测定硝苯地平缓释片体外溶出的方法

摘要

本发明属于药物分析技术领域，公开一种测定硝苯地平缓释片体外溶出的方法，具体步骤为：将硝苯地平缓释片置于转篮中，利用二室模型实验装置进行溶出，经溶出介质溶出、滤膜过滤后持续提取溶出液，在固定的时间点测定溶出液中硝苯地平的浓度；其中，溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度一致，所述溶出介质为0.1～0.5％Tween80的pH 6.8磷酸盐缓冲液。本发明体外溶出方法通过模拟体内吸收过程，保证体外溶出实验的准确性，实现体外溶出实验测定的溶出曲线与体内吸收过程一致，为实现良好预测人体生物等效性提供保障。

说明书

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种测定硝苯地平缓释片体外溶出的方法。

背景技术

目前体外溶出实验被认为可以预估体内溶出行为和吸收情况，但是，人体内环境复杂，容易造成制剂间体外溶出行为相似而体内BE不等效的现象，给企业研发进展带来阻碍，也带来经济负担。

硝苯地平是一种二氢吡啶类的钙通道阻滞剂，常温下为黄色晶体，难溶于水，在丙酮或氯仿中易溶，在乙醇中略溶，对光高度敏感。硝苯地平的logP为2.20，脂溶性好，为BCS2类药物。硝苯地平在胃肠道系统的pH值范围内不会发生离子化，溶解性为非pH依赖性。硝苯地平口服后经胃肠道吸收，由于肝首过效应造成硝苯地平的生物利用度低，缓释片的达峰时间为1.6-4h，药-时曲线平缓。硝苯地平组织分布广泛，其中在肝、血清、肾及肺中浓度较高，在脑、骨胳肌中浓度较低。硝苯地平在人体内血浆蛋白结合率高达92-98％。70-80％的药物以水溶性代谢物从尿中排出，原形药物仅0.1％经尿排泄，体内无蓄积作用。

硝苯地平的常规溶出模式有篮法或浆法，存在诸多结构和性能方面的缺陷，无法全面模拟体内的药物溶出/吸收过程，使得溶出检查仅仅作为药物体外控制的一种质量手段，无法与体内的实际情况相关联。再者，由于普通的硝苯地平药片在体内释放速度较快，每日需要多次服用，且血压波动较大，故而在此基础上，硝苯地平缓释片和硝苯地平控释片随之诞生，硝苯地平缓释片的释放周期为12个小时，硝苯地平控释片的释放周期长达24个小时，从而能够实现平稳的控压。基于不同剂型和不同规格的硝苯地平，在体外溶出过程中，有必要选择合适的方法，以期恰当地模拟药物的溶出/吸收机理，为良好预测人体生物等效性提供参考。

中国专利申请CN201710349978.2公开了一种硝苯地平缓释片溶出曲线的测定方法，通过改进往复筒溶出仪内筒的聚丙烯丝筛网的结构并结合改进溶出介质的方法，但该方法旨在克服药典方法的缺陷，具有一定的局限性。

因此，开发一种模拟体内吸收的体外溶出方法，对于医药企业来说具有重要的意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种测定硝苯地平缓释片体外溶出的方法，通过模拟体内溶出和吸收的动态持续过程，测定硝苯地平缓释片溶出浓度，进而实现良好预测人体生物等效性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供一种测定硝苯地平缓释片体外溶出的方法，具体步骤为：将硝苯地平缓释片置于转篮中，利用模拟难溶性口服药物制剂体内溶出和跨膜吸收过程的二室模型实验装置进行溶出，经溶出介质溶出、滤膜过滤后持续提取溶出液，在固定的时间点测定溶出液中硝苯地平的浓度，得到硝苯地平浓度和溶出时间之间的平均微分溶出曲线图，根据微分溶出关系得到累积溶出质量分数与溶出时间之间的累积溶出曲线图；

其中，溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度一致。

进一步地，所述溶出介质为0.1～0.5％Tween80的pH 6.8磷酸盐缓冲液。优选地，所述溶出介质为0.1％、0.3％、0.5％Tween80的pH 6.8磷酸盐缓冲液。其中0.1～0.5％Tween80的pH 6.8磷酸盐缓冲液，是指1000mL磷酸盐缓冲液中含有1～5g Tween80。通过实验证明，使用低浓度的Tween80(0.1％)进行体外溶出实验，获得的体外溶出曲线区分度较好，能适度区分受试制剂与参比制剂的质量优劣和工艺差异。高浓度的Tween80可能掩盖了制剂实际溶出能力的差别。采用0.1～0.5％Tween80的pH 6.8磷酸盐缓冲液作为溶出介质，其稳定性高，满足要求，在进行溶出曲线测定时，测定结果可重现。

进一步地，所述溶出液中硝苯地平的浓度采用高效液相测定，将对应时间点和硝苯地平浓度计算后，得到硝苯地平浓度和溶出时间之间的平均微分溶出曲线图，根据微分溶出关系得到累积溶出质量分数与溶出时间之间的累积溶出曲线图。将溶出液精密量取20μL，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，计算对应的硝苯地平的浓度。高效液相仪的色谱条件：C18柱；流动相：乙腈-0.1％磷酸超纯水的体积比(1∶1)；流速：1mL/min；波长：235nm；进样量：20μL；柱温：35℃。

根据硝苯地平缓释片的微分溶出数据，得到其累积溶出分数与溶出时间之间的累积溶出关系的计算公式为：

其中，F

进一步地，所述硝苯地平缓释片包括参比制剂和受试制剂，采用相似因子法，利用硝苯地平缓释片的参比制剂和受试制剂的平均溶出浓度数据，计算相似因子f2，所述相似因子f2用于比较硝苯地平缓释片的参比制剂溶出曲线和受试制剂溶出曲线的相似性；利用相似因子f2的值判断相似性时，相似因子f2大于或等于50时，硝苯地平缓释片的参比制剂和受试制剂的溶出度曲线相似，相似因子f2小于50时，硝苯地平缓释片的参比制剂和受试制剂的溶出度曲线不相似。

根据所述参比制剂的累积溶出关系及所述受试制剂的累积溶出关系，得到所述参比制剂的累积溶出关系及所述受试制剂的累积溶出关系之间的相似因子的计算公式为：

其中，f

进一步地，所述溶出介质的温度控制在(37±0.5)℃。通过实验证明，溶出介质的温度使得硝苯地平具有较高的稳定性，同时也利于模拟人体内温度，测得的溶出曲线更接近体内吸收的趋势。

进一步地，所述溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度为1～～15mL/min。优选地，所述溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度为5～12mL/min。优选地，所述溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度均为5mL/min、6mL/min、8mL/min、10mL/min或12mL/min。

进一步地，所述转篮的转速为10～150rpm。优选地，所述转篮的转速为50～100rpm。优选地，所述转篮的转速为75rpm。在该转速条件下，溶出度高，不会出现水动力学紊乱。

进一步地，所述固定的时间点为5、10、15、20、30、40、50、60、75、90、120、150、180min等等，直至硝苯地平缓释片溶出完成。

进一步地，所述模拟难溶性口服药物制剂体内溶出和跨膜吸收过程的二室模型实验装置具体结构如专利CN201920858418.4中公开。

进一步地，所述硝苯地平缓释片的规格为10mg。

一方面，本发明提供一种测定硝苯地平缓释片体外溶出的方法，将硝苯地平缓释片利用模拟难溶性口服药物制剂体内溶出和跨膜吸收过程的二室模型实验装置进行溶出，具体步骤为：

1)溶出介质经进液泵作用进入多孔滤膜杯，待多孔滤膜杯和外室溶出杯中溶出介质体积相同时，开启出液泵，进液泵和出液泵的工作频率一致，保持溶出介质的总体积不变；溶出介质为0.1％Tween80的pH 6.8磷酸盐缓冲液，多孔滤膜杯外包覆的滤膜孔径为0.45μm；

2)将硝苯地平缓释片置于转篮中，转篮的转速为75rpm，溶出液经滤膜过滤后持续提取溶出液，溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度均为6mL/min，在固定的时间点测定溶出液中硝苯地平的浓度；

所述固定的时间点为5、10、15、20、30、40、50、60、75、90、120、150、180min，直至硝苯地平缓释片溶出完成；

3)采用高效液相测定溶出液中在不同时间点的硝苯地平的平均溶出浓度，将对应时间点和硝苯地平的平均溶出浓度，得到硝苯地平的平均溶出浓度和溶出时间之间的平均微分溶出曲线图，根据微分溶出关系得到累积溶出质量分数与溶出时间之间的累积溶出曲线图。

进一步地，采用相似因子法，利用硝苯地平缓释片的参比制剂和受试制剂的平均溶出浓度数据，计算相似因子f2，所述相似因子f2用于比较硝苯地平缓释片的参比制剂溶出曲线和受试制剂溶出曲线的相似性；利用相似因子f2的值判断相似性时，相似因子f2大于或等于50时，硝苯地平缓释片的参比制剂和受试制剂的溶出度曲线相似，相似因子f2小于50时，硝苯地平缓释片的参比制剂和受试制剂的溶出度曲线不相似。

本发明通过维持溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度，保持溶出介质的总体积不变，使得硝苯地平缓释片的周围达到漏槽条件，药物可以持续释放。由于多孔滤膜杯和外室溶出杯存在药物浓度差，多孔滤膜杯中释放的游离药物进入外室溶出杯中，而未溶解的药物或辅料粉末被滤膜阻挡在多孔滤膜杯中，防止取样过程中药物损失。外室溶出杯中含药介质被取样管不断抽走，并分别于不同时间点收集样本，其他介质存入废液收集瓶中。所以，本发明方法通过不断的输入新鲜介质和输出含药介质，以保持硝苯地平缓释片药物制剂的漏槽条件，通过形成开放式溶出模型，有效模拟体内吸收状态。通过检测不同取样点的药物浓度，区分硝苯地平缓释片药物制剂单位时间内的溶出能力，进而预判硝苯地平缓释片在人体内的吸收能力。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明实施例证明本发明方法模拟体内吸收过程，保证体外溶出实验的准确度，实现体外溶出实验测定的溶出曲线趋势与BE实验体内吸收药-时曲线趋势一致，不仅可以评价硝苯地平缓释片的优劣，同时也为生物等效性做出预测，提高生物等效性实验的成功率，保证药品上市后的生物有效性。

对比实施例1、实施例3和实施例4中，各参比制剂的溶出曲线相似(线形和趋势均相同)，进一步说明本发明所提供的方法具有良好的可重现性，溶出方法稳定性好，准确度高。

对比实施例1、实施例3和实施例4中，各受试制剂的溶出曲线，溶出速率各有不同，受试制剂与参比制剂之间具有较好的区分度，可以有效区分参比制剂和受试制剂之间的质量优劣及工艺差异，实现对各参比制剂相似性及质量一致性的评估。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1实施例1中10mg硝苯地平缓释片参比制剂的平均微分溶出曲线图。

图2实施例1中10mg硝苯地平缓释片参比制剂的平均累积溶出曲线图。

图3实施例2中硝苯地平缓释片参比制剂和受试制剂人体内平均药-时曲线图

图4实施例2中硝苯地平缓释片参比制剂平均累积吸收曲线

图5实施例3中10mg硝苯地平缓释片参比制剂和受试制剂平均微分溶出曲线。

图6实施例3中10mg硝苯地平缓释片参比制剂和受试制剂平均累积溶出曲线。

图7实施例4中10mg硝苯地平缓释片参比制剂和受试制剂平均累积溶出曲线。

图8实施例4中10mg硝苯地平缓释片参比制剂和受试制剂平均微分溶出曲线。

图9实施例4中10mg硝苯地平缓释片参比制剂和受试制剂的预测药-时曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1条件筛选

测定硝苯地平缓释片体外溶出的方法，具体步骤如下：

1)溶出介质经进液泵作用进入多孔滤膜杯，待多孔滤膜杯和外室溶出杯中溶出介质体积均为75mL时，开启出液泵，进液泵和出液泵的工作频率一致，保持装置内溶出介质的总体积150mL不变；溶出介质温度保持在37℃，多孔滤膜杯外包覆的滤膜孔径为0.45μm；

2)将硝苯地平缓释片置于转篮中，转篮的转速为75rpm，溶出液经滤膜过滤后持续提取溶出液，在固定的时间点测定溶出液中硝苯地平的浓度；

所述固定的时间点为5、10、15、20、30、40、50、60、75、90、120、150、180min，直至硝苯地平缓释片溶出完成；

3)采用高效液相测定溶出液中在不同时间点的硝苯地平的含量，将对应时间点和硝苯地平浓度计算后，得到硝苯地平浓度和溶出时间之间的平均微分溶出曲线图，根据微分溶出关系得到累积溶出质量分数与溶出时间之间的累积溶出曲线图。

改变条件情况如下：

条件1：溶出介质为0.1％Tween80的pH 6.8磷酸盐缓冲液，溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度均为6mL/min；

条件2：溶出介质为0.1％Tween80的pH 6.8磷酸盐缓冲液，溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度均为12mL/min；

条件3：溶出介质为0.3％Tween80的pH 6.8磷酸盐缓冲液，溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度均为12mL/min；

以硝苯地平缓释片参比制剂进行实验，结果如图1-2所示；硝苯地平缓释片在不同时间的溶出能力通过平均微分溶出曲线图表示，硝苯地平缓释片在不同时间的溶出量通过累积溶出曲线体现。溶出介质的补充速度(12mL/min)过高容易将硝苯地平浓度稀释，低的溶出介质的补充速度(6mL/min)符合硝苯地平在体内溶出的速率，模拟体内吸收方式更准确。本发明通过实验证明，使用低浓度的Tween80(0.1％)进行体外溶出实验，获得的体外溶出曲线区分度较好，能适度区分受试制剂与参比制剂的质量优劣和工艺差异。高浓度的Tween80可能掩盖了制剂实际溶出能力的差别。

实施例2

采用随机、开放、三周期、交叉实验设计对12例健康志愿者进行餐后的生物等效性研究，周期间洗脱期为7天，每周志愿者分别口服硝苯地平缓释片参比制剂或受试制剂20mg/次，一日1次，采血时间设计为给药前(0h)及给药后10min、20min、30min、45min、1.0h、1.25h、1.5h、1.75h、2h、2.5h、3h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、15h、24h、36h分别采集上肢静脉血4mL。样品离心(3,500rpm，10min)，分离血浆，置于-80℃超低温冰箱中保存。具体地，取100μL血浆样品，加入600μL无水甲醇(含内标)，涡旋5min，充分混匀，12,000rpm离心10min，取上清进高效液相色谱串联质谱仪分析血浆中硝苯地平的含量。

参比制剂：硝苯地平缓释片，BAYER，规格10mg；

受试制剂：硝苯地平缓释片(T1)，规格10mg；

硝苯地平缓释片(T2)，规格10mg；

结果显示，参比制剂达峰时间约为2.67h，AUC和C

表1.硝苯地平缓释片药动学参数

通过Wagner-Nelson法解析参比制剂口服给药后硝苯地平的体内吸收百分数(Fabs％)，结果显示该制剂口服给药后约3h吸收完全(图4)，且计算得吸收速率常数k

实施例3

测定硝苯地平缓释片体外溶出的方法，具体步骤如下：

1)溶出介质经进液泵作用进入多孔滤膜杯，待多孔滤膜杯和外室溶出杯中溶出介质体积均为75mL时，开启出液泵，进液泵和出液泵的工作频率一致，保持装置内溶出介质的总体积150mL不变；溶出介质为0.1％Tween80的pH 6.8磷酸盐缓冲液，溶出介质温度保持在37℃，多孔滤膜杯外包覆的滤膜孔径为0.45μm；

2)将硝苯地平缓释片置于转篮中，转篮的转速为75rpm，溶出液经滤膜过滤后持续提取溶出液，在固定的时间点测定溶出液中硝苯地平的浓度；

所述固定的时间点为5、10、15、20、30、40、50、60、75、90、120、150、180min，直至硝苯地平缓释片溶出完成；

溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度均为6mL/min；

3)采用高效液相测定溶出液中在不同时间点的硝苯地平的含量，将对应时间点和硝苯地平浓度计算后，得到硝苯地平浓度和溶出时间之间的平均微分溶出曲线图，根据微分溶出关系得到累积溶出质量分数与溶出时间之间的累积溶出曲线图。

参比制剂：硝苯地平缓释片，BAYER，规格10mg；

受试制剂：硝苯地平缓释片(T1)，规格10mg；

硝苯地平缓释片(T2)，规格10mg；

在上述溶出条件下，硝苯地平缓释片参比和两受试制剂的体外溶出结果如图5-6所示，3h内累积溶出度为R＞T2＞T1。

10mg硝苯地平缓释片参比制剂和受试制剂平均微分溶出曲线可以看出(图5)，三制剂30min内的溶出行为相似，但是30min后出现明显的区分，参比制剂的溶出速率快，T2次之，T1较慢，导致累积溶出曲线出现差异。对比了溶出开始40min内参比制剂R与T1、T2的微分溶出曲线下面积，结果显示T1、T2的微分溶出曲线下面积显著低于参比制剂R。所以，两受试制剂的溶出行为与参比制剂不一致。

使用低浓度的0.1％Tween8进行体外溶出实验，获得的体外溶出结果与体内试验结果趋势一致。实施例3的体外溶出曲线与实施例2的体内药-时曲线趋势相似，且实施例3的体外溶出曲线在3h的累积释放度比例T2/R(0.83)、T1/R(0.59)与实施例2中体内试验三种制剂AUC比例接近。实施例3的体外溶出曲线也与实施例2体内试验中T1、T2的C

实施例4

测定硝苯地平缓释片体外溶出的方法，具体步骤如下：

1)溶出介质经进液泵作用进入多孔滤膜杯，待多孔滤膜杯和外室溶出杯中溶出介质体积均为75mL时，开启出液泵，进液泵和出液泵的工作频率一致，保持装置内溶出介质的总体积150mL不变；溶出介质为0.1％Tween80的pH 6.8磷酸盐缓冲液，溶出介质温度保持在37℃，多孔滤膜杯外包覆的滤膜孔径为0.45μm；

2)将硝苯地平缓释片置于转篮中，转篮的转速为75rpm，溶出液经滤膜过滤后持续提取溶出液，在固定的时间点测定溶出液中硝苯地平的浓度；

所述固定的时间点为5、10、15、20、30、40、50、60、75、90、120、150、180min，直至硝苯地平缓释片溶出完成；

溶出液的提取速度与溶出介质的补充速度均为6mL/min；

3)采用高效液相测定溶出液中在不同时间点的硝苯地平的含量，将对应时间点和硝苯地平浓度计算后，得到硝苯地平浓度和溶出时间之间的平均微分溶出曲线图，根据微分溶出关系得到累积溶出质量分数与溶出时间之间的累积溶出曲线图。

参比制剂：硝苯地平缓释片，BAYER，批号JPS2392，规格10mg；

受试制剂：硝苯地平缓释片，自制，规格10mg；

在上述溶出条件下，硝苯地平缓释片参比制剂和受试制剂的体外溶出结果如图7-8所示，3h内参比制剂(29.3％)的累积溶出度略高于受试制剂(27.1％)。从10mg硝苯地平缓释片参比制剂和受试制剂平均微分溶出曲线可以看出(图7)，参比制剂溶出开始30min内的释放速度低于受试制剂，此后40-120min内高于受试制剂，150-180min两制剂的释放速度基本一致。

本发明图7-8的体外溶出结果显示，参比制剂比受试制剂的平均累积溶出度高2.2％，若排除操作和仪器误差，可认为两制剂溶出相似(f2＝90.9)。10mg硝苯地平缓释片参比制剂和受试制剂平均微分溶出曲线中，180min点受试制剂的释放速率略高于参比制剂，且按照该趋势两制剂的累积溶出度会逐渐接近。由于硝苯地平为BCS2类药物，溶出为限速步骤，当两制剂的累积释放度一致时，AUC等效的可能性很高。另一方面，10mg硝苯地平缓释片参比制剂和受试制剂平均微分溶出曲线显示，溶出开始40min内受试制剂的微分溶出曲线下面积显著高于参比制剂(图7)。

基于参比制剂和受试制剂的微分溶出曲线，解析两制剂的溶出速率常数k

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。