哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法

摘要

本发明公开的属于睾丸移植小鼠模型建立技术领域，具体为哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法，其包括以下步骤：S1：研究所取用荷斯坦公牛的小牛睾丸，添加冷冻保护剂后于液氮中冻存；S2:将戊巴比妥钠麻醉剂和戊巴比妥钠粉末溶于生理盐水中，完全溶解后用滤器过滤，并在低温条件下保存。该哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法，在未成熟哺乳动物优良种质资源的保护方面具有切实的应用意义，能在有效低温保存睾丸组织的前提下，以5周龄BALB/cNude免疫缺陷小鼠作为移植受体，结合基质胶的促血管生成作用，使得生精周期差异较大的鼠、牛种属间所移植的睾丸组织得以存活并基本保持正常的发育状态。

说明书

技术领域

本发明涉及睾丸移植小鼠模型建立技术领域，具体为哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法。

背景技术

睾丸是具有生精和内分泌功能的重要性腺器官，其内的精原干细胞是雄性生殖力保存和恢复的保障。睾丸组织冷冻保存既可为未成年雄性生殖能力的保存提供新选择，也是保障基因多样性的手段，在生命科学、农业科学和再生医学领域有良好的应用前景。

精子发生的启动与丘脑-垂体-睾丸性腺轴密切相关。在青春期前，由于缺乏内分泌激素的刺激，致使未成熟睾丸中精子发生处于静止状态。因此，将未成熟的睾丸组织移植到丘脑促性腺激素、促性腺激素释放激素、促黄体生成素、卵泡刺激素等分泌水平处于成年状态的受体动物中时，可促进精子发生进程。

冷冻-复苏哺乳动物未成熟睾丸组织的异种异位移植作为体内模型，通过将供体来源的睾丸组织冷冻-复苏处理后移植埋入去势的免疫缺陷小鼠背部皮下，使其存活并继续生长发育。该技术联合睾丸组织冷冻保存不仅是揭示睾丸生理学和雄性生殖细胞发育的有用工具，为转基因动物、突变或克隆动物的研究提供有了利条件，同时对幼龄雄性生殖细胞系的保存提供了新思路，为优良种畜、珍稀及濒危物种种质资源保护提供有价值的方案。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：

哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法，其包括以下步骤：

S1：研究所取用荷斯坦公牛的小牛睾丸，添加冷冻保护剂后于液氮中冻存；

S2:将戊巴比妥钠麻醉剂和戊巴比妥钠粉末溶于生理盐水中，完全溶解后用滤器过滤，并在低温条件下保存；

S3：选取免疫缺陷鼠全身麻醉后仰卧保定，于阴囊处做一微型切口，牵拉睾丸至切口外，钳夹精索将睾丸摘除，镊子在酒精灯火焰上灼烧后将断端烧烙止血，精索和脂肪垫还纳腹腔后缝合切口；

S4：冻存的犊牛睾丸组织于适当温度水浴锅中复苏，并剪切成多个较小组织小块，置于冰上备用；

S5：小鼠俯卧保定后，在脊柱两侧分别做多个微型切口，将冷冻复苏后的犊牛睾丸组织小块植入切口内，并与切口一并缝合固定，每个切口注射一定量基质胶，伤口涂布碘伏消毒，放回笼内密切观察小鼠状态。

作为本发明所述的哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法的优选方案，其中：根据步骤S1：研究所用的小牛睾丸取自1日龄、30日龄的荷斯坦公牛，冷冻保护剂的组成成分包括：75％基础培养基KnockoutDMEM，10％血清替代物KSR，10％二甲基亚砜DMSO，5％青-链霉素，其中青霉素浓度为10000Units/mL，链霉素浓度为10000μg/mL。

作为本发明所述的哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法的优选方案，其中：根据步骤S2：采用2％戊巴比妥钠麻醉剂：2g戊巴比妥钠粉末，同时溶于100mL生理盐水中，通过0.22μm的滤器进行过滤，保存温度维持在4℃。

作为本发明所述的哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法的优选方案，其中：根据步骤S3：采用5周龄BALB/c Nude免疫缺陷鼠，且免疫缺陷鼠体重14-16g，阴囊处做0.5cm切口。

作为本发明所述的哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法的优选方案，其中：根据步骤S4：采用的睾丸组织于37℃水浴锅中复苏，并剪切成1-2mm

作为本发明所述的哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法的优选方案，其中：根据步骤S5：脊柱两侧分别做3个3mm切口，每个切口注射30μL基质胶。

与现有技术相比：添加含有75％基础培养基KnockoutDMEM，10％血清替代物(KSR)，10％二甲基亚砜(DMSO)，5％青-链霉素(其中青霉素浓度为10000Units/mL，链霉素浓度为10000μg/mL)的冷冻保护液后于液氮中冻存犊牛睾丸组织，既避免了胎牛源性血清传播外源性病原体及病毒污染的风险，也可维持完整的睾组织丸结构。此外，采用5周龄去势的BALB/cNude免疫缺陷小鼠作为移植受体，将前述冷冻复苏后的犊牛睾丸组织移植埋入小鼠脊柱两侧的背部皮下，并注射30μL基质胶以促进血管生成。异种异位移植28天后取出供体睾丸，可见生精小管与生殖细胞发育状态与正常的30日龄小牛睾丸的生理状态基本同步，该哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法，在未成熟哺乳动物优良种质资源的保护方面具有切实的应用意义，能在有效低温保存睾丸组织的前提下，以5周龄BALB/cNude免疫缺陷小鼠作为移植受体，结合基质胶的促血管生成作用，使得生精周期差异较大的鼠、牛种属间所移植的睾丸组织得以存活并基本保持正常的发育状态。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1 BALB/c Nude免疫缺陷鼠去势建模示意图(A麻醉B去势)；

图2 BALB/c Nude免疫缺陷鼠背部皮下移植犊牛睾丸组织建模示意图；

图3移植28天的牛睾丸组织移植物图片；

图4犊牛的睾丸组织HE切片(400X)；

图5移植28天后的睾丸组织HE切片(400X)；

图6正常发育的低温冻存30日龄小牛睾丸组织切片(400X)；

图7荧光定量PCR检测牛睾丸中各级生精细胞相关标记基因相对表达量；

图8荧光定量PCR检测牛睾丸中各体细胞相关标记基因相对表达量。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。

本发明提供哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法，在未成熟哺乳动物优良种质资源的保护方面具有切实的应用意义，能在有效低温保存睾丸组织的前提下，以5周龄BALB/cNude免疫缺陷小鼠作为移植受体，结合基质胶的促血管生成作用，使得生精周期差异较大的鼠、牛种属间所移植的睾丸组织得以存活并基本保持正常的发育状态，请参阅图1-图8；

请再次参阅图1-图8：

S1：研究所用的小牛睾丸取自1日龄、30日龄荷斯坦公牛，添加冷冻保护剂(75％基础培养基KnockoutDMEM，10％血清替代物KSR，10％二甲基亚砜DMSO，5％青-链霉素，其中青霉素浓度为10000Units/mL，链霉素浓度为10000μg/mL)后于液氮中冻存；

S2:2％戊巴比妥钠麻醉剂：2g戊巴比妥钠粉末溶于100mL生理盐水中，完全溶解后用0.22μm的滤器过滤，4℃条件下保存；

S3：5周龄BALB/cNude免疫缺陷鼠(体重14-16g)全身麻醉后仰卧保定，于阴囊处做一0.5cm的切口，牵拉睾丸至切口外，钳夹精索将睾丸摘除。镊子在酒精灯火焰上灼烧后将断端烧烙止血，精索和脂肪垫还纳腹腔后缝合切口；

S4：冻存的犊牛睾丸组织于37℃水浴锅中复苏，并剪切成1-2mm

S5：小鼠俯卧保定后，在脊柱两侧分别做3个约3mm的切口，将冷冻复苏后的犊牛睾丸组织小块植入切口内，并与切口一并缝合固定，每个切口注射30μL基质胶，伤口涂布碘伏消毒，放回笼内密切观察小鼠状态。

请再次参阅图1-图8，其中：图1、图2为睾丸组织异种异位移植建模示意图；图1为BALB/cNude免疫缺陷鼠去势建模示意图，在图1中，A为BALB/cNude免疫缺陷鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠麻醉并仰卧保定示意图，B为去势后阴囊切口缝合示意图；图2为BALB/cNude免疫缺陷鼠背部皮下移植犊牛睾丸组织建模示意图，分别在脊柱两侧背部皮下约3mm的切口植入犊牛睾丸组织并缝合切口。

图1-图8所示的图片及检测结果可见，本发明中犊牛睾丸组织异种异位移植建模成功。其中，图3为移植28天的牛睾丸组织移植物图片，在移植组织周围可见血管网；图4为犊牛的睾丸组织HE切片(400X)，曲细精管直径较小且生精上皮包含1-2层细胞；图5为移植28天后的睾丸组织HE切片(400X)，曲细精管直径较未移植前扩增，且生精上皮结构与正常发育的30日龄小牛相似(图6)，疏松结缔组织细胞间质丰富，睾丸间质可见血管结构；图6为正常发育的低温冻存30日龄小牛睾丸组织切片(400X)，冷冻复苏后的睾丸组织结构完整；图7为荧光定量PCR检测牛睾丸组织中精原干细胞标记基因(GFRα-1)，精原干细胞分化标记基因(C-KIT)，生精细胞减数分裂标记基因(SYCP3)的相对表达量。其中，GFRα-1基因在犊牛对照与D28移植物的相对表达量无明显差异，但显著低于正常发育的30日龄小牛睾丸组(P<0.05)；D28移植物C-KIT基因的相对表达量显著高于犊牛对照组(P<0.01)，但与正常发育的30日龄小牛睾丸组无显著差异；SYCP3基因在D28移植物与正常发育的30日龄小牛睾丸组的相对表达量无明显差异(“*”表示差异显著(P<0.05)，“**”表示差异极显著(P<0.01)，“ns”表示无统计学意义)；图8为荧光定量PCR检测牛睾丸组织中支持细胞标记基因(SOX9)，管周肌样细胞标记基因(ACTA2)，间质细胞标记基因(STAR)的相对表达量。其中，D28移植物SOX9基因的相对表达量显著高于犊牛对照组(P<0.01)，但与正常发育的30日龄小牛睾丸组无显著差异；ACTA2基因与STAR基因的相对表达量在前述三组中并无显著差异(“**”表示差异极显著(P<0.01)，“ns”表示无统计学意义)这表明D28移植物中生精细胞在相关基因水平启动分化机制，且与正常的小牛睾丸发育状态保持一致。

结合图和数据进行补充说明，以证明技术效果：本发明在未成熟哺乳动物优良种质资源的保护方面具有切实的应用意义，能在有效低温保存睾丸组织的前提下，以5周龄BALB/cNude免疫缺陷小鼠作为移植受体，结合基质胶的促血管生成作用，使得生精周期差异较大的鼠、牛种属间所移植的睾丸组织得以存活并基本保持正常的发育状态。

虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。