一种检测免疫治疗产生的特异性抗体功能的试剂盒及方法

摘要

本发明一种检测免疫治疗产生的特异性抗体功能的试剂盒及方法，属于生物医学领域。所述方法包括：特异性结合IgE的Fc受体、过敏原、抗人IgE抗体。所用方法利用所述试剂盒基于ELASA方法对过敏原特异性抗体进行检测。利用本发明的试剂盒和方法检测过敏原特异性抗体，不需要B细胞的培养，无需用到流式细胞仪，可以在本领域常用的ELISA平台上实现，方便快捷。并且不需要参考血清，仅用患者的血清，检测患者自身产生的保护性非IgE抗体与IgE抗体的竞争，利用在常规的实验室可以得到推广，具有巨大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体地，涉及一种检测免疫治疗产生的特异性抗体功能的试剂盒及方法。

背景技术

过敏性疾病是由IgE介导的速发性I型变态反应性疾病。I型变态反应性疾病的发病机理是：有过敏体质的患者，接触过敏原后产生Th2的细胞因子如白介素-4或白介素-13诱导B细胞产生过敏原特异性IgE。而产生的IgE会与肥大细胞表面上的高亲和力受体FcR结合。当机体再次接触过敏原，过敏原通过粘膜屏障进入体内后，会与肥大细胞表面的过敏原特异性IgE结合。当两个IgE分子与一个过敏原分子交联后就会引起肥大细胞脱颗粒，释放大量的炎症因子如组胺、白三烯等。这些炎症因子随体液循环到不同的靶器官，如循环到支气管就引起支气管平滑肌收缩，引起支气管痉挛，从而产生哮喘症状；又如循环到鼻粘膜组织，产生喷嚏、流涕等鼻炎的症状。

过敏原特异性免疫治疗是迄今为止治疗过敏性疾病的唯一对因治疗。过敏原特异性免疫治疗后会使机体产生大量的过敏原特异性保护性抗体，如过敏原特异性IgG4抗体。这些抗体可以通过竞争性结合过敏原，抑制IgE与过敏原的结合，从而使肥大细胞上结合的IgE由于不能结合过敏原而不能造成肥大细胞脱颗粒，也不能产生相应的症状。因此机体可以对过敏原产生耐受。过敏原特异性免疫治疗与常规的药物治疗最大的不同是停止治疗以后，疗效依然持续。

寻找能指示免疫治疗疗效的生物指标一直都是这个领域的研究热点和难点。虽然知道过敏原特异性IgG4是免疫治疗产生的最主要的保护性抗体，但是特异性IgG4的浓度与疗效并不直接相关。现有技术检测保护性抗体功能的方法学需要用到B细胞培养以及流式细胞仪检测，还需要用到参考血清作为基线。参考血清是患者有高响应的血清，需要的量很大，因为如果换参考血清，基线也会改变，所以一般都要储备100mL以上，这在临床上很难实现。同时由于使用了参考血清，产生的保护性抗体对IgE的抑制作用也会因为有外源性IgE的参与不能真实地反应患者接受免疫治疗以后所产生的自身抗体间竞争性结合过敏原的真实状态。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明旨在建立一种可以检测过敏原特异性抗体的抑制IgE结合过敏原的功能，并且还能检测免疫治疗停止以后的患者体内的保护性抗体是否还有抑制IgE的功能的方法。为此，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种检测过敏原特异性抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：特异性结合IgE的Fc受体、过敏原、抗人IgE抗体。

过敏原特异性抗体即针对过敏原的保护性抗体，这些抗体能够与与IgE竞争结合过敏原，从而抑制IgE与过敏原结合，避免机体产生过敏性疾病。

人源Fc受体(FcR)是一类与抗体Fc片段具有亲和性的分子，其广泛存在于NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞待的表面。按FcR所结合的Ig种类可将其分为五类，即FcγR、FcεR、FcαR、FcμR和FcδR，其中特异性结合IgE的FcR为FcεR受体。

在本发明的一些实施方案中，所述特异性结合IgE的FcR为FcεR I或FcεR II。

在本发明的一些具体实施方案中，所述特异性结合IgE的FcR为FcεR II。

FcεRⅡ即CD23，是IgE的一种低亲和力受体，是一个45KD的糖蛋白，它是唯一的不属于Ig超家族的Fc受体。

在本发明的一些实施方案中，所述抗人IgE抗体利用生物素进行标记。在本发明的一些具体实施方案中，所述抗人IgE抗体为鼠抗人IgE抗体。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括酶标记的亲和素。在本发明的一些具体实施方案中，所述酶为辣根过氧化物酶。在本发明的一些具体实施方案中，所述酶为辣根过氧化物酶，所述亲和素为链霉亲和素。链霉亲和素(streptavidin，SA)是由链霉菌Streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素，并且不带任何糖基，因此一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数(K)为10

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括TMB显色液和稀硫酸终止液。

在本发明中，所述过敏原包括但不限于花粉、尘螨、宠物毛发。

本发明第二方面提供一种检测生物样本中过敏原特异性抗体的方法，包括以下步骤：

S1，将特异性结合IgE的Fc受体包被至酶标板上并利用BSA-PBS溶液封闭，将过敏原与生物样本混合孵育制备过敏原-生物样本混合物；

S2，将过敏原-生物样本混合物加入至酶标板中，室温孵育过夜；

S3，加入生物素标记的抗人IgE抗体，37℃孵育0.5～2小时；

S4，加入酶标记的亲和素，37℃孵育0.5～2小时；

S5，加入TMB显色20-40分钟后加入稀硫酸中终止反应，在酶标仪450nm处读取OD值。

在本发明的一些实施方案中，所述特异性结合IgE的Fc受体为FcεR。在本发明的一些具体实施方案中，所述特异性结合IgE的Fc受体为FcεR II。

在本发明的一些具体实施方案中，所述抗人IgE抗体为鼠抗人IgE抗体。

在本发明的一些实施方案中，步骤S4中加入辣根过氧化物酶标记的亲和素。在本发明的一些具体实施方案中，步骤S4中加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

在本发明中，所述方法是基于非诊断非治疗目的的方法。

本发明的其它方面还提供特异性结合IgE的Fc受体、过敏原和人IgE抗体在制备用于检测免疫治疗产生的保护性抗体功能的试剂盒中的应用。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有效效果：

利用本发明的试剂盒和方法检测过敏原特异性抗体即保护性抗体不需要B细胞的培养，无需用到流式细胞仪，可以在本领域常用的ELISA平台上实现，方便快捷。

利用本发明的试剂盒和方法检测过敏原特异性抗体，不需要参考血清，仅用患者的血清，检测患者自身产生的保护性非IgE抗体与IgE抗体的竞争，利用在常规的实验室可以得到推广，具有巨大的应用价值。

附图说明

图1示出了本发明实施例2中免疫治疗后人体血清中保护性抗体的功能。

图2示出了本发明实施例2中免疫治疗后人体血清中IgE含量。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1检测免疫治疗产生的保护性抗体功能的方法

本实施例提供一种检测免疫治疗产生的保护性抗体功能的方法，是一种四层双抗夹心ELISA方法，具体如下：

第一层：

包被50μL/孔10μg/mL CD23(北京义翘神州科技股份有限公司，规格50μg或100μg)，在4℃孵育过夜。第二天，洗板后，加入200μL/孔2％BSA-PBS溶液在37℃封闭1小时。

同时用另外的试管将60μg/mL尘螨萃取物(爱尔开-阿贝优，丹麦)PBS溶液与待检测保护性抗体功能的人血清以1:8(v/v)预先在37℃孵育1小时，制备过敏原-IgE复合物。

第二层：

在酶标板中加入40μL/孔过敏原-IgE复合物，在室温孵育过夜。

第三层：

加入100μL/孔50ng/mL生物素标记的鼠抗人IgE(BD生命科学，规格0.5mg/ml)抗体，37℃孵育1小时。

第四层：

加入100μL/孔62.5ng/mL辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，37℃孵育1小时。

第五层：

加入100μL/孔TMB显色30分钟后加入100μL/孔0.5M稀硫酸中终止反应，在酶标仪450nm处读取OD值。

该方法的检测结果以过敏原-IgE复合物在CD23上结合的量表示，具体表现为OD450nm读数。OD450nm越高，表明与CD23结合的过敏原-IgE复合物的量越高，血清中保护性抗体越少；反之，OD450nm越低，表明与CD23结合的过敏原-IgE复合物的量越低，血清中保护性抗体越多。

过敏原特异性免疫治疗前，患者血清中的特异性IgE能与过敏原结合形成复合物与CD23大量结合，在OD450nm上会有高吸收。而过敏原特异性免疫治疗后，患者体内产生了过敏原特异性保护性抗体，由于保护性抗体同样也能跟过敏原形成复合物，导致过敏原-IgE复合物的形成减少，而未与过敏原结合的IgE不能与CD23结合，从而导致在CD23上的结合IgE减少，最后在OD450nm上的读数降低。保护性抗体越强，OD450nm上的读数越低，反之亦然。

实施例2实施例1方法的应用

使用实施例1的方法检测了87例接受屋尘螨皮下注射免疫治疗的患者治疗前和治疗后不同时间以及停止治疗以后的屋尘螨特异性保护性抗体的功能。结果如图1所示，由图1可知，过敏原特异性治疗后与治疗前的过敏原-IgE在CD23上的结合的量存在显著性差异(‘*’表示为P<0.0001)。

从图1可以看到患者在免疫治疗4个月后的产生的保护性抗体就可以显著性抑制IgE与过敏原的结合，提示疗效已开始显现。并且保护性抗体对IgE的抑制作用在整个3年的免疫治疗期间持续保持高水平，使得过敏原-IgE在CD23上的结合保持低水平。在免疫治疗停止以后，免疫治疗产生的保护性抗体的功能依然持续，虽然抑制能力有所减弱，但是依然保持了免疫治疗4-6个月时的水平，表明过敏原特异性免疫治疗有长期疗效。

用ImmunoCAP(Thermo Scientific，Uppsala)过敏原特异性的IgE检测系统检测过敏原特异性IgE的水平，结果如图2所示。结果显示，在免疫治疗前后以及停止治疗后，IgE的水平没有显著变化，表明图1的保护性抗体的抑制功能确实是由保护性抗体引起的，而不是由于IgE的水平变化引起的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。