双鸟苷酸环化酶抑制剂在抑制革兰氏阴性菌药物中的应用及抑菌药物

摘要

本发明涉及一种双鸟苷酸环化酶抑制剂在抑制革兰氏阴性菌药物中的应用及抑菌药物，所述双鸟苷酸环化酶抑制剂包括依布硒或依布硒类似物中的一种，所述双鸟苷酸环化酶抑制剂在不影响细菌的生长曲线的浓度下，降低抗生素对细菌的最小抑菌浓度。与现有技术相比，本发明利用双鸟苷酸环化酶抑制剂与抗生素的协同作用，大大提高了抗生素抑制革兰氏阴性耐药菌的能力，提供了一种新的杀菌抑菌方法，与单纯依靠抗生素抑制革兰氏阴性耐药菌的结果相比，本发明具有更好的抑菌效果，并可发展其类似物来杀菌抑菌，具有大规模推广的前景。

说明书

技术领域

本发明涉及杀菌抑菌药物领域，尤其是涉及一种双鸟苷酸环化酶抑制剂在抑制革兰氏阴性菌药物中的应用及抑菌药物。

背景技术

细菌耐药性严重危害世界公众健康、造成巨大经济损失。抗生素的过度使用和滥用引发了细菌耐药性的产生。一些常见的革兰氏阴性耐药菌，如产超广谱β内酰胺酶大肠杆菌、多重耐药铜绿假单胞菌等，不加以严格的控制和管理，将会成为最具威胁的耐药菌。据悉，在近50年来，没有新种类的抗生素被认可用于抑制革兰氏阴性细菌。抗生素的发展已经追赶不上细菌的进化和耐药性的产生。因此新的杀菌、抑菌方法至关重要。

目前越来越多的抑菌新方法是基于细菌本身代谢情况，通过改变细菌代谢水平达到杀菌目的。如外源添加碳源化合物扰乱中心碳代谢、抑制合成细胞壁的脂多糖组装相关的功能蛋白等可以辅助抗生素，提高杀菌的效果。一些基于无机材料的杀菌方法如纳米银，虽然具有很好的杀菌效果和高的持久性，但是材料本身的价格和加工要求相对较高。此外纳米银会对神经、皮肤等产生毒性，不适用于体内治疗。天然的抗菌剂如壳聚糖等虽然安全无害，但是加工困难，使用寿命短。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种双鸟苷酸环化酶抑制剂在抑制革兰氏阴性菌药物中的应用及抑菌药物，利用小分子抑制剂来抑制细菌耐药性形成相关的酶活性，从而辅助提高抗生素的杀菌能力。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一个目的是保护一种双鸟苷酸环化酶抑制剂在抑制革兰氏阴性菌药物中的应用。

进一步地，所述双鸟苷酸环化酶抑制剂包括依布硒或依布硒类似物中的一种。依布硒可以通过在硒和半胱氨酸残基中的硫醇之间形成共价键来抑制蛋白质活性，还可以通过其剩余的化学支架改变蛋白质活性。因此满足具有合适支架结构、且可与双鸟苷酸环化酶的半胱氨酸残基进行共价修饰的依布硒类似物均可能作为抑制剂。

进一步地，所述双鸟苷酸环化酶抑制剂在不影响细菌的生长曲线的浓度下，降低抗生素对细菌的最小抑菌浓度。

进一步地，所述不影响细菌生长曲线的双鸟苷酸环化酶抑制剂浓度由以下步骤获得：

S1：配制抗生素和双鸟苷酸环化酶抑制剂储备液；

S2：将双鸟苷酸环化酶抑制剂释成一系列浓度；

S3：在多孔板中对细菌进行培养，将S2中得到的双鸟苷酸环化酶抑制剂依次加入有菌液的孔中，作为一系列实验组，同时设置对照组，对细菌进行孵育；

S4：使用酶标仪在间隔时间对S3中的所有实验组和对照组进行数据采集，绘制不同浓度双鸟苷酸环化酶抑制剂下的细菌生长曲线，获得对细菌生长无影响的双鸟苷酸环化酶抑制剂浓度。

进一步地，所述双鸟苷酸环化酶抑制剂阻碍革兰氏阴性菌的生物膜的形成，以此降低抗生素对细菌的最小抑菌浓度，所述最小抑菌浓度的获取过程为：

S5：通过二倍稀释法将S1中得到的抗生素溶液稀释成一系列的浓度，用于抗生素敏感性测试；

S6：在多孔板中对细菌进行培养，将S5中得到的抗生素依次加入有菌液的孔中，并依次加入S4中所得浓度的双鸟苷酸环化酶抑制剂作为一系列实验组，同时设置对照组，对细菌进行孵育；

S7：使用酶标仪对S6中实验组和对照组的最小抑菌浓度进行判定。

进一步地，所述革兰氏阴性菌为产超广谱β内酰胺酶大肠杆菌。

进一步地，所述抑制革兰氏阴性菌药物为β内酰胺类抗生素。

进一步地，所述抗生素为头孢曲松钠，所述不影响细菌生长曲线的双鸟苷酸环化酶抑制剂浓度为：小于等于100μM。

进一步地，在100μM依布硒的协同作用下，头孢曲松钠对产超广谱β内酰胺酶大肠杆菌的MIC值为0.32mg mL

进一步地，S2中采用的稀释剂为二甲基亚砜。

进一步地，S3中细菌浓度为1～8×10

进一步地，S3中对照组不含双鸟苷酸环化酶抑制剂，为与实验组双鸟苷酸环化酶抑制剂相同体积的二甲基亚砜。

进一步地，S4中吸光度OD

进一步地，S6中对照组不含双鸟苷酸环化酶抑制剂，为与实验组双鸟苷酸环化酶抑制剂相同体积的二甲基亚砜。

本发明的第二个目的是保护一种针对革兰氏阴性菌的抑菌药物，其特征在于，所述杀菌药物成分包括上述的双鸟苷酸环化酶抑制剂、抗生素以及药学上可接受的辅料和载体。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1)本发明确定了不会影响细菌生长的依布硒的浓度，证实了杀菌效果来自于双鸟苷酸环化酶抑制剂与抗生素的协同作用，而非双鸟苷酸环化酶抑制剂本身。

2)本发明利用双鸟苷酸环化酶抑制剂与抗生素的协同作用，大大提高了抗生素抑制革兰氏阴性耐药菌的能力，提供了一种新的杀菌抑菌方法。

3)本技术方案中所使用的双鸟苷酸环化酶抑制剂依布硒本身是一种应用于临床上的新型抗炎药，但本技术方案发现了其新用途，可发展其类似物来杀菌抑菌，具有大规模推广的前景。

4)本发明中所使用的细菌药敏感性试验操作步骤成熟、成本低，所需耗材容易获得。

附图说明

图1为实施例1中使用双鸟苷酸环化酶抑制剂与抗生素协同杀菌的实验流程示意图。

图2为最优浓度依布硒与无依布硒存在时的产超广谱β内酰胺酶大肠杆菌生长曲线。

图3为最优浓度依布硒降低头孢曲松钠对产超广谱β内酰胺酶大肠杆菌的MIC值。

具体实施方式

本发明的构思起源是基于细菌的双鸟苷酸环化酶能够促进细菌生物被膜生成。而生物被膜是阻碍杀菌的一大障碍。利用双鸟苷酸环化酶抑制剂，如依布硒，抑制其活性，可以阻碍生物膜的形成，从而增加抗生素的杀菌效果。

本技术方案通过双鸟苷酸环化酶抑制剂存在下的细菌培养实验，筛选对细菌生长无影响的最优抑制剂浓度。使用微量稀释法进行细菌敏感性实验，在相同培养基、相同细菌种类及浓度的条件下，比较添加最优浓度的双鸟苷酸环化酶抑制剂与不含抑制剂的抗生素最小抑菌浓度(MIC)结果，从而反映双鸟苷酸环化酶抑制剂协同抗生素杀菌的效果。与单纯依靠抗生素抑制革兰氏阴性耐药菌的结果相比，本发明具有更好的抑菌效果。

本技术方案中不影响细菌生长曲线的双鸟苷酸环化酶抑制剂浓度由以下步骤获得：

S1：配制抗生素和双鸟苷酸环化酶抑制剂储备液；

S2：将双鸟苷酸环化酶抑制剂释成一系列浓度；

S3：在多孔板中对细菌进行培养，将S2中得到的双鸟苷酸环化酶抑制剂依次加入有菌液的孔中，作为一系列实验组，同时设置对照组，对细菌进行孵育；

S4：使用酶标仪在间隔时间对S3中的所有实验组和对照组进行数据采集，绘制不同浓度双鸟苷酸环化酶抑制剂下的细菌生长曲线，获得对细菌生长无影响的双鸟苷酸环化酶抑制剂浓度。

本技术方案中双鸟苷酸环化酶抑制剂阻碍革兰氏阴性菌的生物膜的形成，以此降低抗生素对细菌的最小抑菌浓度，所述最小抑菌浓度的获取过程为：

S5：通过二倍稀释法将S1中得到的抗生素溶液稀释成一系列的浓度，用于抗生素敏感性测试；

S6：在多孔板中对细菌进行培养，将S5中得到的抗生素依次加入有菌液的孔中，并依次加入S4中所得浓度的双鸟苷酸环化酶抑制剂作为一系列实验组，同时设置对照组，对细菌进行孵育；

S7：使用酶标仪对S6中实验组和对照组的最小抑菌浓度进行判定。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

本实施例提供一种结合头孢曲松钠和双鸟氨酸环化酶抑制剂依布硒协同作用提高抗生素抑制产超广谱β内酰胺酶大肠杆菌的实验过程，包括以下步骤：

培养基的配制：按购置的胰蛋白胨大豆肉汤培养基的说明，称取一定量的培养基干粉，加入一定体积的去离子水，进行高温灭菌处理。

依布硒储备液的配制：使用二甲基亚砜配成10mM储备液并稀释成500μM，100μM，50μM，10μM等浓度。

细菌悬液配制：吸取产超广谱β内酰胺酶大肠杆菌的培养液，由酶标仪(OD

生长曲线测定加样：各吸取100μL胰蛋白胨大豆肉汤加到96孔板样品孔中，再分别加入不同浓度的依布硒，使其系列浓度为500μM，100μM，50μM，10μM，0μM(仅为溶剂二甲基亚砜)，最后吸取10μL稀释好的细菌悬液加入到各孔中。

生长曲线测定：使用酶标仪(OD

头孢曲松钠储备液的配制：使用无菌水配成100mg mL

MIC测定加样：各吸取100μL包含不同浓度的头孢曲松钠的胰蛋白胨大豆肉汤分别加到96孔板样品孔中，再分别加入1.1μL 10mM依布硒(终浓度为100μM)，最后各吸取10μL稀释好的细菌悬液加入到含工作液的孔中和对照组孔中。

培养：将加好样的96孔板在37℃培养箱中培养18～20小时。

最小抑菌浓度检测：使用酶标仪(OD

上述实施例仅通过依布硒结合头孢曲松钠协同抑制产超广谱β内酰胺酶大肠杆菌的影响进行举例说明，本发明同样适用于协同其他抗生素和抑制其他革兰氏阴性耐药菌。几乎所有细菌在一定条件下都能产生生物膜，阻止抗生素进入内部，从而有足够的时间进化出耐药基因。双鸟苷酸环化酶助力于生物膜的生成，存在于多种革兰氏阴性细菌中，如铜绿假单胞菌等。通过抑制生物膜的形成，各种杀菌机理包括抑制蛋白合成、抑制细胞壁合成、抑制核酸合成等的抗生素可以无阻碍的到达目标位点，发挥出高效的杀菌作用。因此，本发明具有一定的普适性。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。