一种提高反硝化型厌氧甲烷氧化微生物活性的方法

摘要

本发明涉及一种提高反硝化型厌氧甲烷氧化微生物活性的方法，以利用硝酸盐氮为唯一电子受体、甲烷为唯一电子供体，从湖泊水体中富集驯化厌氧甲烷氧化混合菌群，往含有硝酸盐的矿物盐培养基中添加胡敏素，然后接入厌氧甲烷氧化混合菌群，培养后，厌氧甲烷氧化微生物的反硝化活性得到提高。本发明在厌氧甲烷氧化去除硝酸氮的过程中加入胡敏素，通过加快电子传递速率，促进微生物的反应活性，提高硝酸氮的去除速率，并减少中间产物亚硝酸氮的积累。这种方法利用自然界中广泛存在、容易获取、环境友好、性质稳定、不易流失的固态胡敏素促进厌氧甲烷氧化去除硝酸氮，与现有的促进方法相比，不仅节约成本，而且对水环境不会造成二次污染。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高反硝化型厌氧甲烷氧化微生物活性的方法，属于废水微生物脱氮技术领域。

背景技术

反硝化型厌氧甲烷氧化可以同时实现硝酸盐的去除和温室气体甲烷的减排，是环境领域的研究热点之一。目前研究发现反硝化型厌氧甲烷氧化微生物广泛存在于湿地、稻田土壤、湖泊及海洋沉积物。然而由于其生长速率慢、代谢活性低，且反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的富集通常需要一年甚至更长时间，从而限制了反硝化型厌氧甲烷氧化的深入研究及应用。

现有的促进反硝化型厌氧甲烷氧化的方法主要有通过添加微量元素促进酶活性、添加石蜡油提高甲烷的含量、通过电化学方法促进微生物反应活性、优化富集的反应器及环境影响因素等等。这些方法在不同程度上提高了反硝化型厌氧甲烷氧化微生物的活性，但同时增加了处理成本，并且容易引起二次污染。因此，寻求一种环境友好且成本低廉的促进反硝化型厌氧甲烷氧化微生物活性的方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种提高反硝化型厌氧甲烷氧化微生物活性的方法，使成本低，并且对水环境不会造成二次污染。

技术方案

一种提高反硝化型厌氧甲烷氧化微生物活性的方法，包括如下步骤：

(1)以利用硝酸盐氮为唯一电子受体、甲烷为唯一电子供体，从湖泊水体中富集驯化厌氧甲烷氧化混合菌群；

(2)往含有硝酸盐的矿物盐培养基中添加胡敏素，然后接入步骤(1)富集驯化得到的厌氧甲烷氧化混合菌群，培养后，厌氧甲烷氧化微生物的反硝化活性得到提高。

进一步，步骤(1)中，从湖泊水体中富集驯化厌氧甲烷氧化混合菌群的方法，包括如下步骤：

1)取20mL湖泊水和20mL含有硝酸盐的矿物盐培养基加入到厌氧血清瓶中，用氮气置换血清瓶中液体和顶空气体各15分钟后，将血清瓶盖盖密封；

2)用无菌注射器向血清瓶的顶空中加入甲烷气体，使甲烷气体的体积分数为10％，混合均匀；

3)将厌氧血清瓶倒置放在25-30℃培养箱中培养；

4)定期测试培养体系中硝酸根离子和亚硝酸根离子的浓度，待培养体系中硝酸氮完全去除后，按照10％的体积比传代培养混合菌群，直到获得活性稳定的厌氧甲烷氧化混合菌群。

进一步，步骤(2)中，含有硝酸盐的矿物盐培养基的组成为：0.17g/LNaNO

所述微量元素溶液的组成为：0.43g/L ZnSO

进一步，每30-50mL含有硝酸盐的矿物盐培养基中添加0.5g胡敏素。

本发明中，胡敏素可以从河流、湖泊沉积物或土壤中提取得到，提取方法为：取200g风干后的沉积物样品，加入300mL浓度为2％的氢氟酸溶液中，充分摇晃均匀，离心去掉上清液，重复多次后收集沉淀，将沉淀物加入300mL浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液中，充分摇晃均匀，离心收集沉淀，重复10次后，将沉淀物加入300mL浓度为2％的氢氟酸溶液中洗涤2次，之后用蒸馏水将沉淀物冲洗直至中性，烘干，得到胡敏素。

本发明的有益效果：本发明在富集得到活性稳定的厌氧甲烷氧化混合菌群后，在厌氧甲烷氧化去除硝酸氮的过程中加入胡敏素，通过加快电子传递速率，促进微生物的反应活性，提高硝酸氮的去除速率，并减少中间产物亚硝酸氮的积累。这种方法利用自然界中广泛存在、容易获取、环境友好、性质稳定、不易流失的固态胡敏素促进厌氧甲烷氧化去除硝酸氮，与现有的促进方法相比，不仅节约成本，而且对水环境不会造成二次污染。

附图说明

图1为采用实施例1方法得到的厌氧甲烷氧化微生物在培养过程中去除硝酸氮的测试结果；

图2为采用实施例1方法得到的厌氧甲烷氧化微生物在培养过程中积累亚硝酸氮的测试结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

备注：①下述实施例中，采用的胡敏素为从长江沉积物中提取得到，提取方法为：取200g风干后的长江沉积物样品，加入300mL浓度为2％的氢氟酸溶液中，充分摇晃均匀，离心去掉上清液，重复多次后收集沉淀，将沉淀物加入300mL浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液中，充分摇晃均匀，离心收集沉淀，重复10次后，将沉淀物加入300mL浓度为2％的氢氟酸溶液中洗涤2次，之后用蒸馏水将沉淀物冲洗直至中性，烘干，得到胡敏素。胡敏素的来源不限于此。

②下述实施例中，含有硝酸盐的矿物盐培养基的组成为：0.17g/L NaNO

实施例1

一种提高反硝化型厌氧甲烷氧化微生物活性的方法，包括如下步骤：

(1)以利用硝酸盐氮为唯一电子受体、甲烷为唯一电子供体，从湖泊水体中富集驯化厌氧甲烷氧化混合菌群；

从湖泊水体中富集驯化厌氧甲烷氧化混合菌群的方法：

1)取20mL湖泊水和20mL含有硝酸盐的矿物盐培养基(培养基组成见上面的备注②)加入到厌氧血清瓶中，用氮气置换血清瓶中液体和顶空气体各15分钟后，将血清瓶盖盖密封；

2)用无菌注射器向血清瓶的顶空中加入甲烷气体，使甲烷气体的体积分数为10％，混合均匀；

3)将厌氧血清瓶倒置放在25-30℃培养箱中培养；

4)定期测试培养体系中硝酸根离子和亚硝酸根离子的浓度，待培养体系中硝酸氮完全去除后，按照10％的体积比传代培养混合菌群，直到获得活性稳定的厌氧甲烷氧化混合菌群。

(2)往血清瓶中加入40mL含有硝酸盐的矿物盐培养基(培养基组成见上面的备注②)和0.5g胡敏素，用氮气置换血清瓶中液体和顶空气体各15分钟，将血清瓶盖盖密封，用无菌注射器将步骤(1)富集驯化得到的厌氧甲烷氧化混合菌群取1mL加入血清瓶中，混合均匀；用无菌注射器向血清瓶的顶空中加入甲烷气体，使甲烷气体的体积分数为10％，混合均匀后，将厌氧血清瓶倒置放在25-30℃培养箱中培养。

为了方便对比厌氧甲烷氧化去除硝酸盐的效果，设置了3个对照培养组，分别为：对照组1-不加胡敏素，对照组2-不加甲烷气体，对照组3-甲烷和胡敏素都不加

培养12天，在培养过程中，每3天取培养体系中的液体样品，经过滤后采用分光光度法测量硝酸根离子和亚硝酸根离子的浓度，测试结果见图1和图2。

图1为采用实施例1方法得到的厌氧甲烷氧化微生物在培养过程中去除硝酸氮的测试结果，图2为采用实施例1方法得到的厌氧甲烷氧化微生物在培养过程中积累亚硝酸氮的测试结果。可以看出，经过12天的培养后，实施例1的反硝化型厌氧甲烷氧化体系中初始2mM的硝酸氮被全部去除，并且没有亚硝酸氮的积累，然而对照组1中仅仅去除了0.4mM的硝酸氮并且累积了0.15mM的亚硝酸氮，对照组2中去除的硝酸氮仅为实验组的1/3，对照组3中没有发生明显的反应。