强心合剂在制备通过DCM心肌细胞自噬机制而阻断DCM的药物中的用途

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种强心合剂在制备通过DCM心肌细胞自噬机制而阻断DCM的药物中的用途，本发明通过构建DCM大鼠模型，检测大鼠血糖血脂变化，检测AMPK‑mTOR信号通路及其下游线粒体自噬特异蛋白TSC2、RHEB及心肌细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3‑I、LC3‑II等表达情况，证实了所述强心合剂通过激发AMPK‑mTOR介导DCM心肌细胞自噬机制而起到阻断DCM进程的用途，为DCM的治疗提供了新的途径。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种强心合剂在制备通过DCM心肌细胞自噬机制而阻断DCM的药物中的用途。

背景技术

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者，尤其是2型糖尿病患者致死的主要原因之一。糖尿病患者代谢紊乱，高血糖、高血脂使心肌缺血，氧化应激增强，糖尿病心肌病是指在代谢紊乱及微血管病变的基础上引发心肌壁内微血管损伤、血管周边及间质出现纤维化等改变，从而出现亚临床的心脏功能异常，并最终进展为心率失常、心源性体克及心力衰竭，重症患者甚至发生猝死。目前，糖尿病心肌病已得到证实并被视为糖尿病独立的并发症。一些临床资料表明，在糖尿病确诊之前高血糖就已经促使心血管发生病变，且糖尿病患者心血管疾病的预后能力很差，病死率极高。近年来糖尿病并发症迅速增加，已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。

糖尿病心肌病是最严重的糖尿病并发症且机制不明。高血糖是导致糖尿病心肌损伤的主要原因之一。最新文献表明，高血糖、高血脂导致的心肌损伤与自噬水平有关，长期慢性高血糖和高血脂状态对心肌细胞线粒体功能有显著的损害作用，即所称之为“糖毒性”和“脂毒性”。线粒体是细胞活动的主要供能场所，是物质代谢和能量转化的中心站，机体所有氧化磷酸化过程均在线粒体内进行。糖类代谢紊乱会导致心脏中的能量代谢途径发生变化，血液中的脂类物质蓄积，形成的过氧化物和超氧化物急剧增加，超出机体清除能力，导致体内氧化作用和抗氧化作用失衡引起的一系列反应，常伴有ROS产生增加和/或抗氧化防御系统功能损伤，过量ROS可诱导线粒体膜通透性转换孔(mitochondrialpermeabilitytransitin pore，MPTP)开放，引起线粒体肿胀、破裂、释放细胞色素C(eytochromec)、破坏线粒体结构，导致线粒体损伤。线粒体是通过三羧酸循环和氧化磷酸化合成ATP为生命活动提供直接能量，线粒体受损，则ATP合成不足。

AMPK(adenosine monophosphate activated protein kinase)广泛存在于真核细胞中，可调节糖类、脂类等的分解与合成，AMPK是细胞中一个能感受能量状态并调节代谢的蛋白激酶，在自噬调控中发挥作用。当ATP合成减少时，AMP/ATP比值增加，丝氨酸/苏氨酸激酶LKB1直接磷酸化激活AMPK，磷酸化TSC2，进而抑制mTORC1活性，引起自噬的发生。同时，AMPK也可不经过TSC而直接磷酸化抑制mTORC1复合体亚基Raptor增强自噬。心肌细胞自噬过程中，Beclin1是形成自噬体的必需分子，作为分子反应“平台”，使自噬相关蛋白定位于吞噬泡，并与多种蛋白反应调控自噬体形成与成熟。心肌细胞自噬还通过自噬相关基因Atg控制，Atg12-Atg5,Atg8(微管相关蛋白轻链3，LC3)是两个蛋白结合系统，这两个过程相互偶联，相互影响。LC3是Atg8的同源蛋白，在细胞发生自噬时，Atg8的碳端去除22个氨基酸，形成LC3-II，结合到细胞膜磷脂，因其过程只发生在新发生的自噬体上，LC3-I向LC3-II的转化率与自噬的活性正相关，形成自噬体。DM(糖尿病)进展为DCM的病理生理机制复杂，氧化应激、线粒体损伤、细胞通路的激活、心肌细胞自噬及其相关的靶点药物开发是当前的研究热点。如何完善心肌细胞自噬及其DCM发病机制对DCM的治疗具有十分重大的意义。

在中医理论中，有学者认为，细胞一旦启动自噬程序，必定是在机体接受到了外界环境的致病因素-外邪，或机体内部产了突发性的应激，如铁血缺氧、情志刺激、压力或危机等应漱因素。自噬的发生与中医的气虚、痰瘀关系密切。中气虚与细胞铗乏ATP、氨基睃等能供给所处的“饥饿状态”相一致，如中医“谷不入，半日则气衰，一日则气少.糖尿病心肌病初期，氧化应激增强，细胞自噬增加，必然导致病理性代谢产物堆积，超过细胞自噬对微环境病理产物的清除负荷，导致细胞死亡。而细胞微环境过多的病理性代谢产物积聚与中医湿浊痰瘀密切相关。糖尿病心肌病后期，自噬相对或绝对不足导致病理性代谢产物的过多沉.积，我们认为是中医湿浊痰瘀在细胞微观层面上的体现。细胞自噬通过清除及防止细胞内积聚的病理产物，并将“废物重新利用”，这与中医促进“废物”向能量转化的“精化气”功能及滥阳化气行水、化痰祛瘀给邪气以出路，以此达到阴阳平衡相一致。因此，本申请认为，温阳活血利水法可能正是通过协调心肌细胞自噬达到阻断DCM的形成。

然而，现有技术并未发现具体哪种药物可以阻断DCM的形成，也不清楚阻断DCM的形成的原理。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种强心合剂在制备通过DCM心肌细胞自噬机制而阻断DCM的药物中的用途。

本发明的目的是提供一种强心合剂在制备通过DCM心肌细胞自噬机制而阻断DCM的药物中的用途，所述强心合剂的组方如下：制附片10-15g、炙黄芪20-25g、桂枝10-15g、丹参20-25g、桃仁10-15g、红花10-15g、茯苓20-25g、益母草15-20g、泽兰10-15g、五加皮10-15g、葶苈子10-15g、北山楂20-25g、白芍20-25g、生姜6-12g、大枣10-18g。

优选的，上述强心合剂在制备通过DCM心肌细胞自噬机制而阻断DCM的药物中的用途，所述强心合剂的组方如下：制附片10g、炙黄芪20g、桂枝10g、丹参20g、桃仁10g、红花10g、茯苓20g、益母草15g、泽兰10g、五加皮10g、葶苈子10g、北山楂20g、白芍20g、生姜6g、大枣15g。

优选的，上述强心合剂在制备通过DCM心肌细胞自噬机制而阻断DCM的药物中的用途，所述强心合剂用于制备降血糖、降甘油三酯的药物。

优选的，上述强心合剂在制备通过DCM心肌细胞自噬机制而阻断DCM的药物中的用途，所述强心合剂用于制备降低总胆固醇、降低低密度脂蛋白胆固醇的药物。

优选的，上述强心合剂在制备通过DCM心肌细胞自噬机制而阻断DCM的药物中的用途，所述强心合剂用于制备升高高密度脂蛋白胆固醇的药物。

优选的，上述强心合剂在制备通过DCM心肌细胞自噬机制而阻断DCM的药物中的用途，所述强心合剂用于制备升高血清胰岛素药物。

优选的，上述强心合剂在制备通过DCM心肌细胞自噬机制而阻断DCM的药物中的用途，所述强心合剂用于制备AMPK、Beclin1、TSC2、LC3-II表达促进剂。

优选的，上述强心合剂在制备通过DCM心肌细胞自噬机制而阻断DCM的药物中的用途，所述强心合剂用于制备RHEB、LC3-I、mTOR表达抑制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明所使用的强心合剂已经临床应用20多年。该方药拟法《素问至真要大论》中言:“寒淫于内，治以甘热，佐以苦辛，以咸泻之，以辛润之，以苦坚之。寒淫所胜，平以辛热，佐以苦甘，以咸泻之。”以纯阳温热之附子大振阳气，炙黄芪补气升阳，两者合而为君药；桂枝温通助阳化气；丹参、桃仁、红花三药活血祛瘀以促新生血；益母草、泽兰活血利水两效并兼；葶苈子、茯苓、五加皮利水渗湿，兼调补与水液代谢关系密切之肺、脾、肾三脏，且各有侧重；山楂祛瘀化食，固扶中焦胃气；佐以白芍、制附子、桂枝等药热毒之性，酸甘化阴使利中有养；生姜、大枣调和脾胃。方中附子配伍甘补扶弱之品黄芪可固本以制其毒。附子温经扶阳，散寒止痛，助卫固表；桂枝有升无降，温阳化气，解肌通经:附桂配伍能起到温阳通经散寒的协同作用。黄芪甘温益气，实卫固表；桂枝辛散温通透达营卫，温通经脉，助阳化气，横走于四肢以温经脉：二者相伍相辅相成，寓通于补，疏通经脉，标本兼顾，祛邪而不伤正，共奏通经络、利血脉之功。桂枝温化水湿，温膀胱之气，与茯苓配伍，温运脾阳，化湿.利水，助膀胱气化利水。红花质轻长浮，走外达上，通经达络，长于祛在经络.之瘀血:而桃仁质重而降，偏入里善走下焦，长于破脏腑瘀血:相须配对后祛瘀力增强，作用范围扩大，适用于全身各部瘀血。诸药组合成方，内合真武汤、五苓散、葶苈大枣泻肺汤等方之意，为温阳活血利水之剂。

2、本发明证实了上述温阳活血利水法组方之强心合剂治疗DCM有良好的临床疗效。本发明通过构建DCM大鼠模型，检测大鼠血糖血脂变化，检测AMPK-mTOR信号通路及其下游线粒体自噬特异蛋白TSC2、RHEB及心肌细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3-I、LC3-II等表达情况，证实了所述强心合剂通过激发AMPK-mTOR介导DCM心肌细胞自噬机制而起到阻断DCM进程，为DCM的治疗提供了新的途径。

附图说明

图1为HE染色结果(400×)；

A-F分别为正常对照组、DCM模型组、强心合剂高剂量组、强心合剂中剂量组、强心合剂低剂量组、卡托普利对照组样品；

图2为透射电子显微镜观察结果；

A-F分别为正常对照组(20000×)、DCM模型组(20000×)、强心合剂高剂量组(20000×)、强心合剂中剂量组(20000×)、强心合剂低剂量组(10000×)、卡托普利对照组(20000×)样品；

图3是免疫组化染色的AMPK蛋白表达情况(100×)；

图4是免疫组化染色的mTOR蛋白表达情况(100×)；

图5是免疫组化染色的TSC2蛋白表达情况(100×)；

图6是免疫组化染色的RHEB蛋白表达情况(100×)；

图7是免疫组化染色的Beclin1蛋白表达情况(100×)

图8是免疫组化染色的LC3-I蛋白表达情况(100×)；

图9是免疫组化染色的LC3-Ⅱ蛋白表达情况(100×)；

图3-9中，A-F分别为正常对照组、DCM模型组、强心合剂高剂量组、强心合剂中剂量组、强心合剂低剂量组、卡托普利对照组样品；

图10是大鼠心脏组织AMPK、LC3-I、LC3-II的Western Blot图；

图11是大鼠心脏组织的Beclin1、mTOR、TSC2、Western Blot图；

图10和图11中，1-6分别表示正常对照组、DCM模型组、强心合剂高剂量组、强心合剂中剂量组、强心合剂低剂量组、卡托普利对照组样品；

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。

1材料与方法

1.1动物

选取8周龄Sprague-Dawley大鼠120只，雌雄各半，体重140±20g，购置于江西师范大学实验动物中心，实验动物合格证号:SCXK赣2009-0002，实验动物使用许可证:SYKG赣2009-2005。分笼饲养，每笼5只。室温18-22℃，相对湿度45-65％。实验涉及动物的词养和实验过程中都遵守了江西师范大学实验动物管理与保护的有关准则。

1.2模型复制与动物分组

将120只大鼠适应性喂养一周后，随机分出正常对照组20只，正常对照组给予标准大鼠饲料喂养(购自南昌大学实验动物中心)，其热量比例为碳水化合物热卡占60％，脂肪热卡占11％，蛋白质热卡占29％。其余100只实验组大鼠给予高脂高热量饲料喂养，其热量及营养成分比例为：碳水化合物热卡占40％，脂肪热卡占42％，蛋白热卡占18％；高脂高热量饲料含10％熟猪油，20％蔗糖，2.5％胆固醇，1％胆酸盐，66.5％常规饲料。每天记录进食量及饮水量，每周测体重、更换垫料。所有大鼠实验期间自由进食、饮水。

饲养8周后，大鼠禁食12小时后，实验组大鼠给予链尿佐菌素(Streptozotocin,STZ)30mg/kg一次性腹腔注射，STZ溶于灭菌的0.1mmol/L pH 4.2的柠檬酸缓冲液中，浓度2％(w/v)。正常对照组大鼠给予相同剂量的0.1mmol/L pH 4.2柠檬酸缓冲液腹腔注射。2周后，行葡萄糖耐量实验，葡萄糖灌胃2.0g/kg体重，于灌胃前0min、灌胃120min分别自内眦静脉采血0.5-1m，测血糖。空腹血糖≥7.8mmol/L和/或餐后两小时血糖≥11.1mmol/L为糖尿病模型动物。适应性喂养2周后，将糖尿病模型构建成功大鼠随机分为DCM模型组、强心合剂高剂量组、中剂量组、低剂量组、卡托普利对照组。

1.3给药

强心合剂：制附片10g、炙黄芪20g、桂枝10g、丹参20g、桃仁10g、红花10g、茯苓20g、益母草15g、泽兰10g、五加皮10g、葶苈子10g、北山楂20g、白芍20g、生姜10g、大枣5g。

强心合剂高剂量组、中剂量组、低剂量组对应的强心合剂高中低剂量分别是：强心合剂高剂量为3g·kg体重

各组均治疗8周。

1.4标本采集

每周称量体重一次，每组动物均于实验12周末及实验结束时内眦静脉取血。于头晚开始禁食水12小时后，眼内眦静脉采血，EDTA抗凝，分离血清，用于测空腹血糖、空腹血清胰岛素及甘油三酯水平。

结果参见下表1，结果显示，DCM模型组血糖水平明显升高，空腹血清胰岛素水平明显降低；强心合剂治疗的各组和卡托普利治疗的组可以改善DCM导致的血糖、空腹血清胰岛素变化，且强心合剂高剂量组的疗效优于西药卡托普利组。

表1各组血糖、空腹胰岛素及血脂水平

注:与正常对照组比较，P*＜0.01；与DCM模型组比较，P

1.5药品及一般试剂

链尿佐菌素为美国Sigma公司生产，血糖(blood glucose，BG)、胆固醇(cholesterin，CH)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)测定试剂盒均购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。抗β-actin、AMPK、mTOR、TSC2、RHEB、Beclin1、LC3-I、LC3-II抗体及相应二抗均够自美国Sigma公司。卡托普利片剂够自中美上海施贵宝制药有限公司。

1.6引物核苷酸序列

根据GenBank登录的β-actin、AMPK、mTOR、Beclin1、LC3核苷酸序列涉及引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表2引物核苷酸序列

1.7数据统计方法

采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料以均数+标准差(x+S)。

2实验结果

2.1生化指标检测能测定

血生物化学指标测定：心脏取血后，测定总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。结果参见下表3，结果显示，强心合剂可以抑制DCM模型中造成的TG、TC、LDL-C水平升高，可以缓解DCM模型中造成的HDL-C水平降低，且强心合剂高剂量组的疗效优于西药卡托普利。

表3各组TG、TC、HDL-C、LDL-C水平(

注:与正常对照组比较，P

2.2病理形态学检测

将10％中性福尔马林溶液固定24h的心肌标本取出，经脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋。载玻片以重铬酸钾浓硫酸清洁液浸泡24h，依次用自来水，蒸馏水清洗，37℃烘干，明胶化处理后备用。包埋石蜡块常规4μm连续切片，捞片，60℃烘片机干燥备用。切片以100％二甲苯脱蜡10min×2次，无水乙醇漂洗5min，95％，80％，70％酒精依次浸泡3min，PBS和蒸馏水各漂洗2min×3次；将以上制备好的组织切片进行常规HE染色。结果参见图1，HE染色结果显示，正常对照组大鼠心肌结构正常，肌纤维整齐排列，胞浆着色均匀，胞核大小均一，呈圆形或椭圆形，位于细胞中央；而DCM模型组可见心肌纤维排列紊乱，不规则，强心合剂高、中剂量组心肌结构均得到改善，肌纤维排列较紧密整齐。西药卡托普利对照组与强心合剂低剂量组大鼠心肌纤维排列不规整，部分肌纤维断裂。

2.3透射电子显微镜观察心肌细胞超微结构

电镜标本制作：①固定：用0.2M PBS漂洗15min只4次，再用1％0504固定1.5h，用0.2M PBS漂洗15min；②脱水：梯度丙酮50％、70％、90％、100％中脱水各15min×2；③渗透：100％丙酮:环氧树脂(1:I，v/v)2h，然后100％丙酮：环氧树脂(1:I，v/v)2h，再纯环氧树脂3h以上，可过夜；④包埋：先滴1滴环氧树脂至塑料胶囊，再将样品挑入囊底、插入标签，灌满环氧树脂，用针尖调整样品至合适位置，放入恒温箱60℃聚合12h；⑤切片：半薄切片，厚1.0-2.0mm，2％甲苯胺蓝染色，在光镜下观察，确定心肌细胞。⑥透射电镜观测及拍照。结果参见图2。电镜观察心肌超微结构显示：正常对照组大鼠心肌细胞超微结构正常，肌纤维排列整齐规则较紧密，闰盘结构完整，排列规则，肌小节较清晰，线粒体较丰富；DCM模型组大鼠心肌纤维排列较紊乱，部分肌纤维破坏，肌小节排列不整齐，闰盘结构不可见，肌小节破坏，线粒体较少，胞浆内有空洞。强心合剂高剂量组心肌纤维排列整齐、闰盘结构清楚，线粒体丰富，可见大量自噬溶酶体。强心合剂中剂量组大鼠心肌纤维排列较整齐，偶见肌纤维排列松散，线粒体较丰富，可见少量自噬溶酶体。强心合剂低剂量组组和卡托普利对照组大鼠心肌纤维排列紊乱，肌小节破坏，肌纤维破坏，线粒体较少，部分线粒体破坏，部分区域结构尚可。未见自噬溶酶体。

2.4免疫组化法检测心肌组织AMPK、mTOR、TSC2、RHEB、Beclin1、LC3-I、LC3-II蛋白表达

防脱切片经过常规脱蜡、脱水；2％EDTA高温修复20min冷却后PBS冲洗；3％H

2.5ELISA法检测血清AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶，AMPK)、TSC2、RHEB、Beclin1、LC3-I、LC3-II表达

实验大鼠治疗后第6周末抽取外周血3ml，3000r/min离心10min，分离血浆置于-20℃冰箱中备检。采用ELISA法，所有标本收集完后一次进行测定。检测过程按试剂盒说明进行操作，得出AMPK、TSC2、RHEB、Beclin1、LC3-I、LC3-II的浓度。

实验操作均严格按试剂盒说明书上操作，包括以下步骤：

第一步，取出酶标板，依照次序对应分别加入100μl的标准品于空白微孔中；

第二步，分别标记样品编号，加入100μl样品于空白微孔中；

第三步，在标准品孔和样品孔中加入50μl的酶标记溶液；

第四步，37℃孵育反应60min；

第五步，洗板机清洗5次，每次静置10-20s；

第六步，每孔加入底物A、B液各50μl；

第七步，37℃下避光孵育15min；

第八步，每孔加入50μl终止液，终止反应。

然后放入酶标仪自动监测，读出数据，记录数据，进行分析。结果参见下表4，结果显示，DCM模型组AMPK、TSC2、Beclin1、LC3-II水平明显升高，RHEB、LC3-I水平明显降低；强心合剂治疗的各组和卡托普利治疗的组可以改善DCM导致的AMPK、TSC2、RHEB、Beclin1、LC3-I、LC3-II变化，且强心合剂高剂量组的疗效由于西药卡托普利。其中，三个中药组和一个西药组均可提升Beclin1表达量，这对患者病情的治疗都是有益的。

表4各组AMPK、TSC2、RHEB、Beclin1、LC3-I、LC3-II水平(

注：上表中，与正常对照组比较，P*＜0.01；P**＜0.05；与DCM模型组比较，P

2.6Western Blot检测心肌组织AMPK、mTOR、TSC2、Beclin1、LC3-I、LC3-Ⅱ蛋白含量

用细胞蛋白裂解液裂解细胞后提取细胞蛋白，Bio-Rad法测定蛋白含量。取蛋白30μg作SDS-PAGE电泳，将蛋白样本转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。转膜后，膜用5％脱脂奶粉封闭1～1.5h，PBST洗3次，加入抗β-actin，AMPK，mTOR，TSC2，RHEB，Beclin1，LC3-I，LC3-Ⅱ多克隆抗体，4℃过夜。分别加入过氧化物酶标记的相应的二抗，脱色摇床摇1h，PBST洗3次，每次5min。DAB显色，凝胶成像系统成像拍照分析。同时以β-actin作为内参，实验重复3次。电泳条带密度值＝灰度×面积/参照物值。见表5、表6、图10、图11。

表5各组大鼠心肌AMPK、LC3-I、LC3-Ⅱ相对表达

注：与正常对照组比较，P*＜0.05；与DCM模型组比较，P

表6各组大鼠心肌mTOR、TSC2、Beclin1相对表达量

注：与正常对照组比较，P*＜0.05；与DCM模型组比较，P

2.7Real-Time PCR检测AMPK、mTOR、Beclin1、LC3-I的mRNA表达

取1.0cm×1.0cm×0.5cm心肌细胞组织，放入0.1％DEPC水处理过的冻存管中，并迅速加入1mL TRIzol溶液。封口膜封口后，放入液氮中保存。

提取总RNA及反转录反应:TRIZOL一步法提取总RNA。

反转录反应体系：总RNA 2μg、OligodT(0.5kg/L)2μL、dNTP(10mol/L)3μL、DTT(0.1μmol/L)2μL、Rnase inhibitor(40U/μL)1μL、MMLV-RT(200U/μL)1μL、5×MMLV-RT Buffer 6μL，加入DEPC处理过的无菌水至30μL；反应条件:45℃反应1h，95℃5min终止反应。

Real-time PCR反应:20μL的PCR反应体系含：10μL的2×SYBR Green PCR MasterMix、5.4μL的RNase Free Water、上下游引物(0.05g/L)各1.8μL和1μL的cDNA；反应条件：预变性，94℃，5min；变性，95℃，30s；退火，58℃，30s，延伸，72℃，30s；共进行40个循环的扩增，72℃后延伸5min。实验中同步进行内参基因β-actin的定量检测，以目的基因与内参基因相对浓度比作为目的基因的相对表达量。扩增反应在ABI7000荧光定量PCR仪上进行，各样品的荧光信号值由荧光定量PCR仪的支持软件ABIP rism7000SDS software实时产生并自动计算定。

取PCR产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶(含5μg/ml溴化乙啶)，5V/cm进行电泳，同时以100bp Ladder为DNAmarkers，以出现499、462、529、271和300bp分别表示为β-actin、AMPK、mTOR、Beclin1、LC3-I、mRNA阳性结果，紫外线灯下观察结果并应用Alphalmager2200分析软件对凝胶电泳图进行扫描分析，以曲线下峰面积作为PCR产物含量，用AMPK mRNA、mTORmRNA、Beclin1mRNA、LC3-I mRNA分别与β-actin mRNA积分值之比，表示该基因mRNA表达水平。见表7。结果显示，DCM模型组AMPK、Beclin1表达量水平明显升高，mTOR、LC3-I水平明显降低；强心合剂治疗的各组和卡托普利治疗的组可以改善DCM导致的AMPK、mTOR、Beclin1、LC3-I变化。

表7各组大鼠心肌Beclin1mRNA、mTORmRNA、AMPKmRNA、LC3-ImRNA表达水平比较

注：与正常对照组比较，P*＜0.01，P

需要说明的是，本发明中未特别提及的部件连接关系均默认采用现有技术，由于其不涉及发明点，且为现有技术普遍应用，故不详述结构连接关系。

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 江西师范大学

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<120> 强心合剂在制备通过DCM心肌细胞自噬机制而阻断DCM的药物中的用途

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<160> 10

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 1

cctgggcgtc ggcaccttc 19<>

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<210> 2

<211> 20

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<213> 人工序列

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<210> 3

<211> 23

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<213> 人工序列

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<210> 4

<211> 21

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<213> 人工序列

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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