一种改良L-15培养基及其在培养对虾肌肉细胞中的应用

摘要

本发明公开了一种改良L‑15培养基及其在培养对虾肌肉细胞中的应用。所述的改良L‑15培养基含有10mmol/L丙氨酸、3mmol/L甘氨酸、3mmol/L丝氨酸、1.5mmol/L组氨酸、0.5mmol/L赖氨酸、1.5mmol/L精氨酸、1.5mmol/L缬氨酸、1mmol/L苏氨酸、0.5mmol/L蛋氨酸、0.5mmol/L亮氨酸、5mmol/L天冬氨酸、0.5mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L苯丙氨酸；还含有牛磺酸、脯氨酸、谷氨酸、胎牛血清、双抗，pH值为7.2‑7.4。本发明的改良L‑15培养基提高了南美白对虾原代肌肉细胞的存活率和贴壁率，改善细胞生长状态。

说明书

技术领域

本发明涉及一种改良L-15培养基及其在培养对虾肌肉细胞中的应用。

背景技术

对虾细胞系的建立是研究病毒致病机理、分离纯化对虾病毒、发展有效诊断试剂的基础。对虾细胞系的成功建立不仅可以精确控制实验条件，还可以大大降低实验成本，获得更好的研究结果。培养基是培养细胞不可缺失的一部分，现有的培养基还不能满足对虾细胞建系，所以细胞培养基的优化是虾细胞成功建系的关键之一，这对研究虾细胞体外培养具有重要意义。

目前没有专门针对对虾的细胞培养基，对虾细胞培养主要还是采用改良的哺乳动物或昆虫细胞培养基，例如L-15、M199、RPMI、Grace等。其中L-15和M199培养基已证明能够支持对虾部分组织细胞的生长，比如卵巢细胞、性腺细胞等。肌肉占对虾身体的大部分，研究肌肉细胞对对虾的研究和发展具有重要意义。

中国发明专利CN103232969 B公开了一种对虾细胞培养基的保存液，以1.5×L-15培养基为基础培养基，并添加体积比为10％的对虾肌肉提取液、5g/L氯化钠、2g/L葡萄糖、1g/L碳酸氢钠、10μg/mL牛磺酸、10μg/mL脯氨酸、100IU/mL青霉素钠和100μg/mL硫酸链霉素；pH值为7.3-7.5。

然而，上述专利对细胞的氨基酸需求没有精确测定，仅1.5倍扩大L-15培养基所有成分。并且，其原代细胞提取方法为组织块培养，需培养几个小时甚至几天后才能得到细胞，且在培养过程中，组织块培养法更容易受到污染。该专利的培养基工作液还加入了20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和20ng/mL表皮生长因子(EGF)，大大增加了成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改良L-15培养基及其在培养对虾肌肉细胞中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种改良L-15培养基，含有10mmol/L丙氨酸、3mmol/L甘氨酸、3mmol/L丝氨酸、1.5mmol/L组氨酸、0.5mmol/L赖氨酸、1.5mmol/L精氨酸、1.5mmol/L缬氨酸、1mmol/L苏氨酸、0.5mmol/L蛋氨酸、0.5mmol/L亮氨酸、5mmol/L天冬氨酸、0.5mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L苯丙氨酸，培养基其他原料的种类和浓度与L-15培养基相同；

所述的改良L-15培养基还含有2.5mmol/L牛磺酸、50mmol/L脯氨酸、20mmol/L谷氨酸、10％胎牛血清(FBS)、100IU/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素，pH值为7.2-7.4。

上述的改良L-15培养基可以用于培养对虾肌肉细胞；

具体地，取上述的改良L-15培养基，加入培养基10％体积的对虾肌肉细胞提取液，在27℃恒温、5％CO

所述的更换培养基，是将培养体系离心(1000r/min离心5min)，取沉淀物，弃去培养基，加入新培养基；

所述的对虾肌肉细胞提取液，由以下步骤制得：

(1)将对虾灭菌，然后剪取肌肉，放入含5％双抗的PBS溶液中润洗，接着放入乙醇溶液中润洗，再放入含5％双抗的PBS溶液中润洗，最后放入含有5％双抗的培养基中浸泡至少30min；

步骤(1)所述的对虾为南美白对虾；

步骤(1)所述的灭菌，优选在0.02g/L的高锰酸钾溶液中浸泡至少5min；

步骤(1)所述的乙醇溶液优选75％乙醇溶液；

(2)将对虾肌肉取出剪碎成乳糜状，加入含有10％胎牛血清(FBS)和1％双抗的培养基，将对虾肌肉吹散均匀后过筛，再加入含有5％双抗的培养基重悬并离心，最后用10％胎牛血清(FBS)和1％双抗的培养基稀释，得到对虾肌肉细胞提取液；

步骤(2)所述的过筛是过100μm的细胞筛；

步骤(1)和(2)所述的双抗优选青霉素和链霉素；

步骤(1)和(2)所述的培养基为L-15或M199培养基。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)使用本发明的改良L-15培养基，南美白对虾原代肌肉细胞能够更快形成细胞单层，在接种24h可以形成70％-80％左右的汇合度的细胞单层。

(2)本发明的改良L-15培养基提高了南美白对虾原代肌肉细胞的存活率和贴壁率，改善细胞生长状态。

(3)使用本发明的改良L-15培养基对南美白对虾原代肌肉细胞进行培养，在培养过程中不仅用PBS将组织块进行润洗，还用75％酒精对组织块进行润洗，降低了污染的风险。在剪碎组织块后，不是立刻接种，而是将组织块吹成水状后过筛，通过离心的方法得到细胞再接种。此相对于组织块培养法的优点：

A、减少了细胞受污染的风险。

B、可以直接通过离心得到细胞，不需要等待接种几小时甚至几天后才能得到细胞。

附图说明

图1是不同浓度丙氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图2是不同浓度甘氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图3是不同浓度丝氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图4是不同浓度组氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图5是不同浓度赖氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图6是不同浓度精氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图7是不同浓度缬氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图8是不同浓度苏氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图9是不同浓度蛋氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图10是不同浓度亮氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图11是不同浓度天冬氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图12是不同浓度谷氨酰胺培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图13是不同浓度苯丙氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图14是不同浓度牛磺酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图15是不同浓度脯氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图16是不同浓度谷氨酸培养基对对虾原代肌肉细胞3d存活率的影响。

图17是使用不同培养基培养的南美白对虾原代肌肉细胞生长状态图；其中：

1-1、1-2和1-3分别表示用L-15培养基培养的南美白对虾原代肌肉细胞生长24小时、48小时和72小时的生长状态；

2-1、2-2和2-3分别表示用M199培养基培养的南美白对虾原代肌肉细胞生长24小时、48小时和72小时的生长状态；

3-1、3-2和3-3分别表示用本发明改良L-15培养基培养的南美白对虾原代肌肉细胞生长24小时、48小时和72小时的生长状态。

图18是使用不同培养基培养的南美白对虾原代肌肉细胞3d的存活率对比图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

制备对虾肌肉细胞提取液，包括以下步骤：

(1)将南美对虾灭菌，然后剪取肌肉，放入含5％双抗(青霉素和链霉素；下同)的PBS溶液中润洗，接着放入乙醇溶液中润洗，再放入含5％双抗的PBS溶液中润洗，最后放入含有5％双抗的L-15培养基中浸泡至少30min；

(2)将对虾肌肉取出剪碎成乳糜状，加入含有10％胎牛血清(FBS)和1％双抗的L-15培养基，将对虾肌肉吹散均匀后过100μm的细胞筛，再加入含有5％双抗的L-15培养基重悬并离心，最后用10％胎牛血清(FBS)和1％双抗的L-15培养基稀释，得到对虾肌肉细胞提取液；

将南美白对虾肌肉细胞接种在96孔板内培养，初次接种细胞为每孔培养皿面积的40％，每孔加入100μL培养基且每孔加入的细胞量相同。

为了精确测定细胞对氨基酸的需求，除所测氨基酸外，培养基其他成分及浓度与L-15培养基一致，分别配制不同氨基酸浓度的培养基进行细胞培养。例如测组氨酸浓度：分别配制含有0，0.5，1，1.5，2，3，5，10mmol/L组氨酸的培养基，除组氨酸浓度变化外，其余成分不变。用不同组氨酸浓度的培养基分别培养等量的肌肉细胞。培养3d后，使用CCK-8试剂和酶标仪测定其OD值。

结果如图1-图13所示。

由图1可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适丙氨酸浓度为10mmol/L。

由图2可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适甘氨酸浓度3mmol/L。

由图3可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适丝氨酸浓度为3mmol/L。

由图4可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适组氨酸浓度为1.5mmol/L。

由图5可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适赖氨酸浓度为0.5mmol/L。

由图6可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适精氨酸浓度为1.5mmol/L。

由图7可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适缬氨酸浓度为1.5mmol/L。

由图8可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适苏氨酸浓度为1mmol/L。

由图9可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适蛋氨酸浓度为0.5mmol/L。

由图10可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适亮氨酸浓度为0.5mmol/L。

由图11可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适天冬氨酸浓度为5mmol/L。

由图12可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适谷氨酰胺浓度0.5mmol/L。

由图13可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适苯丙氨酸浓度为1mmol/L。

在L-15培养基的基础上，添加一种氨基酸，进行细胞培养，培养3d后，使用CCK-8试剂和酶标仪测定其OD值。

结果如图14-图16所示。

由图14可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适牛磺酸浓度为2.5mmol/L。

由图15可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适脯氨酸浓度为50mmol/L。

由图16可知，培养南美白对虾原代肌肉细胞最适谷氨酸浓度为20mmol/L。

实施例2

依据实施例1的实验结果，本发明设计一种改良L-15培养基，含有10mmol/L丙氨酸、3mmol/L甘氨酸、3mmol/L丝氨酸、1.5mmol/L组氨酸、0.5mmol/L赖氨酸、1.5mmol/L精氨酸、1.5mmol/L缬氨酸、1mmol/L苏氨酸、0.5mmol/L蛋氨酸、0.5mmol/L亮氨酸、5mmol/L天冬氨酸、0.5mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L苯丙氨酸，培养基其他原料的种类和浓度与L-15培养基相同；还含有2.5mmol/L牛磺酸、50mmol/L脯氨酸、20mmol/L谷氨酸、10％FBS、100IU/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素，pH值为7.2-7.4。

将南美白对虾肌肉细胞接种在96孔板内培养，初次接种细胞为每孔培养皿面积的40％，每孔加入100μL培养基且每孔加入的细胞量相同。

实验分为L-15培养基组，M199培养基组和本发明的改良L-15培养基组，每组五个重复。培养3d后，使用CCK-8试剂和酶标仪测定其OD值。且在24h,48h和72h分别拍摄对虾原代肌肉细胞生长状态图。

L-15培养基与M199培养基均为Gibco官网所购买。

结果表明，应用本发明的改良L-15培养基培养南美白对虾肌肉细胞具有很好的效果(图17)，细胞生长最快，细胞单层达到70％-80％汇合度所需时间24h；细胞贴壁较紧，状态好。而其他培养基要72h才能形成70％-80％汇合度的细胞单层，细胞状态与贴壁性较差。

由图18可知，与L-15和M199培养基相比，应用本发明的细胞培养基培养南美白对虾肌肉细胞，细胞的存活率更高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。