阿尔茨海默病生物标志物及其应用

摘要

本发明公开了一组阿尔茨海默病生物标志物及其应用，具体涉及这一组生物标志物及其在血清中含量变化程度在阿尔茨海默病预防、诊断和制备诊断工具中的应用，包括：与正常人均值相比，血清中载脂蛋白M、激肽原1、血小板因子4、中间α‑球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型和载脂蛋白A‑IV 26kDa片段亚型的表达显著降低且降低幅度≥50％；与正常人均值相比，血清中载脂蛋白L1含量、载脂蛋白L1与载脂蛋白M含量比值、中间α‑球蛋白抑制因子H4全长亚型与中间α‑球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型含量比值以及载脂蛋白A‑IV全长亚型与载脂蛋白A‑IV 26kDa片段亚型含量比值显著升高且升高倍数≥3。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一组血清生物标志物在阿尔茨海默病预防、诊断和制备诊断工具中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是一种进行性和持续性的神经退行性疾病，临床表现为记忆力丧失和认知功能受损，严重的患者可能会出现神经精神症状。AD主要的病理特征表现为Aβ沉积形成老年斑，Tau蛋白过度磷酸化所致的神经元纤维缠结和神经元凋亡。目前全球AD的发病率在持续增加，据阿尔茨海默病联盟2016年统计，在美国大约有530万人口患有AD，预计到2050年将超过1380万，到2050年，全球AD患者的数量将达到1亿。在我国，2014年统计结果显示65周岁以上老年人中AD的患病率在已达3.21％，2018年我国AD患者的数量已超过700万人，显然目前我国已成为AD第一大国。

AD发病隐匿且进展缓慢，在出现临床症状前已经发病多年，因此AD在疾病早期难以诊断。100多年前AD首次被发现，但是至今AD的发病机制尚不明确，因此目前AD靶点药物的研发状况并不理想，大多数药物均已失败告终。目前FDA 批准用于治疗AD的药物包括胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂，但是这些药物均是以改善症状为主，既不能彻底治愈AD也不能减缓疾病的进展，因此目前AD尚无有效的治疗药物。鉴于AD上述的疾病特点，寻找有效的AD生物标志物用于AD预防、诊断、相关机制和药物靶点的研究显得尤为重要。虽然 AD患者脑脊液中低水平的Aβ

发明内容

发明目的：本发明是一组血清生物标志物在阿尔茨海默病预防、诊断和制备诊断工具中的应用。其目的在于解决目前阿尔茨海默病发病机制复杂，在早期难以诊断，目前尚无有效药物治疗以及脑脊液和神经影像学生物标志物在临床应用受限的问题。

技术方案：

一组用于阿尔茨海默病诊断或预后的分子标志物，其特征在于，分子标志物选自：载脂蛋白M、载脂蛋白L1、激肽原1、血小板因子4、中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型、中间α-球蛋白抑制因子H4的35kDa片段亚型或载脂蛋白A-IV 的26kDa片段亚型；或分子标志物选自蛋白质组合，其组合为载脂蛋白L1与载脂蛋白M、中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型与中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa 片段亚型或载脂蛋白A-IV全长亚型与载脂蛋白A-IV26kDa片段亚型。

检测样本中分子标志物的产品在制备诊断阿尔茨海默病或预测阿尔茨海默病预后的工具中的应用，其特征在于，分子标志物选自：载脂蛋白M、载脂蛋白L1、激肽原1、血小板因子4、中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型、中间α-球蛋白抑制因子H4的35kDa片段亚型或载脂蛋白A-IV的26kDa片段亚型；或分子标志物选自蛋白质组合，其组合为载脂蛋白L1与载脂蛋白M、中间α-球蛋白抑制因子 H4全长亚型与中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型或载脂蛋白A-IV全长亚型与载脂蛋白A-IV 26kDa片段亚型。

本发明中所述的样本中分子标志物的表达水平是指样本中分子标志物在血清中的含量与正常人均值相比的变化程度，包括样本血清中载脂蛋白M、激肽原1、血小板因子4、中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型和载脂蛋白A-IV 26kDa 片段亚型的表达与正常人的均值相比，显著降低且降低幅度≥50％；血清中载脂蛋白L1含量、载脂蛋白L1与载脂蛋白M含量比值、中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型与中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型含量比值以及载脂蛋白A-IV 全长亚型与载脂蛋白A-IV 26kDa片段亚型含量比值与正常人均值相比，是显著升高的且升高倍数≥3。

本发明的应用包括制备检测样本中分子标志物的表达水平的产品，所述的产品包括蛋白芯片、质谱技术、高通量蛋白质组学技术、ELISA、Western-blot或免疫组化。

本发明中所述的制备检测样本中分子标志物的表达水平的产品针对的检测技术包括可以检测一种或同时检测多种蛋白质的检测技术。

本发明中所述的检测样本中分子标志物的表达水平的样本包括血浆、血清、脑脊液或尿液。

有益技术效果：本发明的这些分子标志物可单独或联合用于阿尔茨海默病临床常规筛查、预防、早期诊断和候选药物的筛选，具有巨大的经济和社会效益。

附图说明

图1示载脂蛋白M在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况。

图2示载脂蛋白L1在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况。

图3示载脂蛋白L1与载脂蛋白M含量比值在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况和受试者工作特征曲线(ROC)分析。

图4示激肽原1在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况。

图5示血小板因子4在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况。

图6示中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型、中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型以及二者含量比值在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况和受试者工作特征曲线(ROC)分析。

图7示载脂蛋白A-IV全长亚型和载脂蛋白A-IV 26kDa片段亚型在阿尔茨海默病患者和正常人血清中的水平变化情况。

具体实施方式：

Western Blot实验

人血清总蛋白提取

取空腹静脉血4ml/人，置于真空负压不添加任何抗凝剂采血管中，室温静置2h后，将其离心(3000rpm×5min)4℃，得到的上清液即为血清，可小心将上清吸出(注意切勿吸出细胞成分)，分装备用。

蛋白定量

采用BCA法进行蛋白定量。取蛋白样品2μl，稀释200倍(至398μl)。在96孔板上，每孔加入稀释后的蛋白样品25μl，每个样品设两个复孔。蛋白标准设置8 个浓度：1μg/μL，0.5μg/μL，0.25μg/μL，0.125μg/μL，0.0625μg/μL，0.03125μg/μL， 0μg/μL，也按25μl/孔加样。各孔再加入200ul BCA工作液(BCA试剂A和试剂 B比例为50:1)，充分混匀，37℃放置30分钟后于波长562nm处测定OD值。根据标准曲线计算蛋白浓度。

SDS-PAGE电泳

(1)配制10％分离胶10ml(见下表)，将分离胶注入垂直放置的干净玻璃板间隙中，其顶层加入约1cm高度的无水乙醇覆盖胶面。室温下静置45min，可看见凝胶与无水乙醇之间有一水平的清晰界面，倾斜装置，如胶面无变化，可认为聚合基本完成。倒掉无水乙醇，用滤纸尽可能吸干凝胶顶部液体。

(2)SDS-PAGE凝胶配方表

(3)按上表配制5％浓缩胶5ml，将其注入玻璃板间隙后，立即插入洁净的Teflon梳子，垂直放置于室温，30min后聚合完成。拔出梳子，用双蒸水反复冲洗，并用针拨直梳齿。

(4)将样品与5×Loading Buffer按4：1比例混匀，100℃加热5min。

(5)将凝胶放入垂直电泳槽。上下槽各加入适量的1×SDS凝胶电泳缓冲液，梳孔中加入蛋白样品(60μg/lane)和蛋白质分子量标准，在所有不用的样品孔中加入等体积的凝胶上样缓冲液。

(6)将电泳装置与电源连接，样品在浓缩胶中泳动90min，电压为60V，当溴酚蓝进入分离胶后，将电压增大至120V，继续电泳直到溴酚蓝接近分离胶底部，切断电源。

(7)卸下并撬开玻璃板。

转膜

(1)剪6张与凝胶块大小相同的滤纸和一张PVDF膜(0.22μm)，将滤纸及海绵垫用转移缓冲液浸泡30min。

(2)打开转膜夹，将海绵垫、3张滤纸和凝胶按顺序对齐铺于其上，将PVDF膜于甲醇溶液中浸润10s左右，立即盖膜，盖膜后勿再移动。在膜上盖3张滤纸，最后盖上另一海绵垫。用玻璃棒逐层赶走气泡，合上夹板，放入转膜槽中(槽中转移缓冲液加至超过最上面的金属线，PVDF膜侧为阳极侧)。

(3)接通电源，电流为130mA，恒流电转2.5h。

抗原抗体反应

(1)封闭：电转移完毕后，将PVDF膜放入含5％脱脂奶粉的TBST中，室温振摇封闭2h以上。

(2)孵育一抗：将PVDF膜放于一洁净孵育盒中，向膜上均匀滴加一抗，4℃静置过夜。

(3)取出PVDF膜，用TBST室温洗膜5min×5次；

(4)孵育二抗：将PVDF膜转移至另一湿盒中，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温振摇孵育2h。

(5)取出PVDF膜，用TBST室温洗膜5min×5次。

显色反应

(1)将PVDF膜置于显色托盘上，均匀滴加Millipore化学发光液于PVDF膜上。

(2)LAS-3000凝胶成像仪检测化学发光并照相。

(3)用Bio-rad quantity one密度分析软件对图像中蛋白条带进行灰度分析。

(4)目的蛋白的定量：目的蛋白相对含量＝目的条带灰度值/IgG条带灰度值。

抗体：

Antibody against ApoL1,KNG1,PF4购自Abcam(Cambridge,UK),antibodyagainst ApoM购自Proteintech Group,Inc.(Chicago,IL,USA),antibody against ApoA-IV,ITIH4购自Santa Cruz Biotechnology(CA,USA).

统计学分析

结果以means±SEM表示。组间差异比较采用独立样本t检验(T-test)，P<0.05 为存在显著性差异。采用ROC曲线评价蛋白的临床诊断效能。

下面结合实施例，进一步说明本发明：

实验例1：载脂蛋白M在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况。

本发明人研究发现：如图1和表1所示，与正常组相比(1.00±0.06，n＝68)，阿尔茨海默病患者血清中载脂蛋白M含量是显著降低的且降低幅度将近50％(0.65 ±0.04，n＝68，p<0.01)。因此本发明结果提示，与正常人均值相比，血液中载脂蛋白M的含量显著降低以及降低幅度≥50％时可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。

表1.载脂蛋白M在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况

实验例2：载脂蛋白L1在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况。

本发明人研究发现：如图2和表2所示，与正常组相比(1.00±0.12，n＝68)，阿尔茨海默病患者血清中载脂蛋白L1是显著增加的，且增加幅度大于1.5倍(1.63 ±0.11，n＝68，p<0.01)。因此，本发明结果提示，与正常人均值相比，血液中载脂蛋白L1的含量显著增加以及增加幅度≥3倍时可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。

表2.载脂蛋白L1在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况

实验例3：载脂蛋白L1与载脂蛋白M含量比值在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况和受试者工作特征曲线(ROC)分析。

本发明人研究发现：如图3和表3所示，与正常组相比(1.00±0.46，n＝8)，阿尔茨海默病患者血清中载脂蛋白L1和载脂蛋白M的含量比值是显著升高的且升高幅度为2.5倍(2.52±0.89，n＝8，p<0.01)。ROC曲线分析结果显示，载脂蛋白L1、载脂蛋白M以及载脂蛋白L1与载脂蛋白M含量比值的ROC曲线下面积 (AUC)分别是0.797、0.844和0.938。因此，本发明结果提示，该蛋白质组合与单一生物标志物相比，能够明显的区分阿尔茨海默病患者和正常人，诊断效能显著提高。因此，血液中载脂蛋白L1和载脂蛋白M的含量比值增加以及增加幅度≥3 倍时可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。

表3.载脂蛋白L1、载脂蛋白M和载脂蛋白L1/M在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况、95％置信区间和受试者工作特征曲线(ROC)分析结果

实验例4：激肽原1在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况。

本发明人研究发现：如图4和表4所示，与正常组相比(1.00±0.08，n＝68)，阿尔茨海默病患者血清中激肽原1含量是显著降低的且降低幅度大于50％(0.45± 0.05，n＝68，p<0.01)。因此本发明结果提示，与正常人均值相比，血液中激肽原1 的含量显著降低以及降低幅度≥50％时可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。

表4.激肽原1在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况

实验例5：血小板因子4在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况。

本发明人研究发现：如图5和表5所示，与正常组相比(1.00±0.10，n＝68)，阿尔茨海默病患者血清中血小板因子4含量是显著降低的且降低幅度接近50％ (0.49±0.04，n＝68，p<0.01)。因此本发明结果提示，与正常人均值相比，血液中血小板因子4的含量显著降低以及降低幅度≥50％时可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。

表5.血小板因子4在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况

实验例6：中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型、中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段亚型以及二者含量比值在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况和受试者工作特征曲线(ROC)分析。

本发明人研究发现：如图6和表6所示，与正常组相比(1.00±0.10，n＝68)，阿尔茨海默病患者血清中中间α-球蛋白抑制因子H4全长亚型(ITIH4-120 kDa) 含量是升高的且升高幅度为1.8倍(1.83±0.11，n＝68，p<0.01)；而与正常组相比 (1.00±0.07，n＝68)，中间α-球蛋白抑制因子H4 35kDa片段(ITIH4-35kDa)在阿尔茨海默病患者血清中的含量是下降的且降低幅度>50％(0.23±0.05，n＝68， p<0.01)；在上述结果基础上，将ITIH4-120kDa和35kDa的含量作比值(ITIH4-120 kDa/ITIH4-35kDa)，结果显示，与正常人均值相比(1.00±0.50，n＝68)，该蛋白质组合在阿尔茨海默病患者血清中含量升高更为显著(14.5±2.64，n＝68，p<0.01)。 ROC曲线分析结果显示，ITIH4-120 kDa、ITIH4-35kDa和ITIH4-120 kDa/ITIH4-35kDa的ROC曲线下面积(AUC)分别是0.776、0.912和0.928，说明这3个生化指标均具有很好的诊断效能。因此，本发明结果提示，与正常人均值相比，血液中ITIH4-120kD含量和ITIH4-120 kDa/ITIH4-35kDa含量比值增加且增加幅度≥3倍以及血液中ITIH4-35kDa表达降低且降低幅度>50％时均可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。

表6.中间α-球蛋白抑制因子H4-120kDa、中间α-球蛋白抑制因子H4-120kDa和中间α-球蛋白抑制因子H4-120/35kDa在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况、 95％置信区间和受试者工作特征曲线(ROC)分析结果

实验例7：载脂蛋白A-IV全长亚型和载脂蛋白A-IV 26kDa片段亚型在阿尔茨海默病(AD)患者和正常人血清中的水平变化情况。

本发明人研究发现：如图7和表7所示，与正常组相比，载脂蛋白A-IV全长亚型(ApoA-IV46 kDa)在两组中的表达无显著变化，而该蛋白的片段形式(约 26kDa)在阿尔茨海默病患者血清中表达显著降低且降低幅度>50％(n＝16)；因此本发明结果表明，与正常人均值相比，血液中ApoA-IV 26kDa亚型含量显著减低且降低幅度≥50％以及ApoA-IV分子量46kDa与26kDa亚型的含量比值显著增加且增加倍数≥3时均可用于阿尔茨海默病临床筛查、预防、诊断、候选药物靶点和制备阿尔茨海默病诊断试剂。

表7.载脂蛋白A-IV46 kDa、载脂蛋白A-IV26 kDa和载脂蛋白A-IV46/26kDa在健康对照组和AD患者组血清中的表达情况

表8.阿尔茨海默病患者和健康对照组的人口统计学和临床特征

MMSE：简易精神状态检查分数；Glu：血糖；TC：血清总胆固醇；TG：血清总甘油三脂。