同胚接种、同步增殖鸡新城疫和禽流感复合病毒的方法

摘要

本发明涉及一种同胚接种、同步增殖鸡新城疫和禽流感复合病毒的方法，包括采用浓度为2～5％犊牛血清乳汉液或浓度为0.5％乳汉液作为种毒稀释液，将所述鸡新城疫病毒的种毒稀释至10‑4～10‑5，将禽流感病毒的种毒稀释至10‑4～10‑5，得到两种病毒的种毒稀释液，还包括混合剂制备步骤、鸡胚接种步骤、孵育观察步骤、冷却步骤、鸡胚病毒液收获步骤，本发明同时含有鸡新城疫病毒和禽流感病毒，而且鸡新城疫病毒含量及禽流感病毒含量的EID50均超过了制苗要求的标准，且鸡胚病毒液单胚平均收获量大，可直接使用，简化了生产工艺，提高了生产效率，降低了生产成本，方便了实际需求，同时也降低了生产成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种兽用生物制品领域，尤其涉及一种鸡新城疫和禽流感复合病 毒的增殖方法。

背景技术

鸡新城疫和禽流感是家禽的主要传染病，被世界动物卫生组织列为必须报告 的动物疫病，我国将其规定为一类动物疫病，新城疫是由新城疫病毒(NDV)引 起的一种高度接触性传染病，禽流感是由A型流感病毒(AIV)引起的一种禽类 感染或疾病综合征。新城疫和高致病性禽流感(HPNAI)感染，鸡的死亡率高， 造成的经济损失很大，低致病性禽流感(LPNAI)则发病率高，造成产蛋率下降5～ 50％，无论是高致病性禽流感病毒还是低致病性禽流感病毒，都可以引起人的感 染或死亡，且低致病性禽流感H9亚型病毒在人群中的血清阳性率，明显高于其 他亚型的流感病毒。

目前，控制鸡新城疫和禽流感这两种疾病主要靠疫苗免疫，疫苗生产就必须 用到鸡新城疫病毒鸡胚液和禽流感病毒鸡胚液。单一病毒鸡胚液制备的灭活疫苗 只能用于一种疫病的预防，若要预防鸡新城疫、禽流感两种疫病，则需要将两种 单病毒疫苗分别免疫接种鸡群，这样劳动强度大、鸡群应激反应强、免疫成本高； 目前，普遍采用鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗免疫，达到了一次免疫同时预防 鸡新城疫和禽流感疫病的目的，但制苗用鸡胚病毒液是分别生产鸡新城疫鸡胚病 毒液和禽流感鸡胚病毒液，再将它们分别进行至少2倍的浓缩，之后按1：1体 积比混合得到，这种疫苗制备方法繁杂落后，成本较高，且浓缩环节可能还会造 成污染，降低疫苗质量，增大疫苗的副反应，甚至导致病毒液报废，生产成本进 一步升高，还会连带生产计划不能如期完成，影响免疫进度，制约畜牧业的发展。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足，提供一种同时含有足量达标的鸡新 城疫病毒和禽流感病毒，显著提高鸡胚病毒液单胚平均收获量的同胚接种、同步 增殖鸡新城疫和禽流感复合病毒的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种同胚接种、同步增殖鸡新 城疫和禽流感复合病毒的方法，包括以下步骤：

1)种毒稀释步骤：所述的种毒为鸡新城疫病毒和禽流感病毒，采用浓度为2～ 5％犊牛血清乳汉液或浓度为0.5％乳汉液作为种毒稀释液，将所述鸡新城疫病毒的 种毒稀释至10

2)混合剂制备步骤：将鸡新城疫病毒的种毒稀释液和禽流感病毒的种毒稀释 液按体积比1:1混合，制得混合剂，备用；

3)鸡胚接种步骤：尿囊腔接种9～11日龄的鸡胚，0.1～0.2ml/胚，接种后 密封针孔；

4)孵育观察步骤：将接种后的鸡胚在温度为36～37.5℃、湿度为60～70％的 条件下继续孵育，不必翻蛋，弃去接种后60h前的死胚，此后，每6～8h照蛋1 次，死亡胚随时取出，孵育至96～120h，终止孵育观察；

5)冷却步骤：将接种孵育60h后的死胚及96～120h终止孵育观察的鸡胚， 气室向上直立，置2～8℃环境中冷却4～24h；

6)鸡胚病毒液收获步骤：将冷却的鸡胚取出，消毒鸡胚，剪掉气室部位蛋壳， 揭去卵壳膜，刺破绒毛尿囊膜及羊膜，勿使卵黄破裂，逼压胚胎及卵黄于蛋壳内 一侧，于另一侧无菌收取鸡胚尿囊液和羊水，即鸡胚病毒液；收获的同时，逐个 检查鸡胚，污染鸡胚弃去不用。

进一步的，所述的浓度为2～5％的犊牛血清乳汉液是犊牛血清与浓度为0.3～0.5％的乳汉液混合制得。

进一步的，所述的浓度为0.3～0.5％的乳汉液是将水解乳蛋白溶解在汉克氏 液中，制得的混合溶液，再经过113～116℃蒸汽灭菌15～30min，2～8℃的温度 保存，用时，以浓度为7.5％的碳酸氢钠溶液将所述的混合溶液PH值调至7.2～ 7.4，制得。

进一步的，所述的汉克氏液是通过以下步骤制成：

a.制备甲液：将氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁依次溶于注射用水中， 制得所述的甲液；其中所述氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁在注射水 中的浓度依次为0.8％、0.04％、0.014％、0.02％；

b.制备乙液：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖，依次溶于注射用水中， 再加入浓度为1％的酚红溶液，制得所述的乙液；其中所述磷酸氢二钠、 磷酸二氢钾、葡萄糖在注射用水中的浓度依次为0.0152％、0.006％、0.1％， 1％酚红溶液在乙液中浓度为0.16％；

c.制备汉克氏液：按1:1的体积比，将所述乙液缓慢加入甲液，边加边搅 拌，之后，经113～116℃蒸汽灭菌15～30min，2～8℃的温度保存，制 得汉克氏液。

进一步的，所述的硫酸镁含7个结晶水，所述的磷酸氢二钠含12个结晶水。

进一步的，所述的鸡新城疫病毒为低毒力病毒HB1株或F株或LaSota株， 所述的禽流感病毒为H9亚型的病毒株。

进一步的，所述的鸡胚为SPF鸡胚或健康敏感鸡胚，所述健康敏感鸡胚是鸡 新城疫病毒和禽流感病毒血清HI抗体几何平均滴度均不大于1:4的鸡群所产出 的鸡胚。

进一步的，在鸡胚接种步骤中，先用浓度4～5％碘酊消毒鸡胚的气室及尿囊 腔接种点部位，经过1～2min，用70～75％酒精脱碘；然后在尿囊腔接种点和气 室顶部各钻一小孔；再用灭菌的注射器吸取稀释好的种毒，注射器针头朝向鸡胚 的小头端，与鸡胚的大头端夹角成30～45°，从尿囊腔接种点进针5～8mm，注 射种毒0.1～0.2ml；最后，用石蜡先封接种孔，再封气室孔。

进一步的，在所述的鸡胚病毒液收获步骤中，先用1～1.5‰新洁尔灭消毒液 擦拭整个鸡胚，然后用浓度4～5％碘酊消毒气室部位，再剪掉气室部位蛋壳，无 菌收取鸡胚尿囊液和羊水，即鸡胚病毒液。

进一步的，所述的污染鸡胚为胚胎腐败和鸡胚液混浊的鸡胚。

犊牛血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，它是天然的 培养基，含有各种血浆蛋白(如白蛋白、球蛋白、α2巨球蛋白等)、多肽、脂肪、 碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，为病毒生长提供必须的丰富的营养成 分，并有保护和促进其增殖的作用。

水解乳蛋白中的乳蛋白非常稀有，每100g牛奶中仅有7g，其组成成分包括 α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、少量乳铁蛋白等。乳蛋 白以纯度高、组织能完全吸收、氨基酸组成合理等优势，被称为“蛋白之王”。

浓度为0.5％乳汉液常作为鸡胚成纤维细胞体外培养的营养液，而用在鸡胚繁 育增殖病毒时的种毒稀释方面，本发明尚属首次。发明人依据水解乳蛋白的作用 功效，通过大量的对比试验、探索研究，摸索出了在乳汉液中添加犊牛血清作为 稀释液，保护病毒、促进病毒增殖效果更佳，又不断调整组方，创造性劳动，最 终探索出了：浓度为2～5％犊牛血清乳汉液或浓度为0.5％乳汉液作为新城疫病毒 和禽流感病毒的种毒稀释液，能协佐两种病毒同时在鸡胚内良好增殖，其效果是 现行普通生理盐水作为种毒稀释液所无法比拟的。

本发明的有益效果是：本发明为鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗乃至相关多 联灭活疫苗制备所需鸡胚病毒液的生产提供了新工艺、新方法。采用本发明取得 的鸡胚病毒液，一方面，不但同时含有鸡新城疫病毒和禽流感病毒，而且鸡新城 疫病毒含量及禽流感病毒含量的EID

本发明使用浓度为2～5％犊牛血清的乳汉液液或浓度为0.5％乳汉液作为种毒稀释液，通过调整鸡胚接种日龄、种毒稀释倍数、鸡胚接种剂量、接毒后鸡胚孵 育时间等技术参数，成功创新、并实现了鸡新城疫病毒和禽流感H9亚型病毒同 时接种SPF鸡胚或健康敏感鸡胚，同胚增殖两种病毒的目的，且取得了满意的效 果，产生了显著的经济效益。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用 于限定本发明的范围。

实施例1：一种同胚接种、同步增殖鸡新城疫和禽流感复合病毒的方法，包 括以下步骤：

1)种毒稀释步骤：所述的种毒为鸡新城疫病毒和禽流感病毒，所述的鸡新城 疫病毒为低毒力病毒HB1株或F株或LaSota株，所述的禽流感病毒为H9亚型的 病毒株，具体的步骤如下：

11)制备汉克氏液：

a.制备甲液：将氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁依次溶于注射用水中， 制得所述的甲液；其中所述氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁在注射水中的 浓度依次为0.8％、0.04％、0.014％、0.02％；所述的硫酸镁含7个结晶水；

b.制备乙液：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖，依次溶于注射用水 中，再加入浓度为1％的酚红溶液，制得所述的乙液；其中所述磷酸氢二钠、 磷酸二氢钾、葡萄糖在注射用水中的浓度依次为0.0152％、0.006％、0.1％， 1％酚红溶液在乙液中浓度为0.16％；所述的磷酸氢二钠含12个结晶水；

c.制备汉克氏液：按1:1的体积比，将所述乙液缓慢加入甲液，边加边 搅拌，之后，经113～116℃蒸汽灭菌15～30min，2～8℃的温度保存，制得 汉克氏液。

12)制备浓度为0.3～0.5％的乳汉液：将水解乳蛋白溶解在制备得到的汉克 氏液中，制得的混合溶液再经过113～116℃蒸汽灭菌15～30min，2～8℃的温度 保存，用时，以浓度为7.5％的碳酸氢钠溶液将所述的混合溶液PH值调至7.2～ 7.4，制得浓度为0.3～0.5％的乳汉液；

13)制备浓度为2～5％的犊牛血清乳汉液：犊牛血清与制得的浓度为0.3～ 0.5％的乳汉液混合，制得浓度为2～5％的犊牛血清乳汉液；

14)稀释种毒：采用制得的浓度为2～5％犊牛血清乳汉液作为种毒稀释液， 将所述鸡新城疫病毒的种毒稀释至10

2)混合剂制备步骤：将鸡新城疫病毒的种毒稀释液和禽流感病毒的种毒稀释 液按体积比1:1混合，制得混合剂，备用；

3)鸡胚接种步骤：尿囊腔接种9～11日龄的鸡胚，先用浓度4～5％碘酊消毒 鸡胚的气室及尿囊腔接种点部位，经过1～2min，用70～75％酒精脱碘；然后在 尿囊腔接种点和气室顶部各钻一小孔；再用灭菌的注射器吸取稀释好的种毒，注 射器针头朝向鸡胚的小头端，与鸡胚的大头端夹角成30～45°，从尿囊腔接种点 进针5～8mm，注射种毒0.1～0.2ml；最后，用石蜡先封接种孔，再封气室孔， 接种后密封针孔；所述的鸡胚为SPF鸡胚；

4)孵育观察步骤：将接种后的鸡胚在温度为36～37.5℃、湿度为60～70％的 条件下继续孵育，不必翻蛋，弃去接种后60h前的死胚，此后，每6～8h照蛋1 次，死亡胚随时取出，孵育至96～120h，终止孵育观察；

5)冷却步骤：将接种孵育60h后的死胚及96～120h终止孵育观察的鸡胚， 气室向上直立，置2～8℃环境中冷却4～24h；

6)鸡胚病毒液收获步骤：将冷却的鸡胚取出，先用1～1.5‰新洁尔灭消毒液 擦拭整个鸡胚，然后用浓度4～5％碘酊消毒气室部位，剪掉气室部位蛋壳，揭去 卵壳膜，刺破绒毛尿囊膜及羊膜，勿使卵黄破裂，逼压胚胎及卵黄于蛋壳内一侧， 于另一侧无菌收取鸡胚尿囊液和羊水，即鸡胚病毒液；收获的同时，逐个检查鸡 胚，污染鸡胚弃去不用。

本发明采用水解乳蛋白完全溶解在汉克氏液得到的乳汉液，乳汉液与犊牛血 清混合后得到2～5％犊牛血清乳汉液，该犊牛血清乳汉液可以提供病毒生长所需 的营养和最适的外界条件；提供维持病毒指数生长的激素，如促病毒摄取葡萄糖 和氨基酸的胰岛素、能与病毒表达的胰岛素受体结合的类胰岛素生长因子、促进 病毒增殖的氢化可的松等；提供基础培养基中没有或量很少的营养物及主要的低 分子营养物，进一步促进病毒增殖；提供结合蛋白，既能识别维生素、脂类、金 属和其他激素等，结合或调变它们所结合的物质活力，协调病毒的最佳生长条件， 又能与有毒金属和热原质结合，起酸碱缓冲作用，保护病毒，免受伤害。

实施例2：与实施例1相同，不同的是：所述的鸡胚为健康敏感鸡胚，所述 健康敏感鸡胚是鸡新城疫病毒和禽流感病毒血清HI抗体几何平均滴度均不大于 1:4的鸡群所产出的鸡胚。

实施例3：与实施例1相同，不同的是：在步骤1)种毒稀释步骤中：所述 的种毒为鸡新城疫病毒和禽流感病毒，包括了鸡新城疫病毒和禽流感病毒所有的 病毒种类中的任意一种，并采用浓度为0.5％乳汉液作为种毒稀释液，浓度为0.5％ 乳汉液为现有技术，将所述鸡新城疫病毒的种毒稀释至10

实验例：

第一组用3％犊牛血清乳汉液作为种毒稀释液，分别将鸡新城疫病毒LaSota 株种毒及禽流感病毒H9亚型SY株种毒稀释至50000倍和100000倍，然后按1:1 的体积比混合，制得第一组混合剂，尿囊腔接种9.5日龄SPF鸡胚500枚，0.2ml/ 胚；

第二组用生理盐水作为种毒稀释液，分别将鸡新城疫病毒LaSota株种毒及 禽流感病毒H9亚型SY株种毒稀释至50000倍和100000倍，然后按1:1的体积 比混合，制得第二组混合剂，尿囊腔接种9.5日龄SPF鸡胚500枚，0.2ml/胚。

接种后的鸡胚及时封孔，置37℃、65～70％湿度的环境中继续孵育，不必翻 蛋，于接毒后60h照蛋一次，弃去死胚，之后，每6～8h照蛋一次，随时取出60～ 108h死亡的鸡胚，至108h，终止孵育，取出所有活胚，气室向上直立，置2～8℃ 环境中冷却4～24h,然后无菌收获鸡胚尿囊液和羊水，即鸡胚病毒液，并留样、 检验，结果见表1。

表1不同种毒稀释液的效果对比

注:“-”表示无菌生长；“/”左为用收获胚计算的平均值，“/”右为用接种胚计算的平均值

从表1看出，两种稀释液采用相同的方法稀释种毒、接种鸡胚，并在相同条 件下孵育相同的时间，收获的鸡胚病毒液单胚平均收获量基本无差别，但测定的 病毒含量EID

表1中EID

现行《鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗制造及检验试行规程》国标法生产鸡 新城疫、禽流感二联灭活疫苗的鸡胚病毒液，是将新城疫病毒及禽流感病毒两种 种毒分别单独用生理盐水稀释、接种鸡胚、收获鸡胚尿囊液和羊水，再进行至少 2倍浓缩，最后混合而得。即鸡新城疫鸡胚病毒液是把鸡新城疫病毒LaSota株种 毒用生理盐水至10

按所述现行《鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗制造及检验试行规程》国标方 法生产鸡新城疫鸡胚病毒液和禽流感鸡胚病毒液，各接种500枚SPF鸡胚，结果 见表2：

表2现行国标法生产新城疫鸡胚病毒液和禽流感鸡胚病毒液情况

注:“-”表示无菌生长；“/”左为用收获胚计算的平均值，“/”右为用接种胚计算的平均值；

从表2看出，现行《鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗制造及检验试行规程》 国标方法是单独生产两种病毒液。测定的鸡胚病毒液病毒含量EID

从表1、表2结合对比看出：按现行《鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗制造 及检验试行规程》国标法生产，需分别生产两种病毒的鸡胚病毒液，再分别至少 2倍浓缩后，按1:1的体积比混合得到生产疫苗所需的病毒液，且鸡胚病毒液单 胚平均收获量不大；而此发明生产鸡胚病毒液具有以下优势：一是收获的鸡胚病 毒液不但同时含有两种病毒，而且鸡胚病毒液病毒含量超过了国标，不必浓缩， 直接用于制苗，就此项而言，创新、简化了生产工艺，降低生产成本50％；二是 鸡胚病毒液平均单胚收获量比现行国标法单胚平均收获量增大30％多，综合鸡胚 病毒液单位体积生产成本降低了60％多。所以，本发明相对于现行《鸡新城疫、 禽流感二联灭活疫苗制造及检验试行规程》国标法生产鸡新城疫、禽流感二联灭 活苗制苗用鸡胚病毒液，既创新了生产工艺，简化了实施步骤，方便了生产组织， 又降低了生产成本，质量可靠，经济效益显著。

本发明采用的鸡胚也可以是健康敏感鸡胚，产业化生产主要采用该鸡胚，同 样采用含3％犊牛血清乳汉液分别将鸡新城疫病毒LaSota株和禽流感病毒H9亚型 SY株种毒稀释50000倍和100000倍，然后按1:1体积比混合，尿囊腔接种9.5 日龄健康敏感鸡胚2批，0.2ml/胚，接种后的鸡胚在37℃、65～70％湿度中继续 孵育，不必翻蛋，接种后60h前死胚弃去，之后每6～8h照蛋一次，随时取出死 亡胚，至108h，不论死亡与否，终止孵育，全部取出，气室向上直立，置2～8℃ 环境中冷却4～24h，然后无菌收取鸡胚尿囊液和羊水，即鸡胚病毒液，并留样、 检验，结果见表3。

表3健康敏感鸡胚发明法生产情况

注:“-”表示无菌生长；“/”左为用收获胚计算的平均值，“/”右为用接种胚计算的平均值

从表3看出，采用此发明，用健康敏感鸡胚替代SPF鸡胚产业化生产鸡新 城疫、禽流感鸡胚病毒液二批，同样达到SPF鸡胚生产的效果，说明此发明同样 适用于产业化的生产实际。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护 范围之内。