慢加急性肝衰竭的评价标志物及其应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，提供了慢加急性肝衰竭预后评价的标志物及其应用，所述标志物包含热休克蛋白70或抗热休克蛋白70抗体。以包含热休克蛋白70的试剂盒用于ACLF的预后评价，其检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低等特点，且操作简单、快捷，可为ACLF患者预后评价提供可靠依据。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及慢加急性肝衰竭的检测和预后评价。

背景技术

慢加急性肝衰竭(Acute-on-chronic liver failure，ACLF)是一种临床恶化迅速、死亡率高的快速进展性疾病。发现ACLF预后相关影响因素、尽早开始合理有效的防治措施，对改善患者预后、提高生活质量具有重要意义，但临床上至今仍没有令人满意的评价肝衰竭病情及预后的预测指标。

发明内容

本发明的发明人收集了多份不同预后的ACLF患者血清，利用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence，IIF)技术和蛋白质印迹分析(western blot analysis)技术，筛选出阳性反应血清，再通过双向凝胶(2D-gel)电泳、质谱仪分析肽谱和氨基酸测序，发现了在不同预后的ACLF患者血清中差异表达的物质，该差异表达与患者的临床预后密切相关，可以用于表征ACLF预后情况。基于此，提供用于ACLF预后评价的标志物。

在第一个方面，本发明提供ACLF预后评价的标志物，所述标志物包含热休克蛋白70(Hsp70)或抗Hsp70抗体；优选地，所述标志物为Hsp70或抗Hsp70抗体。

在第二个方面，提供Hsp70或抗Hsp70抗体在制备评价ACLF预后的标志物中的应用。

在第三个方面，提供ACLF预后评价试剂盒，所述试剂盒包含Hsp70。

优选地，所述试剂盒还包括固相载体和抗原包被液，所述Hsp70包被于固相载体上。

在进一步的实施方式中，所述试剂盒还包括封闭液、稀释液、酶标第二抗体、显色液、终止液、洗涤液中的任意一种或几种的组合。

在进一步的实施方式中，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种；优选地，所述固相载体为96孔酶标板。

在进一步的实施方式中，所述试剂盒还包括正常人血清，作为标准正常对照组；更进一步地，还包括已确诊预后不良患者血清，作为阳性对照组。

利用本发明的试剂盒评价ACLF预后的方法，包括以下步骤：

1)将标志物Hsp70包被于固相载体上，封闭后清洗；

2)将待检测血清与Hsp70进行孵育、清洗，再进行二抗孵育，再清洗；

3)显色系统显色后终止反应，测定吸光度值；

4)结果判定：将待测血清的滴定度与正常对照组、阳性对照组进行比较，以所有正常对照组的OD的平均数加上三个标准差为截断值(Cut-off值)，高于此值为阳性，低于此值为阴性。

根据本发明人的研究结果，Hsp70作为ACLF预后评价指标，具有可靠、易检测的效果。以包含Hsp70的试剂盒作为ACLF的预后评价，其检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低等特点，且操作简单、快捷，可为ACLF患者预后评价提供可靠依据。

附图说明

图1：ELISA测定人血清中抗Hsp70自身抗体效价的结果。ELISA得到的OD值表示抗体滴度，抗Hsp70自身抗体在ACLF患者血清中的滴度明显高于正常人血清，且在ACLF预后不良患者血清中的滴度大于预后良好患者血清(P<0.05)。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

以下实施例中，如果没有特别说明，所使用的试剂或仪器，均为本领域常规试剂或仪器，具有本领域公知的含义和成分，可以通过商购的方式获得；所使用的方法也是本领域公知方法，本领域技术人员根据说明书记载的内容，可以毫无疑义地进行实施例，并获得相应的结果。

检测人体血清中自身抗体，将其作为自身免疫性疾病诊断的重要指标，目前已在临床研究和实践中被广泛应用。为了找到可以评价ACLF预后的血清分子标志物，本发明人收集了不同预后的慢加急性肝衰竭患者血清，运用间接免疫荧光(indirectimmunofluorescence，IIF)技术和蛋白质印迹分析(western blot analysis)技术，筛选出阳性反应血清，通过双向凝胶(2D-gel)电泳，质谱仪分析肽谱和氨基酸测序，发现了12种肝衰竭相关抗原(liver failure associated antigen，LFAA)的抗体，抗Hsp70蛋白的抗体是其中一种。本发明以酶联免疫吸附实验(ELISA)进行定性检测，进一步验证Hsp70作为慢加急性肝衰竭预后标记物的可行性，为慢加急性肝衰竭预后判断提供新的线索和指标。

实施例1：试剂盒的制备

本发明根据间接酶联免疫法的原理制备了一种可用于ACLF患者预后评价的自身抗体检测ELISA试剂盒。间接酶联免疫法的原理的是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相抗原-受检抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，然后测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。

1.试剂和材料

1)肿瘤相关抗原Hsp70蛋白(购自abcam公司)；

2)抗原包被液：50mM磷酸盐缓冲液，pH＝9.6；

3)封闭液：含有2％(W/V)BSA的PBST缓冲液(磷酸二氢钾(KH

4)样本及抗体稀释液：含1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

5)洗涤液：含0.05％吐温20的PBST缓冲液，pH7.4；

6)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记山羊二抗(购自北京中杉金桥公司，A0201)

7)96孔酶标板(美国Corning公司)；

8)显色液：TMB双组份显色液，临时配制，试剂A:B以1:1混合(北京索莱宝公司，PR1210)；

9)终止液：2M硫酸。

2.制备抗原包被的酶标板

1)制备抗原溶液：将抗原蛋白用抗原包被液稀释，配制成终浓度为0.5μg/ml的抗原溶液；

2)包被酶标板：将制备好的抗原溶液加入到96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔，空白对照孔加入抗原包被液，4℃孵育过夜后去除抗原包被液；

3)封闭：向包被后的96孔酶标板的点样孔中加入封闭液，37℃孵育1小时，去除封闭剂；

4)将经过步骤3)处理后的96孔酶标板放置在37℃烘干箱烘干后，包装，4℃保存备用。

3.本发明试剂盒的组成如下

1)抗原包被的酶标板；

2)样本及抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

3)封闭液：含有2％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

4)洗涤液：含0.05％吐温20的PBST缓冲液，pH7.4；

5)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记山羊二抗(购自北京中杉金桥公司，A0201)；

6)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成(购自北京索莱宝公司，PR1210)；

7)终止液：2M硫酸。

实施例2：本发明试剂盒的检测方法

1.血清样本孵育

将待检的血清样本用样本稀释液按1：100的比例稀释，然后将稀释后的样本加入已包被抗原的96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温箱孵育1小时，弃去样本，洗涤液洗涤5次。

2.酶标二抗孵育

将辣根过氧化物酶IgG二抗(以1:10000稀释)加入96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温箱孵育1小时，弃去液体，洗涤液洗涤5次。

3.显色及终止反应

将显色液按1：1等体积混合，然后迅速加入96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃避光显色10min；然后点样孔中加入50μl终止液，用自动酶标仪在450nm处读取OD值，以空白对照孔调零后测各孔OD值。

4.结果判定

以所有正常对照组(正常人血清)的OD的平均数加上三个标准差为截断值(Cut-off值)，高于此值为阳性，低于此值为阴性。

实施例3：以实施例2的试剂盒进行检测

样本准备：

入选56例慢加急性肝衰竭预后良好(n＝56，3个月时存活)、26例预后不良(n＝26，3个月时死亡或肝移植)患者血清，健康正常人(n＝24)血清作为正常对照，ACLF患者的血清样本来自2014年8月至2020年10月首都医科大学附属北京佑安医院收治的慢加急性肝衰竭患者，入组标准依据2014年或2019年中华医学会感染病学分会及肝病学分会制定的《肝衰竭诊疗指南》；表1比较了不同预后ACLF患者的部分临床检验指标，其中预后不良组甲胎蛋白(AFP)、MELD评分、TBil和凝血酶原时间(PT)均高于预后良好组，且P<0.1差异具有统计学意义。而性别、年龄、转氨酶(ALT、AST)、白蛋白(Alb)、血小板(PLT)、肌酐(Cr)未见明显差异。

采用实施例2的试剂盒对56例慢加急性肝衰竭预后良好患者血清、26例预后不良患者血清和健康正常人(n＝24)血清中的Hsp70自身抗体的含量进行检测；以正常对照组血清中自身抗体含量的平均值加三个标准差作为截断值，分别计算各组中Hsp70自身抗体的阳性率，结果如表2所示。

表1：不同预后ACLF患者一般临床资料的比较

MELD评分：R＝3.8ln[胆红素(mg/dL)]+11.2ln(INR)+9.6ln[肌酐(mg/dL)]+6.4(病因：胆汁性或酒精性0，其他1)。P<0.05表示差异具有统计学意义。

表2：血清中抗Hsp70抗体表达

Cutoff值：正常人均值+3个标准差；*预后良好组与正常对照比较；**预后不良组与正常对照比较，P<0.05表示差异具有统计学意义。

人血清中抗Hsp70抗体效价如图1及表2所示。抗Hsp70自身抗体在ACLF患者血清中的滴度及阳性率明显高于正常人血清，且在预后不良组大于预后良好患者血清(P<0.05)。

本发明通过临床样本证明了抗Hsp70抗体能在一定程度上反应ACLF预后情况，显示抗Hsp70抗体在预后不良患者中的阳性率明显高于预后良好组。所以抗Hsp70抗体可能是ACLF预后判断的较好的潜在血清标志物，抗Hsp70抗体或Hsp70可以作为有效的评价标志物。