一种可定量表征改性生物炭吸附土壤中多环芳烃能力的生物评价方法

摘要

本发明公开了一种可定量表征改性生物炭吸附土壤中多环芳烃能力的生物评价方法。本方法首先建立反映待检测改性生物炭投用量与赤子爱胜蚓死亡率之间剂量‑效应关系的线性回归方程；然后通过土壤环境保护领域中理想赤子爱胜蚓死亡率选定待检测改性生物炭的投用量；或在相同投用量下以赤子爱胜蚓死亡率的高低比较评价不同待检测改性生物炭的修复土壤性能的强弱。本发明使赤子爱胜蚓的死亡率既可用作对单种炭投用量起定量表征作用的生物标志物，又可作为定量表征并比较不同炭修复PAHs污染土壤性能的生物评价指标。

说明书

技术领域

本发明属于土壤环境保护技术领域，具体来说涉及一种可定量表征改性生物炭吸附土壤中多环芳烃能力的生物评价方法。

背景技术

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是环境中普遍存在的持久性有机污染物(persistent organic pollutants，POPs)，具有致癌、致畸、致突变等特点。PAHs最主要一个污染特征为污染普遍性，即PAHs广泛分布在土壤、水体、沉积物、大气等各种环境介质中。土壤中的PAHs可以通过土壤吸附、植物叶片及根系吸收等进入土壤环境，并通过食物链富集，最终危害到人类自身健康。此外，在一定条件下，土壤中的PAHs会以各种形式再次进入其他环境介质造成“二次污染”，比如，在空气流动的作用下，土壤颗粒或者土壤间的气体会再次携带PAHs进入大气环境；在降水或者浇灌农用地的条件下，土壤中的PAHs会通过下渗作用进入地下水或者随着地表径流进入水环境。我国土壤污染状况调查公报显示，农业土壤环境质量总体堪忧，部分地区污染较重，PAHs等有机污染物对农业土壤的污染程度仅次于重金属等无机污染物。

近年来，利用各种改性技术(物理、化学和生物)制备得到的众多改性生物炭，被认为是一种廉价的原位修复污染土壤的方法，将其用作土壤改良剂用于土壤中PAHs等POPs的修复，是目前土壤环境保护领域的应用热点。有关(改性)生物炭修复污染土壤机制的科学研究表明，(改性)生物炭一方面通过改良土壤养分、水分、透气性、酸碱性等基础特性，改善土壤持水能力和孔隙度等，显著增强土壤对PAHs等POPs的吸附；另一方面，(改性)生物炭通过其强吸附性、反应性和多孔性与PAHs直接作用，最终实现修复污染土壤的目的。目前，在对各类改性生物炭修复PAHs污染土壤的性能进行评价时，多采用吸附分配系数K

土壤动物是土壤生态系统中的重要成分，在土壤生态系统平衡的维持中起重要作用。蚯蚓是重要的土壤动物，约占土壤生物量的60％-80％，其生存活动可促进有机质的分解、土壤养分的循环与释放、改善土壤结构和土壤的理化性状，在维持土壤生态系统功能中起着不可替代的作用。从生态学上来看，蚯蚓处于陆生生态食物链的底部，对土壤中的大部分污染物都有富集作用，虽然这些被富集的污染物对蚯蚓可能不会造成严重的伤害，但却可能影响食物链中更高级的生物，同时蚯蚓对土壤中的某些污染物比许多其他土壤动物更为敏感。例如，赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)对毒物敏感，且具有标准的急性毒性和亚急性毒性测定方法，常被视为生态毒理学实验的标准物种。因此，国内外不少学者将赤子爱胜蚓作为土壤污染状况的重要指示生物进行研究，并通过对赤子爱胜蚓的生态毒理学研究反映所测污染物的毒性效应及土壤的污染状况。

综上所述，当向以PAHs对赤子爱胜蚓最低全致死浓度LC

发明内容

本项发明以赤子爱胜蚓为受试生物，依据国家标准《化学品蚯蚓急性毒性试验》(GB/T 21809-2008)开展四种PAHs(萘、菲、芘和荧蒽)混合物对赤子爱胜蚓的14d急性毒性实验，以找出四种PAHs混合物对赤子爱胜蚓的最低全致死浓度LC

通过回归分析发现，见表5-2、表6-2和表7-2，在7d和14d内炭Y、G和M的投用量与赤子爱胜蚓的死亡率之间均呈现极显著的线性负相关关系(P＜0.01)。因此，赤子爱胜蚓的死亡率既可用作对单种炭投用量起定量表征作用的生物标志物，又可作为定量表征并比较不同炭修复PAHs污染土壤性能的生物评价指标。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种可定量表征改性生物炭吸附土壤中多环芳烃能力的生物评价方法，按照下述步骤进行：

步骤一、进行以待检测土壤中含有的多环芳烃对赤子爱胜蚓的急性毒性实验，得出多环芳烃对赤子爱胜蚓的最低全致死浓度LC

步骤二、利用待检测改性生物炭对步骤一中所述的待检测土壤进行多环芳烃吸附实验，所述待检测改性生物炭的投用量采用多个梯度，测定各投用量下赤子爱胜蚓的死亡率；

步骤三、将步骤二中的测定结果处理分析后，得到能够反映待检测改性生物炭投用量与赤子爱胜蚓死亡率之间剂量-效应关系的线性回归方程；

步骤四、依据步骤三中所述线性回归方程，通过土壤环境保护领域中理想赤子爱胜蚓死亡率选定待检测改性生物炭的投用量；或在相同投用量下以赤子爱胜蚓死亡率的高低比较评价不同待检测改性生物炭的修复土壤性能的强弱。

在上述技术方案中，在步骤一中，所述多环芳烃包括但不限于萘、菲、芘和荧蒽。

在上述技术方案中，在步骤一中，所述急性毒性实验依据国家标准《化学品蚯蚓急性毒性试验》(GB/T 21809-2008)进行。

在上述技术方案中，在步骤二中，所述改性生物炭的投用量至少设定5个梯度。

在上述技术方案中，在步骤二中，所述赤子爱胜蚓死亡率选定7d和14d赤子爱胜蚓死亡率。

在上述技术方案中，在步骤三中，所述测定结果的处理分析利用统计学软件IBMSPSS Statistics 24.0。

本发明的优点和有益效果为：

1、本项发明提供了一种新的可定量表征并比较不同改性生物炭修复PAHs污染土壤性能的评价指标——赤子爱胜蚓的死亡率，将其视为评价炭修复污染土壤性能的指标进行应用，相较于前述吸附分配系数K

2、若对某种改性生物炭而言，我们可以根据炭投用量与赤子爱胜蚓死亡率之间的剂量-效应关系，得到可定量表征该种剂量-效应关系的线性回归方程，利用此方程求出土壤环境保护领域中理想赤子爱胜蚓死亡率对应的炭投用量，这对污染土壤的改性生物炭修复有一定的参考价值。

3、若对多种改性生物炭而言，我们仍然根据炭投用量与赤子爱胜蚓死亡率之间的剂量-效应关系，得到每种炭所对应的投用量与赤子爱胜蚓死亡率之间的线性回归方程，然后在相同炭投用量下计算出每种炭对应的赤子爱胜蚓死亡率，从而以赤子爱胜蚓死亡率的高低比较评价不同炭修复土壤性能的强弱，因炭投用量与赤子爱胜蚓死亡率之间呈现极显著的线性负相关关系，对应赤子爱胜蚓死亡率越低的炭，其修复PAHs污染土壤的性能越强；对应赤子爱胜蚓死亡率越高的炭，其修复PAHs污染土壤的性能越弱。这对从几种商用改性生物炭中选择出修复性能较优良的炭具有科学的指导作用。

附图说明

图1：炭Y投用量与赤子爱胜蚓7d死亡率之间的剂量-效应关系图。

图2：炭Y投用量与赤子爱胜蚓14d死亡率之间的剂量-效应关系图。

图3：炭G投用量与赤子爱胜蚓7d死亡率之间的剂量-效应关系图。

图4：炭G投用量与赤子爱胜蚓14d死亡率之间的剂量-效应关系图。

图5：炭M投用量与赤子爱胜蚓7d死亡率之间的剂量-效应关系图。

图6：炭M投用量与赤子爱胜蚓14d死亡率之间的剂量-效应关系图。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例

试验样品及其溶液的配制：四种PAHs萘、菲、芘和荧蒽(CAS号分别为91-20-3、85-01-8、129-00-0和206-44-0)均购自上海麦克林生化科技有限公司。配制萘、菲、芘和荧蒽的试验溶液时，称取萘、菲、芘、荧蒽各7.50g，混合均匀后用丙酮溶解并移入1000mL容量瓶中再用丙酮定容，得到浓度为30mg/mL试验药液备用。

试验用蚓：选用赤子爱胜蚓，购自天津贾立明蚯蚓养殖有限公司，购入后经隔离检疫合格。试验开始前，受试蚯蚓在人工土壤中饲养24h。试验选用二月龄以上，体重在0.30g～0.60g之间、环带明显、健康的成年蚓。

试验土壤：采用人工土壤为试验基质，其配方见下表1。

表1 人工土壤配方

试验参比物质：选用氯乙酰胺(CAS号为79-07-2，分析纯)。

试验质量控制：①参比物质试验每半年至少开展1次，以确认试验条件满足试验要求且未发生显著变化。本次试验中参比物质氯乙酰胺对赤子爱胜蚓14d急性毒性试验的LC

主要仪器设备和试剂：见下表2和表3。

表2 试验主要仪器设备

表3 试验主要试剂

实施例1：四种PAHs混合物对赤子爱胜蚓的最低全致死浓度LC

为测得四种PAHs混合物对赤子爱胜蚓14d急性毒性试验时的最低全致死浓度LC

根据以上预试验的结果，设置出200mg/kg

在测得四种PAHs混合物对赤子爱胜蚓的LC

实施例2：炭修复PAHs污染土壤下的赤子爱胜蚓急性毒性试验

首先对炭Y、G、M均设置出0.02g、0.05g、0.1g、0.4g和0.7g五个投用量梯度，然后将每一投用量梯度下的炭分别与10mL 30mg/mL的试验药液置于150mL锥形瓶中，经恒温摇床以120r/min充分混合吸附24h，混匀期间容器密封，温度为20.3℃～20.9℃，以使炭对PAHs的吸附达到平衡，而后将各混合吸附液分别与10g石英砂在培养皿中混匀，并置于通风橱中，待混合吸附液中的丙酮溶剂完全自然挥发后，将剩余物(炭和石英砂)转移至590g干人工土壤中，即得到含改性生物炭的试验土壤基质。向该土壤基质中加入适量的去离子水以调节土壤含水量，使其占土壤干重的30％～35％。另外，以不加改性生物炭的试验药液在经上述相同处理后作为背景浓度组；以溶剂丙酮处理石英砂作为溶剂对照，以去离子水处理石英砂作为空白对照。

取补充加水的试验土壤基质750g置于培养瓶中，放入10条蚯蚓，用瓶盖盖好。将培养瓶置于20±2℃，相对湿度70％～90％，光照强度400lx～800lx的条件下培养，同时，观察并记录实际的培养条件。

各试验组和对照组均设置2个平行，每个平行10条蚯蚓。试验周期为14d，试验第7d和第14d观察记录蚯蚓死亡状况。

实施例3：炭修复PAHs污染土壤下的急性毒性试验的观察与记录

在试验开始后的7d和14d观察并记录受试蚯蚓的死亡数。将培养瓶内的试验土壤基质轻轻倒在一玻璃皿或平板上，取出蚯蚓，检查蚯蚓前尾部对机械刺激的反应。判断蚯蚓是否死亡的标准是：当蚯蚓前尾部对轻微机械刺激没有反应时即以死亡计。同时，在14d试验结束时观察并记录受试蚯蚓的中毒症状。

试验开始时抽查试验组、空白对照组和背景浓度组中各10条蚯蚓的体重，并在试验开始和结束时称量每个平行中蚯蚓的总重，以计算各平行中蚯蚓的平均体重。

在试验开始和结束时抽查试验组和对照组中人工土壤的含水率及每个平行中人工土壤的pH值。

结果

1、四种PAHs混合物对赤子爱胜蚓的最低全致死浓度LC

通过对四种PAHs混合物设置出前述4个预试验浓度，得出了PAHs混合物对赤子爱胜蚓14d急性毒性预试验的死亡情况，见下表4-1。

表4-1 PAHs对赤子爱胜蚓14d急性毒性预试验的死亡情况

根据以上预试验结果，设置出了前述6个试验浓度，从而得出4种PAHs混合物对赤子爱胜蚓的最低全致死浓度LC

表4-2 PAHs对赤子爱胜蚓14d急性毒性试验的死亡情况

2、炭Y修复PAHs污染土壤性能的线性回归分析

在炭Y修复PAHs污染土壤下的赤子爱胜蚓急性毒性试验结束后，7d和14d赤子爱胜蚓急性毒性试验结果见表5-1，为建立炭Y投用量(x)与7d/14d赤子爱胜蚓死亡率(y)之间的剂量-效应关系，表5-1中的测定结果由统计学软件SPSS 24.0处理分析后，分别得到能够反映上述剂量-效应关系的线性回归方程(见图1和图2)。通过回归分析(见表5-2)，在7d和14d内炭Y投用量与赤子爱胜蚓死亡率之间均呈现极显著的线性负相关关系(P＜0.01)。因此，赤子爱胜蚓的死亡率可用作对炭Y投用量起定量表征作用的生物标志物。

表5-1 炭Y修复下的赤子爱胜蚓急性毒性试验死亡情况

注：**表示P＜0.01，极显著性负相关。

表5-2 定量表征炭Y投用量和赤子爱胜蚓7d/14d死亡率线性关系的回归分析

3、炭G修复PAHs污染土壤性能的线性回归分析

在炭G修复PAHs污染土壤下的赤子爱胜蚓急性毒性试验结束后，7d和14d赤子爱胜蚓急性毒性试验结果见表6-1，为建立炭G投用量(x)与7d/14d赤子爱胜蚓死亡率(y)之间的剂量-效应关系，表6-1中的测定结果由统计学软件SPSS 24.0处理分析后，分别得到能够反映上述剂量-效应关系的线性回归方程(见图3和图4)。通过回归分析(见表6-2)，在7d和14d内炭G投用量与赤子爱胜蚓死亡率之间均呈现极显著的线性负相关关系(P＜0.01)。因此，赤子爱胜蚓的死亡率可用作对炭G投用量起定量表征作用的生物标志物。

表6-1 炭G修复下的赤子爱胜蚓急性毒性试验死亡情况

注：**表示P＜0.01，极显著性负相关。

表6-2 定量表征炭G投用量和赤子爱胜蚓7d/14d死亡率线性关系的回归分析

4、炭M修复PAHs污染土壤性能的线性回归分析

在炭M修复PAHs污染土壤下的赤子爱胜蚓急性毒性试验结束后，7d和14d赤子爱胜蚓急性毒性试验结果见表7-1，为建立炭M投用量(x)与7d/14d赤子爱胜蚓死亡率(y)之间的剂量-效应关系，表7-1中的测定结果由统计学软件SPSS 24.0处理分析后，分别得到能够反映上述剂量-效应关系的线性回归方程(见图5和图6)。通过回归分析(见表7-2)，在7d和14d内炭M投用量与赤子爱胜蚓死亡率之间均呈现极显著的线性负相关关系(P＜0.01)。因此，赤子爱胜蚓的死亡率可用作对炭M投用量起定量表征作用的生物标志物。

表7-1 炭M修复下的赤子爱胜蚓急性毒性试验死亡情况

注：**表示P＜0.01，极显著性负相关。

表7-2 定量表征炭M投用量和赤子爱胜蚓7d/14d死亡率线性关系的回归分析

5、炭修复PAHs污染土壤下的急性毒性试验的观察与记录

开展炭修复PAHs污染土壤下的赤子爱胜蚓急性毒性试验时的环境条件如下：温度为19.7℃～21.4℃、相对湿度为73.9％～83.2％、连续性光照强度为532lx～582lx以及土壤含水率为33.7％～35.5％，具体数值见表8-1和表8-2。

在炭修复PAHs污染土壤下的蚯蚓急性毒性试验开始和结束时，均测定了对照组与试验组的pH值范围，分别为6.43～6.78和6.34～6.71，具体数值见表8-3和表8-4。

在炭修复下的蚯蚓急性毒性试验开始时，所抽查的各组别中10条蚯蚓的体重(见表8-5)，且在试验开始和结束时通过称量每一平行中蚯蚓的总重，计算出各平行中蚯蚓的平均体重(见表8-6)。

在14d试验结束时记录到的受试蚯蚓中毒症状见表8-7。

表8-1 炭修复下的急性毒性试验的温度、湿度和光强条件

表8-2 炭修复下的急性毒性试验的人工土壤含水率测定(抽查)

表8-3 炭修复下的急性毒性试验开始时的pH值

表8-4 炭修复下的急性毒性试验结束时的pH值

表8-5 炭修复下的急性毒性试验开始时的蚯蚓体重(抽查)

表8-6 炭修复下的急性毒性试验开始和结束时蚯蚓的存活数及平均体重

表8-7 炭修复下的急性毒性试验结束时蚯蚓出现的中毒症状

通过对每种炭投用量(x)与7d/14d赤子爱胜蚓死亡率(y)之间线性方程的回归分析(见表5-2、表6-2和表7-2)发现，在7d和14d内炭Y、G和M的投用量与赤子爱胜蚓的死亡率之间均呈现极显著的线性负相关关系，即当三种炭在相同的炭投用量下，对应赤子爱胜蚓死亡率越低的炭，其修复PAHs污染土壤的性能越高；对应赤子爱胜蚓死亡率越高的炭，其修复PAHs污染土壤的性能越弱。因此，赤子爱胜蚓的死亡率既可用作对单种炭投用量起定量表征作用的生物标志物，又可作为定量表征并比较不同炭修复PAHs污染土壤性能强弱的生物评价指标。

附表A 参比试验中氯乙酰胺对蚯蚓急性毒性试验数据

附表B 参比试验中氯乙酰胺对蚯蚓急性毒性试验数据

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。