一种转肽酶生化检验试剂底物的制备方法

摘要

本发明涉及一种转肽酶生化检验试剂底物的制备方法，属于化学合成的技术领域，制备方法以5‑氨基‑2‑硝基苯甲酸与化合物A邻苯二甲酰‑L‑谷氨酸酐为起始原料，具体包括以下步骤：步骤(1)：5‑氨基‑2‑硝基苯甲酸与化合物A邻苯二甲酰‑L‑谷氨酸酐在酸性溶剂中反应合成中间体B；步骤(2)：在溶剂中，将所述中间体B和水合肼进行如下所示的反应，在离子交换树脂作用下铵根化得到化合物Glupa‑C，本发明的制备方法对γ‑谷氨酰‑3‑羧基‑4‑硝基苯胺单铵盐的制备工艺、反应条件和方法进行了改进和优化，使得产品的产率和纯度得到大幅度提高，且制备工艺简便安全，易于放大，适合于工业生产。

说明书

技术领域

本发明涉及的是化学合成的技术领域，尤其涉及的是一种转肽酶生化检验试剂底物的制备方法。

背景技术

γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺单铵盐(Glupa-C)是测定转肽酶的良好底物，临床检验中已有重要的使用价值。美国专利US3979447A公开了该化合物的制备方法，以5-氨基-2-硝基苯甲酸与邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐(化合物A)在三正丁胺存在下缩合，缩合物再进行肼解得产品。但是该专利没有报道详细的缩合及肼解条件，肼解后产品Glupa-C与邻苯二甲酰肼的分离方法困难，产品Glupa-C的精制方法、质量标准均未见报道，另外三正丁胺属于剧毒品，不适合于工业放大；在重复制备该文献的制备过程实验中，发现没有要的产物，技术路线如下式一：

中国专利CN1076688A公开了5-氨基-2-硝基苯甲酸与邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐的合成路线，以及两种原料在温度为140℃～142℃缩合，然后在温度为40℃～50℃肼解。该方法硝基化合物140℃～142℃缩合容易发生爆炸，无法实现工业化生产，另外该合成方法得到的产品的Glupa-C的自由碱的形式，不是单铵盐。技术路线如下式二：

基于上述γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺单铵盐在碱性环境下的制备方法中存在剧毒品原料、工艺有爆炸风险、收率非常低、且无法放大等缺陷，本申请提供一种转肽酶生化检验试剂底物的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种转肽酶生化检验试剂底物的制备方法，以解决现有方法总收率较低的技术问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种转肽酶生化检验试剂底物的制备方法，该制备方法以5-氨基-2-硝基苯甲酸与化合物A邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐为起始原料，具体包括以下步骤：

步骤(1)：5-氨基-2-硝基苯甲酸与化合物A邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐在酸性溶剂中反应合成中间体B；

步骤(2)：在溶剂中，将所述中间体B和水合肼进行反应，在离子交换树脂作用下铵根化得到化合物Glupa-C；

步骤(1)至步骤(2)反应通式如下：

作为对上述发明的进一步改进，所述步骤(1)中酸性溶剂为甲酸或乙酸，溶剂的用量与化合物A邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐的体积质量比为1.0mL/g～10mL/g，优选为4.6mL/g。

作为对上述发明的进一步改进，所述步骤(1)中5-氨基-2-硝基苯甲酸和化合物A邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐的摩尔比为0.5:1～1:3，优选为0.5:1-1:1.5，更优选为0.9:1。

作为对上述发明的进一步改进，所述步骤(1)中反应温度为20℃～200℃，优选为100℃。

作为对上述发明的进一步改进，所述步骤(1)中反应进程采用TLC、HPLC或NMR进行检测，以化合物A邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐消失时为反应终点，反应时间为0.1～15小时，优选为2小时。

作为对上述发明的进一步改进，所述步骤(2)中溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或四氢呋喃，溶剂的用量与中间体B的体积质量比为5.0mL/g～20.0mL/g，优选为10mL/g。

作为对上述发明的进一步改进，所述步骤(2)中体积质量分数为28％水合肼和中间体B的体积质量比为0.5mL/g～20.0mL/g，优选为1.3mL/g。

作为对上述发明的进一步改进，所述步骤(2)中反应温度为为0℃～50℃，优选为25℃。

作为对上述发明的进一步改进，所述步骤(2)中反应进程采用TLC、HPLC或NMR进行检测，以中间体B消失时为反应终点，反应时间为5～48小时，优选为12小时。

作为对上述发明的进一步改进，所述步骤(2)反应的后处理方法为此类反应的常规后处理方法，优选为过滤、调节PH、析晶、过离子树脂柱铵根化、重结晶或真空干燥。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种转肽酶生化检验试剂底物的制备方法，对γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺单铵盐的制备工艺、反应条件和方法进行了改进和优化，在酸性环境下制备得到产物，相对于传统的碱性环境下制备，避免剧毒原料的使用和制备过程中爆炸的隐患，减小了生产风险，并且使得产品的总产率为36.9％和纯度(99％)得到大幅度提高，制备工艺简便，易于放大，适合于工业生产。

具体实施方式

本发明提供了一种转肽酶生化检验试剂底物的制备方法，该制备方法以5-氨基-2-硝基苯甲酸与化合物A邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐为起始原料，具体包括以下步骤：

步骤(1)：5-氨基-2-硝基苯甲酸与化合物A邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐在溶剂中反应合成中间体B；

步骤(2)：在溶剂中，将所述中间体B和水合肼进行如下所示的反应，在离子交换树脂作用下铵根化得到化合物Glupa-C；

步骤(1)至步骤(2)反应通式如下：

其中，步骤(1)中5-氨基-2-硝基苯甲酸和化合物A邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐的摩尔比为0.5:1～1:3，步骤(1)中反应温度为20℃～200℃，步骤(1)中反应进程采用TLC、HPLC或NMR进行检测，以化合物A邻苯二甲酰-L-谷氨酸酐消失时为反应终点，反应时间为0.1～15小时，

其中，步骤(2)中溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或四氢呋喃，溶剂的用量与中间体B的体积质量比为5.0mL/g～20.0mL/g，步骤(2)中体积质量分数为28％水合肼和中间体B的体积质量比为0.5mL/g～20.0mL/g，步骤(2)中反应温度为为0℃～50℃，步骤(2)中反应进程采用TLC、HPLC或NMR进行检测，以中间体B消失时为反应终点，反应时间为5～48小时。

为了进一步验证本实施的效果，提供以下具体的一种转肽酶生化检验试剂底物的制备方法的实验，以下实验中，未限定具体操作温度的，均是指在室温(0-35℃)条件下进行。

(1)中间体B的合成

在2L反应瓶中搅拌下依次加入600毫升乙酸、130g(0.5mol)化合物A、82g(0.45mol)5-氨基-2-硝基苯甲酸；反应液升温到100℃，继续搅拌2小时；TLC显示反应完成，反应液降到室温，过滤得粗品200g；粗品用甲醇和水重结晶，过滤真空干燥得到中间体B：110克，收率为55％。

(2)化合物Glupa-C的合成

室温搅拌下将15g中间体B溶解于150毫升乙腈；20毫升28％水合肼溶液滴加到反应液中，室温搅拌过夜；TLC显示反应完成，过滤，滤饼用水溶解，用1N盐酸溶液调节至PH为5～6，室温搅拌8小时，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取三次，水相加乙腈搅拌过夜，过滤，滤饼用水溶解，离子树脂柱铵化后，收集含产品部分，重结晶，得到化合物Glupa-C：7.5克，收率：67％；

化合物Glupa-C为白色粉末，HNMR:DMSO-d6,δ1.95-2.03(m,2H),2.50-2.57(m,2H),3.28-3.35(m,3H),7.57-7.79(m,8H),11.07(brs,1H)。

以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。