iPSCs(T-iPSCs)用1.25μM～160μM的LY411575进行处理，药物浓度按梯度递增(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM)。72小时后用7AAD染色，流式检测细胞死亡率，并计算LY411575的半抑制浓度(IC50)。为了构建耐药的iPSCs，iPSCs在培养初期用1/6IC50浓度的LY411575孵育24h后，换成无药培养基继续培养3-5天。经过几个周期的药物处理，逐步提高药物浓度，最终使得T-iPSCs可以耐受80μM LY411575，获得耐药W4-iPS(W4-R)和耐药W10-iPS(W10-R)。

3、RNA测序与生物信息学分析

使用TRIzol试剂(Thermo，15596-026)分别提取1×10

4、W10-R细胞的基因敲降

根据说明书，使用

表1 siRNA序列

5、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)

采用qRT-PCR检测基因敲降后W10-R细胞的基因表达水平。利用Aurum

表2 qRT-PCR引物的核苷酸序列

实验结果如下。

1、T-ALL来源iPSCs的制备

选择1例携带Notch 1突变的T-ALL患者(NM_017617.3:c.5033T>C(p.L1678P))。利用非整合型仙台病毒，用iPSC重编程因子(Sox-2、Klf4、Oct4和Myc)感染T-ALL来源PBMC细胞，进行重编程。实验结果如下：

(1)人T-ALL来源PBMC细胞体外重编程为iPSCs

根据图1和图2可见，人T-ALL来源PBMC细胞经仙台病毒感染后第7天在显微镜下可见若干小细胞克隆，生长迅速，感染后第13天即可形成边缘清晰的典型的ESC样克隆。

(2)碱性磷酸酶染色鉴定

由于iPSC具有碱性磷酸酶活性，利用碱性磷酸酶染色试剂盒对挑取的iPSC克隆进行染色，若为正确的iPSC，则会在细胞原位生成蓝色反应产物。从图3可以看出，2个iPSC克隆均成功被染成蓝色，初步判定为正确的iPSC。

(3)iPSC多能性标志蛋白的免疫荧光染色鉴定

用免疫荧光染色抗体检测iPSC内SOX2、POU5F1、NANOG和SSEA-4这四种多能性标志蛋白的表达情况，结果如图4所示，显示iPSC高表达这四种多能性标志蛋白。

(4)畸胎瘤形成及鉴定

iPSCs注射到NOD/SCID小鼠体内15天后，可形成畸胎瘤，三胚层的HE染色图如图5所示。

(5)Notch 1突变位点检测

基因组测序分析确定T-ALL来源PBMCs衍生的iPSCs(W10-iPS)存在与原始T-ALL突变相同的Notch1突变(NM_017617.3:c.5033T>C(p.L1678P))(如图6)。

2、LY411575耐药T-iPSCs的构建

为了计算LY411575的半数最大抑制浓度(IC50)，将LY411575剂量从1.25μM增加到160μM，用7AAD染色法检测细胞死亡率。根据拟合曲线，IC50值计算为51.75μM(图7)。在此基础上，建立了可耐受80μM LY411575药物浓度的耐药W4-iPS(W4-R)和W10-iPS(W10-R)。为了检测W10-R细胞的耐药性，分别用80μM LY411575处理非耐药的W10-iPS和耐药的W10-R细胞72h和96h后，流式检测细胞死亡率。实验结果显示，药物处理72h和96h后W10-R细胞死亡率分别为5.24％和11.59％，均远远低于非耐药W10-iPS细胞44.54％和81.83％的死亡比例(图8)，证明我们经过药筛获得了耐药的W10-R细胞。

3、总RNA测序及生信分析结果

为了揭示T-iPSCs耐药的可能机制，我们对非耐药iPS和耐药iPS进行了全面的转录组学研究。如图9A和9B所示，在非耐药组和耐药组之间发现4872个基因的RNA表达发生了改变(W_iPS vs W_R)。为了找出与耐药性相关的阳性调控基因，我们从27个Log

表3W_R细胞中高表达的6个基因列表

4、MAEL基因可能是影响T-iPSCs耐药性的重要基因

为了鉴定出影响T-iPSCs耐药性的关键调控基因，我们分别利用上述6个基因的siRNA来敲降W10-R细胞。在80μM LY411575处理72小时后，我们观察到在W10-R中使用MAEL-siRNA进行敲降后细胞死亡率最高，且与其它各组相比有显著性差异(图10)。

为进一步验证MAEL基因表达与iPS细胞耐药性之间的关系，我们用MAEL基因三对siRNA的两对进行两两组合，分别转染W10-R细胞，72h后用80μM LY411575处理96h，然后流式检测细胞死亡率。MAEL-944/1067siRNA敲降的W10-R细胞标记为MAEL

为了阐明MAEL基因敲降后W10-R细胞内耐药相关基因的表达情况，我们同时还利用qRT-PCR检测了各组细胞内MAEL、MRP、LRP基因的相对表达量，统计结果如图12所示。可以看出，与W10-R细胞相比，MAEL基因敲降的三组W10-R细胞(MAEL

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳市罗湖区人民医院

<120> T-ALL来源诱导多能干细胞模型及其构建方法

<160> 54

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ucugaggcau gggaauauut t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

aauauuccca ugccucagat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gcaccauccc aaccaguaut t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

auacugguug ggauggugct t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

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ccuggagaug aaguggaagt t 21

<210> 6

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<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

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cuuccacuuc aucuccaggt t 21

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<212> DNA/RNA

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gcgaguugac uuuacgaaut t 21

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auucguaaag ucaacucgct t 21

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aaggcugauu gccacuugct t 21

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ggaaggcagu cgccaugaut t 21

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<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

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aucauggcga cugccuucct t 21

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<213> Artificial Sequence

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gggagauugg guuuauaaat t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

uuuauaaacc caaucuccct t 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ggcaggucaa agucugguut t 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

aaccagacuu ugaccugcct t 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

gccuuuagcc guucgcuuat t 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

uaagcgaacg gcuaaaggct t 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

ggaagcaguu uauaucgaut t 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

aucgauauaa acugcuucct t 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

guugguuaca gcaaguacat t 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

uguacuugcu guaaccaaac tt 22

<210> 23

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

ggaaccuagu gauugaaaut t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

auuucaauca cuagguucct t 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

gcguacugca ucaguaauut t 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

aauuacugau gcaguacgct t 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

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gggcguuacc agaagcuaat t 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

uuagcuucug guaacgccct t 21

<210> 29

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

cccauuggug acuacccaut t 21

<210> 30

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

auggguaguc accaugggtt 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

gccauggaga cuucagcaut t 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

augcugaagu cuccauggct t 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

uccacaagca agaugggaat t 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

uucccaucuu gcuuguggat t 21

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<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

ggcugacagg guucaggaat t 21

<210> 36

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Artificial Sequence

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uuccugaacc cugucagcct t 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

ggcaaaaggg gacttagaga tg 22

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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ggcatagcac tcacaaaagg g 21

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

taagctcatc tgctgtaatg gtg 23

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

ggcaatttat ggtttcgctc ttg 23

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

cgccaggatt cacctttcct t 21

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

ccctgtaggc taggggagag 20

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 43

gcatacaggg acaacaaaca ac 22

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 44

tctcaaggac agagcgatca t 21

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 45

gaagatcccc gaactacggc 20

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gaaaacaggt ttcgcccagt c 21

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 47

cagagcaacc ggaaaacatc g 21

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 48

tcatccttca aaacgtcagg c 21

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 49

tgggactgga atgtcacg 18

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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aggaatatgc cccgacttc 19

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 51

gtcttcgggc ctgagctggt gtcg 24

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 52

cttggccgtc tcttgggggt cctt 24

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 53

aactttcgat ggtagtcgcc g 21

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 54

ccttggatgt ggtagccgtt t 21