细胞规模化培养方法及所使用的微载体

摘要

本申请公开一种微载体，其包括凝胶分子和外基质分子，所述凝胶分子和外基质分子混合之后诱导进行凝胶化反应，生成水凝胶微载体；其中，所述凝胶分子为海藻酸钠或海藻酸钙，所述外基质分子为胶原蛋白、基质胶蛋白、硫酸软骨素、纤连蛋白和壳聚糖中的一种或一种以上的组合。本申请中的微载体的主要成分含有海藻酸钙复合材料。该材料的最大优势是在钙离子螯合剂存在下，材料易于膨胀变形，从而降低了材料与细胞之间的接触面积，细胞在轻微的物理剪切力下，即可脱落，实现细胞与微载体分离。整个过程不需要胰酶参与，即可实现细胞分离。

说明书

技术领域

本申请涉及一种细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞规模化培养方法及所使用的微载体。

背景技术

伴随干细胞技术的发展，细胞治疗为许多重大疾病如肿瘤、肝肾器官衰竭、神经-内分泌系统疾病如帕金森、糖尿病等的根治提供了可能。但作为临床植入的细胞产品在制备过程中要避免各种蛋白、酶的引入，给细胞规模化培养工作带来了困难。尤其针对贴壁依赖型细胞的规模化培养，尚需胰酶消化来收集培养好的细胞，胰酶的引入增加了后续细胞产品纯化的工艺流程，增加了产品的生产成本。

发明内容

本申请的目的是，克服现有技术的不足，提供一种无需胰酶消化的细胞规模化培养方法，以及实现该培养方法的微载体。

为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，是一种微载体，其包括凝胶分子和外基质分子，所述凝胶分子和外基质分子混合之后诱导进行凝胶化反应，生成水凝胶微载体；其中，所述凝胶分子为海藻酸钠或海藻酸钙，所述外基质分子为胶原蛋白、基质胶蛋白、硫酸软骨素、纤连蛋白和壳聚糖中的一种或一种以上的组合。

所述水凝胶微载体的干燥粉剂浸泡在含钠离子和钙离子螯合剂的溶液中会膨胀变形。

具体地，所述钙离子螯合剂为磷酸根、碳酸根、碳酸氢根、柠檬酸根或EDTA中的任意一种。

第二方面，是一种微载体的制备方法，用于制备如上所述的微载体，其包括如下步骤：

分别配制凝胶分子溶液和外基质分子溶液；

将碳酸钙粉末与所述凝胶分子溶液混合，再与所述外基质分子溶液混合形成预混液；

通过流体颗粒化技术促进所述预混液发生凝胶化反应，生成水凝胶微载体；

对所述水凝胶微载体进行干燥和灭菌处理，得到微载体的干燥粉剂。

优选地，所述凝胶分子溶液的浓度为10～50g/L，所述外基质分子溶液的浓度为1～50g/L。

更优选地，所述预混液中的所述凝胶分子溶液的浓度在10g/L以上。

具体地，所述流体颗粒化技术选用高压静电场技术、气体锐孔喷雾技术、微流控技术或乳化技术中的任意一种。

进一步地，所述生成水凝胶微载体之后，再加入1～10g/L的壳聚糖溶液中，再加入所述外基质分子溶液，进行聚电解质络合反应，生成具有壳核结构的水凝胶微载体。所述水凝胶微载体与壳聚糖溶液的体积比为1：2～10；所述聚电解质络合反应的持续时间为2～60分钟。

更进一步地，所述生成水凝胶微载体之后，将所述水凝胶微载体置入酸性环境中以产生二氧化碳，生成具有孔隙结构的水凝胶微载体。

第三方面，是一种细胞规模化培养方法，其包括以下步骤：

分别制备微载体和种子细胞；

将所述微载体和种子细胞用不含钠离子和钙离子螯合剂的无血清培养基共培养，使得所述种子细胞粘附在微载体表面进行增殖；

收获细胞时，置换含钠离子和钙离子螯合剂的无血清培养基；

待所述微载体膨胀变形之后，通过物理方式收集细胞；

其中，所述微载体采用如前所述的微载体，或者所述微载体采用如前所述的制备方法获得的微载体。

优选地，所述微载体和种子细胞共培养的过程中需要定期震荡，以促进所述种子细胞粘附在微载体表面。

进一步优选地，置换含钠离子和钙离子螯合剂的无血清培养基之后的培养过程需要定期震荡，以促进粘附有细胞的微载体在培养基中均匀悬浮。

具体地，所述含钠离子和钙离子螯合剂的无血清培养基包括100mmol/L碳酸氢钠和55mmol/L柠檬酸钠。

可选择地，所述通过物理方式收集细胞包括以下方式至少之一：

通过震荡或搅拌促进细胞脱离微载体表面；

通过筛网分离微载体和细胞；

通过离心的方式富集细胞。

优选地，所述搅拌的速度为100r/min以下。

可选择地，所述种子细胞为贴壁依赖型培养的细胞。

与现有技术相比较，本申请具有如下优势：

1.本申请中的微载体的主要成分含有海藻酸钙复合材料。该材料的最大优势是在钙离子螯合剂(如磷酸根、碳酸根、碳酸氢根、柠檬酸根、EDTA等)存在下，材料易于膨胀变形，从而降低了材料与细胞之间的接触面积，细胞在轻微的物理剪切力下，即可脱落，实现细胞与微载体分离。整个过程不需要胰酶参与，即可实现细胞分离。

2.微载体材料中同时复合一些细胞外基质材料，以提供细胞的粘附位点，便于细胞在微载体表面的粘附、增殖。

附图说明

图1为本申请的微载体的制备方法的流程图。

图2为本申请的细胞规模化培养方法的流程图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述。

本申请的微载体主要由凝胶分子和外基质分子组成。所述凝胶分子主要指通过凝胶化反应进行交联聚合形成凝胶状物质的成分，本实施例优选使用海藻酸盐，具体可以是海藻酸钠和海藻酸钙。所述外基质分子主要指可以模拟细胞外基质的成分，例如胶原蛋白、基质胶蛋白、硫酸软骨素、纤连蛋白和壳聚糖，根据所培养的细胞的类型不同，上述的外基质分子可以是单一成分的，也可以是复合成分的；所述外基质分子的存在使得细胞易于粘附在微载体表面进行增殖。本申请的微载体在钙离子螯合剂的存在下，易于发生膨胀变形，膨胀变形后的微载体表面与细胞的接触面积减少，使得细胞易于从微载体表面脱落，本申请利用微载体的这个特性对细胞进行规模化培养，并且在收获细胞的时候省略添加胰酶的步骤。

本申请的微载体的制备方法如下：

分别配制凝胶分子溶液和外基质分子溶液；

将碳酸钙粉末与所述凝胶分子溶液混合，再与所述外基质分子溶液混合形成预混液；

通过流体颗粒化技术促进所述预混液发生凝胶化反应，生成水凝胶微载体；

对所述水凝胶微载体进行干燥和灭菌处理，得到微载体的干燥粉剂。

进一步地，所述凝胶分子溶液和外基质溶液的浓度影响了水凝胶微载体的尺寸，本领域技术人员可以根据实验结果确定具体的数值，但优选地，所述预混液中的凝胶分子溶液的浓度要保持在10g/L以上，以保证凝胶化反应的顺利进行。所述流体颗粒化技术可以选用高压静电场技术、气体锐孔喷雾技术、微流控技术或乳化技术等，乳化技术可以进一步细分为乳化-外部凝胶化法、乳化-内部凝胶化法和膜乳化法。

以下通过具体的实施例对本申请的微载体的制备方法和微载体应用在细胞规模化培养方法中的应用作进一步的叙述。

实施例一

参考图1，所述微载体的制备方法如下：

A、溶液配制：浓度10-50g/L海藻酸钠溶液；浓度1-10g/L壳聚糖溶液；

B、配制浓度2-50g/L的胶原溶液、壳聚糖溶液、基质胶溶液、硫酸软骨素溶液或纤连蛋白溶液；

C、将步骤A配制的海藻酸钠溶液与碳酸钙粉末混合配成均匀悬浊液，再与步骤B配制的胶原溶液、壳聚糖溶液、基质胶溶液、硫酸软骨素溶液或纤连蛋白溶液中的一种或一种以上均匀混合，混合液中海藻酸钠浓度保持在10g/L以上；

D、将步骤C制备的混合液通过流体颗粒化技术，形成均匀液滴，通过钙离子交联，同时结合温度变化，发生凝胶化反应，得到球形水凝胶微载体；

E、将步骤D获得的球形水凝胶微载体也可以作为内核进一步与步骤A配制的浓度为1-10g/L壳聚糖溶液反应，载体与壳聚糖溶液的体积比为1:2-1:10，让微载体在壳聚糖溶液中处于均匀悬浮状态，进行聚电解质络合反应2-60分钟，即在球形水凝胶微载体内核表面形成水凝胶膜，生理盐水溶液清洗后获得壳核结构的球形水凝胶载体；

F、将步骤D或步骤E制备的球形水凝胶微载体植入酸性环境中，与载体中碳酸钙粉末充分反应产生二氧化碳，生成具有孔隙结构的水凝胶微载体，水凝胶微载体的孔隙结构能增大微载体表面积，有利于增加细胞粘附的面积，也有利于提高水凝胶微载体内部的物质交换效率。

G、将步骤F获得的球形水凝胶载体，真空干燥处理后，得到干燥的微载体，高压蒸汽灭菌之后成为微载体干燥粉剂，备用。

实施例二

【1】配制海藻酸钠溶液，浓度30g/L；

【2】配制胶原溶液，浓度为5g/L，用NaOH调节至中性；

【3】配制凝胶浴溶液，凝胶浴中含有氯化钙(浓度20g/L)；

【4】将步骤【1】配制的海藻酸钠溶液与步骤【2】配制的胶原溶液2:1体积比混合；

【5】将步骤【4】制备的海藻酸钠与胶原的混合液，在高压静电场下形成稳定射流，喷入到步骤【3】制备的凝胶浴中，并将凝胶浴于37℃凝胶化反应30分钟后，即制备得到海藻酸钠-胶原共混水凝胶微球；

【6】将步骤【5】制备的海藻酸钠-胶原共混水凝胶微球高压灭菌后，通过流化床干燥机干燥成微载体干燥粉剂，备用。

实施例三

A、将实施例一或者实施例二获得的微载体，与待培养的细胞共同培养，定期震荡使待培养的细胞均匀粘附到微载体表面。

B、配制含有特定离子无血清培养基：无血清培养基中一定含有钠离子，一定含有磷酸根、碳酸根、碳酸氢根、柠檬酸根、EDTA中的一种或一种以上的阴离子的无血清培养基。

C、将步骤A获得的载有细胞的微载体在生物反应器中培养，细胞扩增到满意程度后，用步骤B配制的含钠离子和钙离子螯合剂的无血清培养基置换培养液，待培养液完全置换后，定期震荡，使得微载体在步骤B配制的溶液中均匀悬浮。

D、微载体膨胀变形，在轻度的剪切力下，细胞即从载体表面脱落到溶液中，通过孔径100微米筛网进行物理分离，截留微载体，离心收集上清液中的细胞。

上述的细胞规模化培养方法的流程参考图2，该培养方法适用于所有贴壁依赖型培养的细胞。

实施例四

以肝细胞系HepG2为例，利用本申请的细胞规模化培养方法进行培养。过程如下：

将肝细胞系HepG2接种到微载体上，利用生物反应器培养。

配制含有特定离子无血清培养基：含有100mmol/L碳酸氢钠和柠檬酸钠55mmol/L。

肝细胞在微载体上培养7天后，收集微载体，生理盐水清洗后，转移到上一步骤配制的含有特定离子无血清培养基中，在生物反应器中再培养10小时，反应器搅拌速度50转/min，待微载体膨胀、细胞自动脱落后进行细胞的收集。

将生物反应器中的混合物用粒径100微米的筛网截留膨胀后的微载体，细胞悬液离心收集获得细胞产品。

综上所述，本申请的细胞规模化培养方法及所使用的微载体，是将细胞培养到由海藻酸钠、壳聚糖之类的外基质成分制备的微载体表面，待细胞在反应器中培养到一定时间后，分离微载体和细胞，具体是向微载体中加入含有钠离子和钙离子螯合剂的无血清培养基，使微载体膨胀，降低细胞与微载体表面的黏附程度，使细胞脱落，再通过筛网过滤截留膨胀后的微载体，含细胞的滤液通过离心收集细胞。

上述实施例为本申请较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本申请的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本申请的保护范围之内。