用于FFPE组织样本DNA提取的试剂盒、方法及其应用

摘要

本发明公开了一种用于FFPE组织样本DNA提取的试剂盒、方法及其应用。所述试剂盒包括脱蜡裂解缓冲液和蛋白酶K，所述脱蜡裂解缓冲液包括：1‑6％的十二烷基硫酸钠、50‑300mM的Tris‑HCl、1‑30mM的EDTA‑2Na、0.1‑4％的Triton X‑100、0.1‑2M的NaCl、0.1‑8％的吐温20和0.1‑10％的PEG6000；所述百分比为体积百分比。本发明采用独特的脱蜡裂解缓冲液，无需单独添加脱蜡剂，即可实现FFPE组织样本脱蜡和组织裂解，简化脱蜡步骤的同时减少人工操作流程，提高了核酸提取纯化效率。

说明书

技术领域

本发明属于生物组织保存领域，具体涉及一种用于DNA提取的试剂盒、方法及其应用，特别是一种用于FFPE组织样本DNA提取的试剂盒、方法及其应用。

背景技术

肿瘤组织中保留了其特有的遗传信息，十分珍贵且不可替代，是医学工作者重要的研究材料，但肿瘤组织在离体后必须在超低温冷藏条件下储存，否则容易丧失其原有的结构和功能，保存不善容易给后续的研究带来不便。FFPE(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded)是福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本，可以在常温保存很久，研究者将肿瘤组织块进行石蜡包埋等处理，然后用超薄切片机处理成5-10μm厚的组织样品，可以达到在常温下长期保存的目的，这也逐渐成为医院里最常用的样本保存手段。

通过福尔马林固定、石蜡包埋可以维持组织的细胞核蛋白结构，为了保护细胞结构的完整性，福尔马林与蛋白氨基发生了不可逆转的交联，但福尔马林的交联作用对核酸来说是有害的，会导致核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，同时石蜡包埋处理会影响核酸的提取，使用常规DNA提取方法很难从FFPE组织种获取高质量的DNA，残存的抑制剂等成分将会影响DNA聚合酶的活性及PCR扩增等。

磁珠法核酸提取是以纳米生物磁珠为载体的一种新型核酸提取技术，核酸分子可在特殊的缓冲体系下与磁珠表面修饰的基团发生特异性的识别结合，然后在外加磁场的作用下发生聚集或分散，而当缓冲条件改变时，能可逆的释放所吸附的DNA，从而达到快速分离纯化DNA的目的。使用磁珠法进行核酸提取可摆脱传统核酸提取过程中离心、去除上清液等手工操作流程，并可适用于多种核酸自动提取平台。

由于FFPE样本的特殊性，为了从中提取DNA，在处理样本过程中需要有脱蜡的过程，不同的脱蜡方式对产物的质量有很大的影响。目前市面上所售试剂盒，大都将脱蜡液与裂解液分开，需先添加脱蜡液进行脱蜡之后，再进行后续的裂解提取步骤。传统的脱蜡方式是使用二甲苯，将组织切片用二甲苯反复冲洗数次溶解石蜡，然后在DNA提取前用乙醇冲洗去除残留的二甲苯，虽然二甲苯脱蜡在商用试剂盒中使用较为广泛，但它还是存在一些问题，首先二甲苯是一种有毒的有机试剂，对操作人员的人身安全有一定的危险性，其次，为了除去二甲苯，需反复离心、冲洗等步骤，增加了操作人员的工作量并对目标DNA造成损耗。

目前，有一种较为简单的一步脱蜡法，中国专利申请CN109022418A(公开日2018年12月18日)公开了一种FFPE样本核酸取的快速脱蜡方法，具体步骤为通过单一温度孵育，采用可溶解石蜡的油相试剂和可裂解组织样本的水相试剂，实现简单快速的FFPE样本脱蜡，在加有FFPE的样本管中加入该种试剂后，在56℃下孵育30分钟至2小时，用机械装置或移液装置取出下层水相层的液体，该水相液体即为可用于后续核酸提取操作。

但由于其仅使用单一温度(56℃左右)进行孵育，无法完全对核酸和蛋白进行解交联，另外其孵育时长也受FFPE样本类型影响，若采用单一温度孵育时间过长，也容易造成DNA的过度片段化，影响DNA的提取产量，此外，操作过程中油相试剂的残留也会影响后续DNA的提取纯化。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术需要油相试剂才可进行脱蜡和脱蜡耗时较长而造成的FFPE组织样本提取的DNA提取量低、纯度低的不足，提供一种用于DNA提取的试剂盒、方法及其应用，特别是一种用于FFPE组织样本DNA提取的试剂盒、方法及其应用。采用本发明，不需使用油相试剂，即可以对FFPE组织样本进行高效、快速的DNA提取，提取的DNA质量高，提取过程方便安全。

发明人在对FFPE组织样本提取DNA的研究中，对脱蜡裂解缓冲液进行大胆尝试，意外发现采用特殊比例的脱蜡裂解缓冲液，结合常规的蛋白酶K，即可实现对FFPE组织样本的脱蜡裂解处理。在此基础上，发明人尝试调整脱蜡裂解和DNA提取的条件，意外得到了具有良好DNA提取效果的脱蜡方法和DNA提取方法，获得的DNA提取量高的同时具有良好的纯度。

本发明通过以下技术方案解决上述问题：

本发明的第一方面提供一种用于FFPE组织样本DNA提取的试剂盒，所述试剂盒包括脱蜡裂解缓冲液和蛋白酶K，所述脱蜡裂解缓冲液包括：

1-6％的十二烷基硫酸钠、50-300mM的Tris-HCl、1-30mM的EDTA-2Na、0.1-4％的Triton X-100、0.1-2M的NaCl、0.1-8％的吐温20和0.1-10％的PEG6000；

所述百分比为体积百分比。

较佳地，所述脱蜡裂解缓冲液包括：1-4％的十二烷基硫酸钠(SDS)、80-250mM的Tris-HCl、4-20mM的EDTA-2Na、0.1-2.5％的Triton X-100、0.1-1M的NaCl、0.1-5％的吐温20和0.1-5％的PEG6000；所述百分比为体积百分比。

更佳地，所述脱蜡裂解缓冲液包括：2-3％的十二烷基硫酸钠、100-200mM的Tris-HCl、5-10mM的EDTA-2Na、0.5-1％的Triton X-100、0.1-0.2M的NaCl、0.1-1％的吐温20和0.1-2％的PEG6000。

在本发明一具体实施方案中，所述脱蜡裂解缓冲液包括：2％的十二烷基硫酸钠、200mM的Tris-HCl、10mM的EDTA-2Na、1％的Triton X-100、0.1M的NaCl、1％的吐温20和2％的PEG6000；所述百分比为体积百分比。

在本发明一具体实施方案中，所述脱蜡裂解缓冲液包括：3％的十二烷基硫酸钠、100mM的Tris-HCl、5mM的EDTA-2Na、0.5％的Triton X-100、0.2M的NaCl、0.1％的吐温20和0.1％的PEG6000；所述百分比为体积百分比。

所述蛋白酶K(Proteinase K)可为本领域常规，所述蛋白酶K的工作浓度为1.25mg/mL。

在本发明一较佳实施方案中，所述试剂盒还包括磁珠。

较佳地，所述磁珠的工作浓度为3-15％，更佳地为5-12％；所述百分比为体积百分比。

较佳地，所述试剂盒还包括结合液、洗涤液I、洗涤液II和洗脱液；其中：所述结合液包括：50-95％的异丙醇和0.1-3M的NaCl；所述洗涤液I包括：50-85％的乙醇和10-50mM的Tris-HCl；所述洗涤液II包括：50-80％的乙醇；所述洗脱液包括：10-50mM的Tris-HCl和1-5mM的EDTA-2Na，所述洗脱液的pH为7.0-9.0；所述百分比为体积百分比。

在本发明一具体实施方案中，所述磁珠的浓度为9％；所述百分比为体积百分比。

在本发明一些实施方案中，所述结合液包括：50、60、80或95％的异丙醇和0.1、0.2、0.4或3M的NaCl；所述百分比为体积百分比。

在本发明一些实施方案中，所述洗涤液I包括：50、70、75或85％的乙醇和20mM的Tris-HCl；所述百分比为体积百分比。

在本发明一些实施方案中，所述洗涤液II包括：50、70、75或80％的乙醇；所述百分比为体积百分比。

在本发明一些实施方案中，所述洗脱液包括：10、20或50mM的Tris-HCl和1、2或5mM的EDTA-2Na，所述洗脱液的pH为7.5或8.0；所述百分比为体积百分比。

本发明的第二方面提供一种用于FFPE组织样本DNA提取的方法，所述方法使用如第一方面所述的试剂盒进行脱蜡，包括：

将FFPE组织样本、脱蜡裂解缓冲液和蛋白酶K混合，依次进行第一加热阶段的孵育和第二加热阶段的孵育，即得所述FFPE组织样本的DNA溶液；所述第一加热阶段的孵育为在40-70℃下孵育15-30min；所述第二加热阶段的孵育为在60-100℃下孵育15-30min。

所述DNA溶液为脱蜡后含有DNA的水相部分。

较佳地，所述混合为振荡混合。

较佳地，所述第一加热阶段的孵育的温度为55或56℃，孵育的时间为15min或30min；所述第二加热阶段的孵育的温度为80℃，孵育的时间为15min或30min。

在本发明一较佳实施方案中，所述FFPE组织样本为石蜡切片或石蜡块。

所述石蜡切片的厚度优选为5-10μm；或者所述石蜡块的质量小于15mg。

在本发明一具体实施方案中，所述脱蜡裂解缓冲液和所述蛋白酶K依次加入所述FFPE组织样本中。

在本发明一较佳实施方案中，所述方法还包括磁珠法提取DNA。

所述磁珠法可为本领域常规，优选地包括：

(1)向所述DNA溶液中加入结合液，混匀后进行磁珠吸附；

(2)向(1)中磁珠吸附后的DNA溶液中加入洗涤液I，进行第一洗涤；再加入洗涤液II，进行第二洗涤后干燥，得到DNA提取物；

所述第一洗涤后、所述第二洗涤后干燥之前均进行磁珠吸附；

(3)向(2)中得到的DNA提取物中加入洗脱液，混匀后进行磁珠吸附，得到DNA提取溶液。

较佳地，所述(1)中的所述混匀为吸打混匀，所述吸打混匀的频率为每2min或3min混匀一次；所述磁珠吸附的时间为30s。

较佳地，所述(2)中的所述第一洗涤和所述第二洗涤均为振荡洗涤，所述振荡洗涤的时间为1min；所述磁珠吸附的时间为30s；所述干燥的温度为室温或者37℃，当所述干燥的温度为室温时，所述干燥的时间为2-3min，当所述干燥的温度为37℃时，所述干燥的时间为3-5min。

所述室温可为本领域常规。

较佳地，所述(3)中的所述混匀为吸打混匀，所述吸打混匀的时间为1min；所述磁珠吸附的时间为30-60s。

本发明的第三方面提供了如第一方面所述的试剂盒在FFPE组织样本DNA提取中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明采用独特的脱蜡裂解缓冲液，无需单独添加脱蜡剂，例如二甲苯及酚氯仿等有机试剂，可直接逆转福尔马林交联并缩短脱蜡时长，有效去除石蜡及PCR抑制剂等，可实现FFPE组织样本脱蜡和组织裂解。

(2)本发明改进了脱蜡处理过程，缩短前期加热时长，采用温度差异实现FFPE组织样本脱蜡和组织裂解，简化脱蜡步骤的同时减少人工操作流程，可方便地与相关核酸自动提取平台结合，提取出的DNA产量足，纯度高，可满足下游实验要求，实现快速高效的FFPE样本核酸提取。

(3)本发明采用磁珠法进行DNA的纯化提取，无需离心机，操作简便，采用的表面修饰有特殊化学基团的纳米磁珠，其在特殊的缓冲体系下对目标DNA具有很强的亲和力，而当条件改变时，能可逆的释放所吸附的DNA，从而达到快速分离纯化DNA的目的。

(4)本发明在提取时采用了脱蜡裂解合二为一的缓冲液，在半小时内即可完成脱蜡裂解的过程，1小时内即可获得高纯度的FFPE组织样本的DNA，大大减少了核酸的提取时间，并且降低工作量，安全无毒，结果可靠，提高了核酸提取纯化效率。

附图说明

图1为实施例1提取的DNA的qPCR结果。

图2为实施例2提取的DNA的qPCR结果。

图3为实施例3提取的DNA的qPCR结果。

图4为实施例4提取的DNA的qPCR结果。

图5为实施例5提取的DNA的qPCR结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例使用的试剂和材料如表1所示。

表1实施例使用的试剂和材料

实施例中使用的FFPE组织样本可酌情去除长期暴露在空气中的石蜡部分，且所述FFPE组织样本小于15mg。

实施例1

1、刮取FFPE组织样本(5-10μm厚，1×1cm

2、将金属浴升温至80℃，继续孵育15min(注：无需将离心管取出，可直接使温度从55℃上升至80℃)，孵育结束后，移液枪取出下层水相，将下方水相溶液(约250μL)吸出转移至新的1.5mL离心管。

3、向离心管中依次加入30μL磁珠和300μL的结合液(65％的异丙醇、0.2M的NaCl)，吸打混匀，之后每隔2min混匀一次，混匀3次，避免磁珠聚集。

4、将离心管置于磁力架上30s，使磁珠完全被吸附。小心移除上清，避免碰到或弄散磁珠。

5、加入500μL的洗涤液I(70％的乙醇、20mM的Tris-HCl)，振荡洗涤1min，将离心管置于磁力架上30s，使磁珠完全被吸附。移除上清，避免碰到或弄散磁珠。

6、加500μL的洗涤液II(70％乙醇)，振荡洗涤1min，将离心管置于磁力架上30s，使磁珠完全被吸附。移除上清，避免碰到或弄散磁珠。

7、室温开盖2-3min，晾干磁珠。

8、加入40-50μL的洗脱液(TE buffer)(10mM的Tris-HCl、1mM的EDTA-2Na，pH为8.0)吸打混匀1min，用磁铁吸附30-60s，收集上清液于新的1.5mL EP管中，确保收集的上清液中没有磁珠。

收集的上清液即为提取的基因组DNA，可于-20℃保存备用。

实施例2

1、刮取FFPE组织样本(5-10μm厚，1×1cm

2、将金属浴升温至80℃，继续孵育15min(注：无需将离心管取出，可直接使温度从55℃上升至80℃)，孵育结束后，用移液枪取出下层水相，将下方水相溶液(约250μL)吸出转移至新的1.5mL离心管。

3、依次加入20μL磁珠和300μL的结合液(80％的异丙醇和0.4M的NaCl)，振荡混匀，之后每隔3min混匀一次，混匀3次，避免磁珠聚集。

4、将离心管置于磁力架上30s，使磁珠完全被吸附。小心移除上清，避免碰到或弄散磁珠。

5、加入500μL的洗涤液I(75％的乙醇、20mM的Tris-HCL)，振荡洗涤1min，将离心管置于磁力架上30s，使磁珠完全被吸附。小心移除上清，避免碰到或弄散磁珠。

6、加入500μL的洗涤液II(75％的乙醇)，振荡洗涤1min，将离心管置于磁力架上30s，使磁珠完全被吸附。移除上清，避免碰到或弄散磁珠。

7、室温或37℃开盖3-5min，晾干磁珠(注意磁珠不能过分干燥，以免影响洗脱效果)。

8、加入40-50μL的洗脱液(20mM的Tris-HCl、2mM的EDTA-2Na，pH为7.5)吸打混匀1min，用磁铁吸附30-60s，收集上清液于新的1.5mL的EP管中，确保收集的上清液中没有磁珠。

收集的上清液即为提取的基因组DNA，可于-20℃保存备用。

实施例3

1、刮取FFPE组织样本(5-10μm厚，1×1cm

2、将金属浴升温至80℃，继续孵育30min(注：无需将离心管取出，可直接使温度从55℃上升至80℃)，孵育结束后，用移液枪取出下层水相，将下方水相溶液吸出转移至新的1.5mL离心管。

后续步骤与实施例1相同。

实施例4

1、刮取FFPE组织样本(5-10μm厚，1×1cm

2、将金属浴升温至80℃，继续孵育15min(注：无需将离心管取出，可直接使温度从55℃上升至80℃)，孵育结束后，移液枪取出下层水相，将下方水相溶液(约250μL)吸出转移至新的1.5mL离心管。

3、向离心管中依次加入30μL磁珠和300μL的结合液(50％异丙醇、0.1M NaCl)，吸打混匀，之后每隔2min混匀一次，混匀3次，避免磁珠聚集。

4、将离心管置于磁力架上30s，使磁珠完全被吸附。小心移除上清，避免碰到或弄散磁珠。

5、加入500μL的洗涤液I(50％的乙醇、20mM的Tris-HCl)，振荡洗涤1min，将离心管置于磁力架上30s，使磁珠完全被吸附。移除上清，避免碰到或弄散磁珠。

6、加500μL的洗涤液II(50％乙醇)，振荡洗涤1min，将离心管置于磁力架上30s，使磁珠完全被吸附。移除上清，避免碰到或弄散磁珠。

7、室温开盖2-3min，晾干磁珠。

8、加入40-50μL的洗脱液(TE buffer)(50mM的Tris-HCl、5mM的EDTA-2Na，pH为8.0)吸打混匀1min，用磁铁吸附30-60s，收集上清液于新的1.5mL EP管中，确保收集的上清液中没有磁珠。

收集的上清液即为提取的基因组DNA，可于-20℃保存备用。

实施例5

1、刮取FFPE组织样本(5-10μm厚，1×1cm

2、将金属浴升温至80℃，继续孵育15min(注：无需将离心管取出，可直接使温度从55℃上升至80℃)，孵育结束后，移液枪取出下层水相，将下方水相溶液(约250μL)吸出转移至新的1.5mL离心管。

3、向离心管中依次加入30μL磁珠和300μL的结合液(95％异丙醇，3M NaCl)，吸打混匀，之后每隔2min混匀一次，混匀3次，避免磁珠聚集。

4、将离心管置于磁力架上30s，使磁珠完全被吸附。小心移除上清，避免碰到或弄散磁珠。

5、加入500μL的洗涤液I(85％的乙醇、20mM的Tris-HCl)，振荡洗涤1min，将离心管置于磁力架上30s，使磁珠完全被吸附。移除上清，避免碰到或弄散磁珠。

6、加500μL的洗涤液II(80％乙醇)，振荡洗涤1min，将离心管置于磁力架上30s，使磁珠完全被吸附。移除上清，避免碰到或弄散磁珠。

7、室温开盖2-3min，晾干磁珠。

8、加入40-50μL的洗脱液(TE buffer)(10mM的Tris-HCl、1mM的EDTA-2Na，pH为8.0)吸打混匀1min，用磁铁吸附30-60s，收集上清液于新的1.5mL EP管中，确保收集的上清液中没有磁珠。

收集的上清液即为提取的基因组DNA，可于-20℃保存备用。

对比例1使用常规油相试剂进行脱蜡提取

1、刮取FFPE组织样本(5-10μm厚，1×1cm

后续步骤与实施例1相同。

对比例2

使用天根生化科技(北京)有限公司的试剂盒Magnetic Universal Genomic DNAKit(DP705)进行提取，下为天根试剂盒说明书方法。

1、取石蜡切片(5-10μm厚，1×1cm

2、置于90℃消化1h(待控温设备升温至90℃后再放入样品)。

3、取下层300μL溶液转移至新的1.5mL离心管中，进行后续实验。

4、加入900μL缓冲液GDZ(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，振荡混匀2min。

5、将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。

6、加入500μL缓冲液GDZ，振荡混匀2min。

7、将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。

8、将离心管从磁力架上取下，加入900μL漂洗液PWD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，振荡混匀2min。

9、将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。

10、将离心管从磁力架上取下，加入300μL漂洗液PWD，振荡混匀2min。

11、将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。

12、将离心管于磁力架上，室温晾干10-15min。

注意：乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥太长时间，以免难以洗脱DNA。

13、将离心管从磁力架上取下，加入50-100μL洗脱缓冲液TB，振荡混匀，置于56℃，孵育10min，期间颠倒混匀3回，每回3-5次。

14、将离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，小心将DNA溶液转移至一个新离心管中，并于适当条件保存。

结果实施例

实施例1-5和对比例1-2的结果如表2所示。

表2各实施例提取石蜡组织标本的DNA含量

如表3和表4所示，将实施例和对比例中提取的DNA通过qPCR进行验证，所述DNA为HBB基因(humanβ-globin gene)。

qPCR的结果如图1-5所示。由图可知，实施例1-5的效果均优于对比例1和2，且不使用油相试剂的实施例1-5的效果均优于使用油相试剂的对比例1和2。

表3使用通用引物扩增HBB基因的引物序列

表4 PCR扩增程序

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州康代思锐生物科技有限公司

<120> 用于FFPE组织样本DNA提取的试剂盒、方法及其应用

<130> P21012751C

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HBB-F

<400> 1

tgggtttctg ataggcactg act 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HBB-R

<400> 2

aacagcatca ggagtggaca gat 23

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HBB-P

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> FAM Modification

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> BHQ1 Modification

<400> 3

tctacccttg gacccagagg ttcttt 26