一种阿魏酸哌嗪含量的测定方法

摘要

本发明涉及药物分析技术领域，公开了一种阿魏酸哌嗪含量的RT‑HPLC检测方法，它包括：配置分析溶液；使用反相色谱柱，以酸或酸及羧酸盐水溶液‑有机相的混合液为流动相，采用等度洗脱方法；将配置好的分析溶液上机测定。本发明分析方法能够有效且准确的测定阿魏酸哌嗪的含量，从而确保产品的质量可控。

说明书

技术领域

本发明属于化学药物分析方法，具体涉及阿魏酸哌嗪含量的测定方法。

背景技术

阿魏酸哌嗪是阿魏酸与哌嗪结合的盐，其化学名称为3-甲氧基-4-羟基桂皮酸哌嗪，性状为白色至微黄色针状结晶或粉末。近年研究发现其具有下述作用：抗血小板聚集，抑制血小板5-羟色胺释放，抑制血小板血栓素A2(TXA2)的生成，增强前列腺素活性，镇痛，缓解血管痉挛等作用。是生产用于治疗心脑血管疾病及白细胞减少等症药品的基本原料。它同时在人体中可起到健美和保护皮肤的作用。

阿魏酸哌嗪有关物质如下：杂质F为阿魏酸哌嗪的起始物料；杂质A是阿魏酸顺式异构体，也是光降解杂质；上述杂质结构见表1。

表1阿魏酸哌嗪各杂质名称及结构

中国药典已公开的关于阿魏酸哌嗪的药品标准中采用容量法，用高氯酸滴定液测定阿魏酸哌嗪中哌嗪的含量，从而间接计算出阿魏酸哌嗪的含量；该方法忽视了阿魏酸与哌嗪成盐比例，测定结果不准确，不能真实反映阿魏酸哌嗪的含量。欧洲药典、美国药典和日本药典均未收载阿魏酸哌嗪标准。

在文献《HPLC法测定阿魏酸哌嗪的有关物质》中，采用乙酸水溶液-甲醇-乙腈三相梯度洗脱；检测波长为286nm，仅对有关物质进行研究，并未考察含量。

在文献《阿魏酸哌嗪片的含量和有关物质的测定》中，采用1％乙酸溶液-甲醇(70:30)为流动相，等度洗脱，检测波长为322nm。该方法的有点是确保与顺式阿魏酸的分离度大于1.5，专属性较好；缺点是未考察起始物料香兰素与阿魏酸的分离度，且运行时间较长。

在文献《高效液相方法测定阿魏酸哌嗪片的含量》中，采用水-甲醇(60:40)为流动相，等度洗脱，检测波长为310nm，该文章中并未对阿魏酸与香兰素、顺式阿魏酸的分离度进行研究，无法确保主峰与杂质间的分离度，专属性有待考量。

综上，现有技术中对于阿魏酸哌嗪含量普遍存在专属性较差、测定时间较长等问题。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的阿魏酸哌嗪原料药及制剂产品含量测定的问题，本发明的目的在于提供一种等度洗脱的高效液相色谱法测定阿魏酸哌嗪含量的分析方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

本发明的阿魏酸哌嗪有关物质RT-HPLC的检测方法，包括以下步骤：

a)配置分析溶液；

b)色谱条件

色谱柱为反相色谱柱，以水-有机相-酸组合的混合溶液为流动相A或者羧酸及羧酸盐水溶液-有机相组成的混合溶液为流动相A，所述流动相A中酸或羧酸及羧酸盐水溶液浓度范围为0.005mol/L～0.025mol/L，所述水相体积比为50-90％；水-有机相-酸组合的混合溶液为流动相B或者羧酸及羧酸盐水溶液-有机相组成的混合溶液为流动相B，所述流动相B中酸酸或羧酸及羧酸盐水溶液浓度范围为0.002mol/L～0.025mol/L，所述水相体积比为10-50％；采用等度洗脱方法，所述等度洗脱方法流动相A体积比范围为40％～70％；

c)上机测定

取步骤a)制成的分析溶液10-50μl注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱图。

优选方案，所述步骤a)样品分析溶液配制遵循以下要求：用甲醇-水-酸、甲醇-水-酸铵盐水溶液、乙腈-水-酸、乙腈-水-酸铵盐水溶液混合溶液溶解样品，制成分析溶液。

所述步骤b)色谱条件中，设定高效液相流速为0.8-1.2ml/min；柱温为25-50℃，采用检测波长为220-320nm紫外检测器；

在一些实施例中，所述反相色谱柱优选为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

在一些实施例中，所述反相色谱柱的规格为：柱长介于100mm至300mm，色谱柱内径介于1mm至10mm，粒径介于1μm至10μm，优选为规格为4.6mm×250mm，5μm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

在一些实施例中，所述流动相A或B中，所述酸选自甲酸、乙酸、三氟乙酸、冰醋酸、磷酸中的一种或多种；所述羧酸及羧酸盐选自甲酸及甲酸铵盐、乙酸及乙酸铵盐、乙酸及乙酸钠。

在一些实施例中，所述流动相A或B中所述有机相为甲醇或乙腈，优选甲醇。

在一些实施例中，所述A相为水-甲醇-乙酸，所述水-甲醇-乙酸体积比优选为90:10:1.2～70:30:0.8，更为优选体积比为80:20:0.1。所述B相为水-甲醇-乙酸，所述水-甲醇-乙酸体积比优选为10:90:1.2～30:70:0.8，更为优选体积比为20:80:0.1。

具体的优选方案为：

步骤a)用甲醇-水-酸混合液溶解样品，制成分析溶液，所述的甲醇-水-酸混合液溶液中有机相体积百分比小于50％；

步骤b)所述等度洗脱条件为反相色谱柱为柱长250mm、直径4.6mm、填料粒径5μm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为以水-甲醇-乙酸(80:20:0.1)为A相，以水-甲醇-乙酸(20:80:0.1)为B相，流动相中A相比例为55％，等度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长310nm；

步骤c)取步骤a)制成的分析溶液注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱。

在一些实施例中，所述样品为阿魏酸哌嗪或其相关制剂。所述阿魏酸哌嗪相关制剂为片剂。

上述方法分析可用于分离样品中杂质A、杂质F和阿魏酸哌嗪。

本发明能够有效的测定阿魏酸哌嗪溶液中含量，尤其实现了谱图中阿魏酸哌嗪特征峰与阿魏酸哌嗪顺式阿魏酸特征峰及其相关起始物料分离。

各个色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均在5000以上。

本发明的方法耐用性强，不会增加操控难度。色谱条件在柱温、流速、波长等发生微小变化时，各组分间分离度均大于1.5，含量均一致。样品重复进样，实验结果重复性良好。

本发明的方法能够准确计算各杂质的含量，采用杂质外标法测定，回收率均在98.0％～102.0％范围内。

上述方法的检测可以确保产品的质量可控，本发明方法的检测专属性、重复性和准确性均良好；方法操作简单，对仪器要求不高。

附图说明

图1、实施例1流动相条件的色谱图；

图2、实施例2流动相条件的色谱图；

图3、实施例3等度洗涤的色谱图；

图4、实施例4等度洗涤的色谱图；

图5、实施例5等度洗涤的色谱图；

图6、实施例6等度洗涤的色谱图；

图7、实施例7等度洗涤的色谱图；

图8、实施例8等度洗涤的色谱图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例一

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

配置甲醇-水-乙酸(20:80:0.1)为流动相A，甲醇-水-乙酸(80:20:0.1)为流动相B，A相-B相(55:45)，等度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长310nm；

(2)实验步骤

避光操作。

分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质F对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪0.1mg、其他各杂质各含1μg的系统适用性溶液；

取样品适量，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中约含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液，作为供试品溶液；

取阿魏酸哌嗪对照品适量，精密称定，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液；

取上述分析溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。检测结果见附图1和表2。

表2实施例1色谱结果表

实施例二

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：Luna C18(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

配置0.01M醋酸钠-甲醇(80:20)为A相，以0.01M醋酸钠-甲醇(20：80)为B相，A相-B相(55:45)，等度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长310nm；

(2)实验步骤

避光操作。

分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质F对照品各适量，用溶剂[0.01M醋酸钠-甲醇(60:40)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪0.1mg、其他各杂质各含1μg的系统适用性溶液；

取样品适量，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中约含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液，作为供试品溶液；

取阿魏酸哌嗪对照品适量，精密称定，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液；

取上述分析溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。检测结果见附图2和表3。

表3实施例2色谱结果表

实施例三

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

配置甲醇-水-乙酸(20:80:0.1)为流动相A，甲醇-水-乙酸(80:20:0.1)为流动相B，A相-B相(55:45)，等度洗脱，流速1.0ml/min；柱温30℃，检测波长310nm；

(2)实验步骤

避光操作。

分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质F对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪0.1mg、其他各杂质各含1μg的系统适用性溶液；

取样品适量，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中约含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液，作为供试品溶液；

取阿魏酸哌嗪对照品适量，精密称定，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液；

取上述分析溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。检测结果见附图3和表4。

表4实施例3色谱结果表

实施例四

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

配置甲醇-水-乙酸(20:80:0.1)为流动相A，甲醇-水-乙酸(80:20:0.1)为流动相B，A相-B相(55:45)，等度洗脱，流速1.0ml/min；柱温40℃，检测波长310nm；

(2)实验步骤

避光操作。

分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质F对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪0.1mg、其他各杂质各含1μg的系统适用性溶液；

取样品适量，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中约含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液，作为供试品溶液；

取阿魏酸哌嗪对照品适量，精密称定，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液；

取上述分析溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。检测结果见附图4和表5。

表5实施例4色谱结果表

实施例五

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

配置乙腈-水-乙酸(20:80:0.1)为流动相A，乙腈-水-乙酸(80:20:0.1)为流动相B，A相-B相(50:50)，等度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长310nm；

(2)实验步骤

避光操作。

分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质F对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪0.1mg、其他各杂质各含1μg的系统适用性溶液；

取样品适量，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中约含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液，作为供试品溶液；

取阿魏酸哌嗪对照品适量，精密称定，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液；

取上述分析溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。检测结果见附图5和表6。

表6实施例5色谱结果表

实施例六

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

配置甲醇-水-乙酸(20:80:0.1)为流动相A，甲醇-水-乙酸(80:20:0.1)为流动相B，A相-B相(60:40)，等度洗脱，流速1.0ml/min；柱温35℃，检测波长310nm；

(2)实验步骤

避光操作。

分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质F对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪0.1mg、其他各杂质各含1μg的系统适用性溶液；

取样品适量，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中约含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液，作为供试品溶液；

取阿魏酸哌嗪对照品适量，精密称定，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液；

取上述分析溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。检测样品结果见附图6和表7。

表7实施例6色谱结果表

实施例七

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

配置甲醇-水-乙酸(20:80:0.1)为流动相A，甲醇-水-乙酸(80:20:0.1)为流动相B，A相-B相(55:45)，等度洗脱，流速0.9ml/min；柱温35℃，检测波长310nm；

(2)实验步骤

避光操作。

分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质F对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪0.1mg、其他各杂质各含1μg的系统适用性溶液；

取样品适量，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中约含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液，作为供试品溶液；

取阿魏酸哌嗪对照品适量，精密称定，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液；

取上述分析溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。检测样品结果见附图7和表8。

表8实施例7色谱结果表

实施例八

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：Thermo Acclaim(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

配置甲醇-水-乙酸(20:80:0.1)为流动相A，甲醇-水-乙酸(80:20:0.1)为流动相B，A相-B相(55:45)，等度洗脱，流速1.1ml/min；柱温35℃，检测波长310nm；

(2)实验步骤

避光操作。

分别取阿魏酸哌嗪对照品、杂质A、杂质F对照品各适量，用溶剂[水-甲醇-乙酸(60:40:0.1)]制成每1ml含阿魏酸哌嗪0.1mg、其他各杂质各含1μg的系统适用性溶液；

取样品适量，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中约含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液，作为供试品溶液；

取阿魏酸哌嗪对照品适量，精密称定，加稀释液[甲醇-水-醋酸(40:60:0.1)]溶解并稀释制成每1ml中含阿魏酸哌嗪0.1mg的溶液；

取上述分析溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。检测样品结果见附图8和表9。

表9实施例8色谱结果表