一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III的方法及其所制备的SUMO_肝素酶III融合蛋白

摘要

本发明公开了利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III的方法及其所制备的肝素酶III，该制备方法包括下列步骤：选择来自肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶III序列，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，共659aa；去除信号肽序列，获得肝素酶III的DNA序列，如SEQIDNo.2；将所述肝素酶III的DNA序列插入带有N端SUMO蛋白标签的pSMART载体质粒；将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，通过发酵和纯化获得融合蛋白；用SUMO蛋白酶将SUMO标签蛋白从融合蛋白上切割下来，即获得肝素酶III。本发明的优点是：提高目标蛋白质的可溶性、促进目标蛋白质的正确折叠，避免形成包涵体；降低纯化成本、提高纯化效率；SUMO蛋白标签分子量较小，对肝素酶III的酶活性影响较小，获得纯化的肝素酶III。

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及涉及一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III(heparinase III)的方法。

背景技术

肝素酶主要从一些利用肝素为碳源的细菌中分离得到，最初来源于肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)，从肝素黄杆菌中分离纯化出的肝素酶有三种，分别为肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶的主要作用是降解肝素，在酶降解法生产低分子肝素和超低分子肝素中有广泛应用。

目前用于低分子肝素生产的肝素酶产品主要有两种来源：一是直接从产肝素酶的微生物中发酵提取(深圳市海普瑞药业股份有限公司， CN102286448B)；二是通过基因工程技术构建重组肝素酶工程菌，发酵提取重组肝素酶。

直接从产肝素酶的微生物(如肝素黄杆菌等)中提取肝素酶III，发酵条件和纯化工艺相对复杂，通过菌种选育提高产量的潜力有限。

基因工程重组技术已广泛应用于蛋白质制备，目前已有将麦芽糖结合蛋白(MBP)标签与肝素酶III形成融合蛋白等应用。采用基因工程重组技术在大肠杆菌系统中生产肝素酶III等外源蛋白质时面临两个挑战：一是所用蛋白质表达系统的表达水平较低；二是所表达的蛋白质被错误折叠进不溶性的聚集体——包涵体中，提取和复性困难。

目前，采用可溶性蛋白标签与肝素酶III形成融合蛋白，可以显著提高重组产物的溶解性。但是，类似谷胱甘肽巯基转移酶标签(GST-Tag)、麦芽糖结合蛋白标签(MBP-Tag)、转录抗终止因子A标签(NusA-Tag)等融合蛋白标签，因为分子量较大(26-55kDa)，会干扰目标蛋白质的正常功能，并且在表达和后续纯化过程中去除标签等环节相对降低了目标蛋白质的产率。

发明内容

为解决现有技术的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III(heparinase III)的方法，以极大地提高目标蛋白质的稳定性和可溶性，提高目标蛋白质的活性及产率。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

根据本发明的一个方面，提供了一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III(heparinase III)的方法，包括下列步骤：

S01：选择来自肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶III序列，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，共659aa；

S02：去除信号肽序列，获得肝素酶III的DNA序列，如SEQIDNo.2；

S03：将所述肝素酶III的DNA序列插入带有N端SUMO蛋白标签的 pSMART载体质粒；

S04：将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，经发酵和纯化获得SUMO_肝素酶III融合蛋白；

S05：用SUMO蛋白酶将SUMO标签蛋白从步骤S04所述的SUMO_肝素酶 III融合蛋白上切割下来，即获得肝素酶III。

进一步地，还包括融合蛋白表达条件的优化步骤。

进一步地，所述融合蛋白的优化条件是融合蛋白在15℃以0.2mmol/l 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。

进一步地，还包括融合蛋白的纯化步骤。

进一步地，所述融合蛋白的纯化步骤采用Ni柱亲和层析方法进行分离纯化。

进一步地，所述的SUMO标签蛋白从步骤S04所述的SUMO_肝素酶III 融合蛋白上切割下来是包括下列步骤：将所述融合蛋白透析更换缓冲液，加入适量的SUMO蛋白酶，混匀后置于4℃反应过夜，水解后的融合蛋白样本用Ni柱亲和层析方法将带有6个组氨酸片段的SUMO蛋白标签(能结合到Ni柱上)与肝素酶III(不能结合到Ni柱上)分离。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种按照上述方法制备的SUMO_ 肝素酶III融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3。

根据本发明的再一个方面，还提供了一种按照上述方法制备的肝素酶 III。

通过本发明的技术方案，利用SUMO融合表达系统制备的重组肝素酶 III，融合在目标蛋白质N端的较小的类泛素蛋白修饰物(small ubiquitin-like modifier，SUMO)标签蛋白，分子量大约11kDa，能够极大地提高目标蛋白质的稳定性和可溶性，对目标蛋白质的活性影响较小。并且，SUMO蛋白酶(SUMO Protease)是一种具有较高活性的半胱氨酸蛋白酶，它能识别SUMO标签蛋白的三级结构，而不是氨基酸序列，因此可以高效而且特异性地将SUMO标签蛋白从重组融合蛋白上切割下来，从而获得肝素酶III。

采用SUMO蛋白标签融合表达系统制备重组肝素酶III的优点：

1)提高目标蛋白质的可溶性、促进目标蛋白质的正确折叠，避免形成包涵体；

2)SUMO蛋白标签近N端有6个组氨酸片段，使融合蛋白可以用Ni柱亲和层析方法一步纯化，降低纯化成本、提高纯化效率；

3)SUMO蛋白标签分子量较小，对肝素酶III的酶活性影响较小，即使不切除融合蛋白中的蛋白标签，也能得到较高活性的肝素酶III；

4)SUMO蛋白酶能识别SUMO标签蛋白的三级结构，可以高效而且特异性地将SUMO标签蛋白从重组融合蛋白上切割下来，从而获得纯化的肝素酶III。

下面结合附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。对于所属技术领域的技术人员而言，从对本发明的详细说明中，本发明的上述和其他的目的、特征和优点将显而易见。

附图说明

图1为本发明一实施例中肝素酶III表达鉴定的SDS-PAGE电泳分析图；

图2为本发明一实施例中肝素酶III表达优化的SDS-PAGE电泳分析图；

图3为本发明一实施例中肝素酶III可溶性分析的SDS-PAGE电泳分析图；

图4为本发明一实施例中肝素酶III亲和纯化结果的SDS-PAGE电泳分析图；

图5为本发明一实施例肝素酶III免疫印迹Western Blot的SDS- PAGE电泳分析图；

图6为本发明一实施例中肝素酶III去除标签的SDS-PAGE电泳分析图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式及实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。

根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III(heparinase III)的方法，包括下列步骤：

S01：选择来自肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶III序列，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，共659aa；

S02：去除信号肽序列，获得肝素酶III的DNA序列，如SEQIDNo.2；

S03：将所述肝素酶III的DNA序列插入带有N端SUMO蛋白标签的 pSMART载体质粒；

S04：将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，经发酵和纯化获得融合蛋白；

S05:用SUMO蛋白酶将SUMO标签蛋白从步骤S04所述的融合蛋白上切割下来，即获得肝素酶III。

优选的，还包括融合蛋白表达条件的优化步骤。

优选的，所述融合蛋白的优化条件是融合蛋白在15℃以0.2mmol/l异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。

优选的，还包括融合蛋白的纯化步骤。

优选的，所述融合蛋白的纯化步骤采用Ni柱亲和层析方法进行分离纯化。

优选的，所述的SUMO标签蛋白从步骤S04所述的SUMO_肝素酶III融合蛋白上切割下来是包括下列步骤：将所述融合蛋白透析更换缓冲液，加入适量的SUMO蛋白酶，混匀后置于4℃反应过夜，水解后的融合蛋白样本用Ni柱亲和层析方法将带有6个组氨酸片段的SUMO蛋白标签(能结合到 Ni柱上)与肝素酶III(不能结合到Ni柱上)分离。

根据本发明的一典型实施方式，还提供了按照上述方法制备的SUMO_ 肝素酶III融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3。

根据本发明的一典型实施方式，还提供了一种按照上述方法制备的肝素酶III。

选择来自肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶III序列，共659aa,其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，发明人经蛋白质序列分析发现，肝素酶III没有跨膜结构，第1-24个氨基酸为信号肽 MTTKIFKRIIVFAVIALSSGNILA，后635个氨基酸为肝素酶III序列。采取大肠杆菌胞内表达方式制备肝素酶III，转入工程菌的序列应预先去除信号肽序列。将肝素酶III的DNA序列如SEQIDNo.2所示，插入带有N端SUMO 蛋白标签的pSMART载体质粒。将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，经SDS-PAGE验证，融合蛋白表达正常。融合蛋白由109aa的SUMO蛋白标签和635aa的肝素酶III组成，SUMO-肝素酶III融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。

经优化，确定融合蛋白在15℃以0.2mmol/l异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导表达最佳。

在融合蛋白靠近N端设计了6个组氨酸(histidine，H)序列，工程菌发酵液去除上清液，并将菌体破碎后，采用Ni柱亲和层析方法将融合蛋白分离纯化。

将纯化后的融合蛋白样品透析更换缓冲液，加入适量的SUMO蛋白酶，混匀后置于4℃反应过夜。水解后的融合蛋白样本用Ni柱亲和层析方法将带有6个组氨酸片段的SUMO蛋白标签(能结合到Ni柱上)与肝素酶III (不能结合到Ni柱上)分离。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例一

1.质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中

1.1将质粒2μL加入100μL感受态细菌中，置冰上30min；

1.2 42℃热激90s，迅速置冰中5min；加入500μL LB培养液；1.3 37℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含抗性的LB 平板，37℃倒置培养过夜。

2.表达鉴定

2.1挑取5个平板上单克隆接种于含适量抗性的4mL LB培养液的试管中；

2.2 37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8；

2.3取出1mL培养物，12000g室温离心5min，弃上清，用80μL 1×PBS缓冲液重悬菌体沉淀并加入20μL的5×Loading Buffer；

2.4向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，在37℃220 rpm振摇4h，诱导融合蛋白表达；

2.5取出0.5mL培养物，12000g室温离心5min，弃上清，用80μL 1×PBS缓冲液重悬菌体沉淀并加入20μL的5×Loading Buffer；

2.6进行12％SDS-PAGE分析，表达鉴定结果如图1所示，其中M：蛋白质分子量标记(Protein Marker)，1：诱导前样品，2：诱导后样品Ⅰ，3：诱导后样品Ⅱ，4：诱导后样品Ⅲ，5：诱导后样品Ⅳ，6：诱导后样品Ⅴ。

3.表达优化

3.1挑取划线平板上单克隆接种于13支含适量抗性的4mL LB培养液的试管中；

3.2 37℃、220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8；

3.3取出0.4mL培养物，12000g室温离心5min，弃上清，用80μL 1×PBS缓冲液重悬菌体沉淀加入20μL的5×Loading Buffer；

3.4向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.2mM与1mM，分别在37℃和15℃220rpm振摇4h和16h，诱导融合蛋白表达；

3.5取出0.2mL培养物，12000g室温离心5min，弃上清，用80μL 1×PBS缓冲液重悬菌体沉淀加入20μL的5×Loading Buffer。

3.6进行SDS-PAGE分析,表达优化结果如图2所示，其中

M：蛋白质分子量标记(Protein Marker)；

1：未诱导样品；

2-4：37℃、1.0mM IPTG诱导后样品；

5-7：37℃、0.2mM IPTG诱导后样品；

8-10：15℃、1.0mM IPTG诱导后样品；

11-13：15℃、0.2mM IPTG诱导后样品。

4.可溶性分析

取37℃诱导后菌液和15℃诱导后菌液2mL，12000g室温离心5min，弃上清，用1mL的Buffer A(20mM Tris，300mM NaCl，10％Glycerol， pH8.0)重悬离心后沉淀，超声波破碎(Φ3，15％，2s/8s，10min)，上清沉淀分别制样，进行12％SDS-PAGE分析，15℃诱导下，融合蛋白均可溶，可溶性分析结果如图3所示，其中

M：蛋白质分子量标记(Protein Marker)；

1：未诱导样品；

2：诱导后样品；

3：37℃、1.0mM IPTG诱后沉淀样；

4：37℃、1.0mM IPTG诱后上清样；

5：37℃、0.2mM IPTG诱后沉淀样；

6：37℃、0.2mM IPTG诱后上清样；

7：15℃、1.0mM IPTG诱后沉淀样；

8：15℃、1.0mM IPTG诱后上清样；

9：15℃、0.2mM IPTG诱后沉淀样；

10：15℃、0.2mM IPTG诱后上清样。

5.放大表达与亲和纯化

5.1取最优克隆保种菌接种至含合适抗生素的1L LB培养基中， 37℃、220rpm振摇至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM IPTG后， 15℃、220rpm振摇16h。

5.2利用8000rpm离心10min，弃去上清，收集所有菌体。

5.3使用Buffer A(20mM Tris，300mM NaCl，10％Glycerol，pH 8.0)重悬菌体，超声破碎(Φ10，15％，2s/8s，30min)。16000rpm离心10min，收集上清。

5.4在上清中加入2mL Ni-NTA，混匀后4℃孵育1h。

5.5将孵育物加入空柱管，收集流出液。

5.6分别以Buffer B(20mM Tris，300mM NaCl，10％Glycerol， 20mM Imidazole，pH 8.0)与Buffer C(20mM Tris，300mM NaCl， 10％Glycerol，40mM Imidazole，pH 8.0)清洗填料，收集清洗液。

5.7利用Buffer D(20mM Tris，300mM NaCl，10％Glycerol， 500mM Imidazole，pH8.0)洗脱，收集洗脱液。

5.8SDS-PAGE电泳检测，亲和纯化结果如图4所示，其中

M：蛋白质分子量标记(Protein Marker)

1：破碎后沉淀

2：破碎后上清

3：Ni-NTA孵育后流出液

4：Buffer B清洗样

5：Buffer C清洗样

6：Buffer D洗脱样。

6.免疫印迹(Western Blot)分析

6.1SDS-PAGE

电泳样品：预染色的蛋白质分子量标记(Protein Marker)， Buffer D洗脱样

电泳条件：200V，60min

6.2半干式电转印

a.在电泳的正在进行的时候，将PVDF膜切出与凝胶一样大小，并剪去一个小角，帮助判断方向，放置在甲醇中浸泡30s，后转移到电转液中。

b.薄滤纸和厚滤纸切出比凝胶略大一些，各两张，置转移缓冲液浸泡。

c.电泳完成后，将胶的浓缩胶切除，放置在电转液中。按照厚滤纸，薄滤纸，NC膜，胶，薄滤纸，厚滤纸顺序放置在电转仪平面上。

d.每层之间的气泡要全部去除。可以用手轻轻按住一端，再用50mL 离心管轻轻在上层往一边移动去除气泡，再将手换一端，离心管往另外一端去除气泡。

e.将电转仪链接到仪器上设置，30V，蛋白小于50KDa，用 30mins；蛋白大于50KDa，用45mins。

6.3膜的封闭和抗体孵育及最终处理

a.洗转印膜：室温用1×PBST漂洗5min共3次,在加入任何溶液的时候都不得在膜上加入，沿盒子的角缓慢加入，以免将膜上结合的物质冲掉，摇床转速40rpm。

b.将PBST倒掉，放入5％脱脂奶粉的封闭液内，摇床调到最低转速，室温封闭2h。

c.室温用1×PBST漂洗5min，共3次.

d.加入抗体(1：2000到5％脱脂奶粉中)，孵育1h，使用后回收到-20℃。

e.室温用1×PBST漂洗5min，共3次。

f.缓慢加入少量ECL液，能将膜全部覆盖，静置2min后拍照，如图5所示，其中，M：蛋白质分子量标记(Protein Marker)，Sample： Buffer D洗脱样。

7.去除标签蛋白

7.1将洗脱样全部透析至Buffer A(20mM Tris，300mM NaCl， 10％Glycerol，pH8.0)中。

7.2透析完成后，在融合蛋白中加入适量的SUMO蛋白酶(SUMO Protease)，混匀后，放置于4℃反应过夜。

7.3将反应完成后的产物，加入Ni-NTA纯化柱中，缓慢上样，收集流出液。

7.4利用Buffer A(20mM Tris，300mM NaCl，10％Glycerol，pH 8.0)清洗纯化柱。

7.5利用Buffer D(20mM Tris，300mM NaCl，10％Glycerol，500mM Imidazole，pH8.0)洗脱。

7.6 SDS-PAGE电泳，如图6所示，其中：

M：蛋白质分子量标记(Protein Marker)

1：酶切反应前样品

2：酶切反应后样品

3：酶切后过柱流出样(肝素酶III)

4：酶切后过柱清洗样

5：酶切后过柱洗脱样(SUMO蛋白标签)。

综上，将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，经SDS-PAGE验证，融合蛋白表达正常。各优化条件下，融合蛋白均表达明显，且融合蛋白在15℃诱导温度下可溶性更好，选择15℃下0.2mM IPTG诱导，Ni-NTA纯化后去除标签得到无融合标签的目的蛋白肝素酶III。

当然，本发明还可有其他实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，所属技术领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。

SEQ ID No.1:

肝素酶III(Heparinase III)的氨基酸序列：

MTTKIFKRIIVFAVIALSSGNILAQSSSITRKDFDHINLEYSGLEKVNKAVAAGNYDDAA KALLAYYREKSKAREPDFSNAEKPADIRQPIDKVTREMADKALVHQFQPHKGYGYFDYGK DINWQMWPVKDNEVRWQLHRVKWWQAMALVYHATGDEKYAREWVYQYSDWARKNPLGLSQ DNDKFVWRPLEVSDRVQSLPPTFSLFVNSPAFTPAFLMEFLNSYHQQADYLSTHYAEQGN HRLFEAQRNLFAGVSFPEFKDSPRWRQTGISVLNTEIKKQVYADGMQFELSPIYHVAAID IFLKAYGSAKRVNLEKEFPQSYVQTVENMIMALISISLPDYNTPMFGDSWITDKNFRMAQ FASWARVFPANQAIKYFATDGKQGKAPNFLSKALSNAGFYTFRSGWDKNATVMVLKASPP GEFHAQPDNGTFELFIKGRNFTPDAGVFVYSGDEAIMKLRNWYRQTRIHSTLTLDNQNMV ITKARQNKWETGNNLDVLTYTNPSYPNLDHQRSVLFINKKYFLVIDRAIGEATGNLGVHW QLKEDSNPVFDKTKNRVYTTYRDGNNLMIQSLNADRTSLNEEEGKVSYVYNKELKRPAFV FEKPKKNAGTQNFVSIVYPYDGQKAPEISIRENKGNDFEKGKLNLTLTINGKQQLVLVP SEQ IDNo.2:

肝素酶III(Heparinase III)DNA：

CAAAGCAGCAGCATAACAAGAAAAGACTTCGACCACATAAACCTAGAATACAGCGGACTAGAA AAAGTAAACAAAGCAGTAGCAGCAGGAAACTACGACGACGCAGCAAAAGCACTACTAGCATAC TACAGAGAAAAAAGCAAAGCAAGAGAACCAGACTTCAGCAACGCAGAAAAACCAGCAGACATA AGACAACCAATAGACAAAGTAACAAGAGAAATGGCAGACAAAGCACTAGTACACCAATTCCAA CCACACAAAGGATACGGATACTTCGACTACGGAAAAGACATAAACTGGCAAATGTGGCCAGTA AAAGACAACGAAGTAAGATGGCAACTACACAGAGTAAAATGGTGGCAAGCAATGGCACTAGTA TACCACGCAACAGGAGACGAAAAATACGCAAGAGAATGGGTATACCAATACAGCGACTGGGCAAGAAAAAACCCACTAGGACTAAGCCAAGACAACGACAAATTCGTATGGAGACCACTAGAAGTA AGCGACAGAGTACAAAGCCTACCACCAACATTCAGCCTATTCGTAAACAGCCCAGCATTCACA CCAGCATTCCTAATGGAATTCCTAAACAGCTACCACCAACAAGCAGACTACCTAAGCACACAC TACGCAGAACAAGGAAACCACAGACTATTCGAAGCACAAAGAAACCTATTCGCAGGAGTAAGC TTCCCAGAATTCAAAGACAGCCCAAGATGGAGACAAACAGGAATAAGCGTACTAAACACAGAA ATAAAAAAACAAGTATACGCAGACGGAATGCAATTCGAACTAAGCCCAATATACCACGTAGCA GCAATAGACATATTCCTAAAAGCATACGGAAGCGCAAAAAGAGTAAACCTAGAAAAAGAATTC CCACAAAGCTACGTACAAACAGTAGAAAACATGATAATGGCACTAATAAGCATAAGCCTACCA GACTACAACACACCAATGTTCGGAGACAGCTGGATAACAGACAAAAACTTCAGAATGGCACAA TTCGCAAGCTGGCAAGAGTATTCCCAGCAAACCAAGCAATAAAATACTTCGCAACAGACGGAA AACAAGGAAAAGCACCAAACTTCCTAAGCAAAGCACTAAGCAACGCAGGATTCTACACATTCA GAAGCGGATGGGACAAAAACGCAACAGTAATGGTACTAAAAGCAAGCCCACCAGGAGAATTCC ACGCACAACCAGACAACGGAACATTCGAACTATTCATAAAAGGAAGAAACTTCACACCAGACG CAGGAGTATTCGTATACAGCGGAGACGAAGCAATAATGAAACTAAGAAACTGGTACAGACAAA CAAGAATACACAGCACACTAACACTAGACAACCAAAACATGGTAATAACAAAAGCAAGACAAA ACAAATGGGAAACAGGAAACAACCTAGACGTACTAACATACACAAACCCAAGCTACCCAAACC TAGACCACCAAAGAAGCGTACTATTCATAAACAAAAAATACTTCCTAGTAATAGACAGAGCAA TAGGAGAAGCAACAGGAAACCTAGGAGTACACTGGCAACTAAAAGAAGACAGCAACCCAGTAT TCGACAAAACAAAAAACAGAGTATACACAACATACAGAGACGGAAACAACCTAATGATACAAAGCCTAAACGCAGACAGAACAAGCCTAAACGAAGAAGAAGGAAAAGTAAGCTACGTATACAACA AAGAACTAAAAAGACCAGCATTCGTATTCGAAAAACCAAAAAAAAACGCAGGAACACAAAACT TCGTAAGCATAGTATACCCATACGACGGACAAAAAGCACCAGAAATAAGCATAAGAGAAAACA AAGGAAACGACTTCGAAAAAGGAAAACTAAACCTAACACTAACAATAAACGGAAAACAACAAC TAGTACTAGTACCATAG

SEQ ID No.3:

SUMO-肝素酶III融合蛋白的氨基酸序列(SUMO-Heparinase III)：

MGHHHHHHMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAF AKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGQGSQSSSITRKDFDHINL EYSGLEKVNKAVAAGNYDDAAKALLAYYREKSKAREPDFSNAEKPADIRQPIDKVTREMADKAL VHQFQPHKGYGYFDYGKDINWQMWPVKDNEVRWQLHRVKWWQAMALVYHATGDEKYAREWVYQY SDWARKNPLGLSQDNDKFVWRPLEVSDRVQSLPPTFSLFVNSPAFTPAFLMEFLNSYHQQADYL STHYAEQGNHRLFEAQRNLFAGVSFPEFKDSPRWRQTGISVLNTEIKKQVYADGMQFELSPIYH VAAIDIFLKAYGSAKRVNLEKEFPQSYVQTVENMIMALISISLPDYNTPMFGDSWITDKNFRMA QFASWARVFPANQAIKYFATDGKQGKAPNFLSKALSNAGFYTFRSGWDKNATVMVLKASPPGEF HAQPDNGTFELFIKGRNFTPDAGVFVYSGDEAIMKLRNWYRQTRIHSTLTLDNQNMVITKARQN KWETGNNLDVLTYTNPSYPNLDHQRSVLFINKKYFLVIDRAIGEATGNLGVHWQLKEDSNPVFD KTKNRVYTTYRDGNNLMIQSLNADRTSLNEEEGKVSYVYNKELKRPAFVFEKPKKNAGTQNFVS IVYPYDGQKAPEISIRENKGNDFEKGKLNLTLTINGKQQLVLVP 。

序列表

<110> 上海宝维医药技术有限公司

<120> 一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III的方法及其所制备的SUMO_肝素酶III融合蛋白

<130> 2020

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 659

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Thr Thr Lys Ile Phe Lys Arg Ile Ile Val Phe Ala Val Ile Ala

1 5 10 15

Leu Ser Ser Gly Asn Ile Leu Ala Gln Ser Ser Ser Ile Thr Arg Lys

20 25 30

Asp Phe Asp His Ile Asn Leu Glu Tyr Ser Gly Leu Glu Lys Val Asn

35 40 45

Lys Ala Val Ala Ala Gly Asn Tyr Asp Asp Ala Ala Lys Ala Leu Leu

50 55 60

Ala Tyr Tyr Arg Glu Lys Ser Lys Ala Arg Glu Pro Asp Phe Ser Asn

65 70 75 80

Ala Glu Lys Pro Ala Asp Ile Arg Gln Pro Ile Asp Lys Val Thr Arg

85 90 95

Glu Met Ala Asp Lys Ala Leu Val His Gln Phe Gln Pro His Lys Gly

100 105 110

Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Gly Lys Asp Ile Asn Trp Gln Met Trp Pro

115 120 125

Val Lys Asp Asn Glu Val Arg Trp Gln Leu His Arg Val Lys Trp Trp

130 135 140

Gln Ala Met Ala Leu Val Tyr His Ala Thr Gly Asp Glu Lys Tyr Ala

145 150 155 160

Arg Glu Trp Val Tyr Gln Tyr Ser Asp Trp Ala Arg Lys Asn Pro Leu

165 170 175

Gly Leu Ser Gln Asp Asn Asp Lys Phe Val Trp Arg Pro Leu Glu Val

180 185 190

Ser Asp Arg Val Gln Ser Leu Pro Pro Thr Phe Ser Leu Phe Val Asn

195 200 205

Ser Pro Ala Phe Thr Pro Ala Phe Leu Met Glu Phe Leu Asn Ser Tyr

210 215 220

His Gln Gln Ala Asp Tyr Leu Ser Thr His Tyr Ala Glu Gln Gly Asn

225 230 235 240

His Arg Leu Phe Glu Ala Gln Arg Asn Leu Phe Ala Gly Val Ser Phe

245 250 255

Pro Glu Phe Lys Asp Ser Pro Arg Trp Arg Gln Thr Gly Ile Ser Val

260 265 270

Leu Asn Thr Glu Ile Lys Lys Gln Val Tyr Ala Asp Gly Met Gln Phe

275 280 285

Glu Leu Ser Pro Ile Tyr His Val Ala Ala Ile Asp Ile Phe Leu Lys

290 295 300

Ala Tyr Gly Ser Ala Lys Arg Val Asn Leu Glu Lys Glu Phe Pro Gln

305 310 315 320

Ser Tyr Val Gln Thr Val Glu Asn Met Ile Met Ala Leu Ile Ser Ile

325 330 335

Ser Leu Pro Asp Tyr Asn Thr Pro Met Phe Gly Asp Ser Trp Ile Thr

340 345 350

Asp Lys Asn Phe Arg Met Ala Gln Phe Ala Ser Trp Ala Arg Val Phe

355 360 365

Pro Ala Asn Gln Ala Ile Lys Tyr Phe Ala Thr Asp Gly Lys Gln Gly

370 375 380

Lys Ala Pro Asn Phe Leu Ser Lys Ala Leu Ser Asn Ala Gly Phe Tyr

385 390 395 400

Thr Phe Arg Ser Gly Trp Asp Lys Asn Ala Thr Val Met Val Leu Lys

405 410 415

Ala Ser Pro Pro Gly Glu Phe His Ala Gln Pro Asp Asn Gly Thr Phe

420 425 430

Glu Leu Phe Ile Lys Gly Arg Asn Phe Thr Pro Asp Ala Gly Val Phe

435 440 445

Val Tyr Ser Gly Asp Glu Ala Ile Met Lys Leu Arg Asn Trp Tyr Arg

450 455 460

Gln Thr Arg Ile His Ser Thr Leu Thr Leu Asp Asn Gln Asn Met Val

465 470 475 480

Ile Thr Lys Ala Arg Gln Asn Lys Trp Glu Thr Gly Asn Asn Leu Asp

485 490 495

Val Leu Thr Tyr Thr Asn Pro Ser Tyr Pro Asn Leu Asp His Gln Arg

500 505 510

Ser Val Leu Phe Ile Asn Lys Lys Tyr Phe Leu Val Ile Asp Arg Ala

515 520 525

Ile Gly Glu Ala Thr Gly Asn Leu Gly Val His Trp Gln Leu Lys Glu

530 535 540

Asp Ser Asn Pro Val Phe Asp Lys Thr Lys Asn Arg Val Tyr Thr Thr

545 550 555 560

Tyr Arg Asp Gly Asn Asn Leu Met Ile Gln Ser Leu Asn Ala Asp Arg

565 570 575

Thr Ser Leu Asn Glu Glu Glu Gly Lys Val Ser Tyr Val Tyr Asn Lys

580 585 590

Glu Leu Lys Arg Pro Ala Phe Val Phe Glu Lys Pro Lys Lys Asn Ala

595 600 605

Gly Thr Gln Asn Phe Val Ser Ile Val Tyr Pro Tyr Asp Gly Gln Lys

610 615 620

Ala Pro Glu Ile Ser Ile Arg Glu Asn Lys Gly Asn Asp Phe Glu Lys

625 630 635 640

Gly Lys Leu Asn Leu Thr Leu Thr Ile Asn Gly Lys Gln Gln Leu Val

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Leu Val Pro

<210> 2

<211> 1907

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

caaagcagca gcataacaag aaaagacttc gaccacataa acctagaata cagcggacta 60

gaaaaagtaa acaaagcagt agcagcagga aactacgacg acgcagcaaa agcactacta 120

gcatactaca gagaaaaaag caaagcaaga gaaccagact tcagcaacgc agaaaaacca 180

gcagacataa gacaaccaat agacaaagta acaagagaaa tggcagacaa agcactagta 240

caccaattcc aaccacacaa aggatacgga tacttcgact acggaaaaga cataaactgg 300

caaatgtggc cagtaaaaga caacgaagta agatggcaac tacacagagt aaaatggtgg 360

caagcaatgg cactagtata ccacgcaaca ggagacgaaa aatacgcaag agaatgggta 420

taccaataca gcgactgggc aagaaaaaac ccactaggac taagccaaga caacgacaaa 480

ttcgtatgga gaccactaga agtaagcgac agagtacaaa gcctaccacc aacattcagc 540

ctattcgtaa acagcccagc attcacacca gcattcctaa tggaattcct aaacagctac 600

caccaacaag cagactacct aagcacacac tacgcagaac aaggaaacca cagactattc 660

gaagcacaaa gaaacctatt cgcaggagta agcttcccag aattcaaaga cagcccaaga 720

tggagacaaa caggaataag cgtactaaac acagaaataa aaaaacaagt atacgcagac 780

ggaatgcaat tcgaactaag cccaatatac cacgtagcag caatagacat attcctaaaa 840

gcatacggaa gcgcaaaaag agtaaaccta gaaaaagaat tcccacaaag ctacgtacaa 900

acagtagaaa acatgataat ggcactaata agcataagcc taccagacta caacacacca 960

atgttcggag acagctggat aacagacaaa aacttcagaa tggcacaatt cgcaagctgg 1020

caagagtatt cccagcaaac caagcaataa aatacttcgc aacagacgga aaacaaggaa 1080

aagcaccaaa cttcctaagc aaagcactaa gcaacgcagg attctacaca ttcagaagcg 1140

gatgggacaa aaacgcaaca gtaatggtac taaaagcaag cccaccagga gaattccacg 1200

cacaaccaga caacggaaca ttcgaactat tcataaaagg aagaaacttc acaccagacg 1260

caggagtatt cgtatacagc ggagacgaag caataatgaa actaagaaac tggtacagac 1320

aaacaagaat acacagcaca ctaacactag acaaccaaaa catggtaata acaaaagcaa 1380

gacaaaacaa atgggaaaca ggaaacaacc tagacgtact aacatacaca aacccaagct 1440

acccaaacct agaccaccaa agaagcgtac tattcataaa caaaaaatac ttcctagtaa 1500

tagacagagc aataggagaa gcaacaggaa acctaggagt acactggcaa ctaaaagaag 1560

acagcaaccc agtattcgac aaaacaaaaa acagagtata cacaacatac agagacggaa 1620

acaacctaat gatacaaagc ctaaacgcag acagaacaag cctaaacgaa gaagaaggaa 1680

aagtaagcta cgtatacaac aaagaactaa aaagaccagc attcgtattc gaaaaaccaa 1740

aaaaaaacgc aggaacacaa aacttcgtaa gcatagtata cccatacgac ggacaaaaag 1800

caccagaaat aagcataaga gaaaacaaag gaaacgactt cgaaaaagga aaactaaacc 1860

taacactaac aataaacgga aaacaacaac tagtactagt accatag 1907

<210> 3

<211> 744

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Gly His His His His His His Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln

1 5 10 15

Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile

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Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys

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Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln

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Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile

65 70 75 80

Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile

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Ser Ile Thr Arg Lys Asp Phe Asp His Ile Asn Leu Glu Tyr Ser Gly

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Leu Glu Lys Val Asn Lys Ala Val Ala Ala Gly Asn Tyr Asp Asp Ala

130 135 140

Ala Lys Ala Leu Leu Ala Tyr Tyr Arg Glu Lys Ser Lys Ala Arg Glu

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Pro Asp Phe Ser Asn Ala Glu Lys Pro Ala Asp Ile Arg Gln Pro Ile

165 170 175

Asp Lys Val Thr Arg Glu Met Ala Asp Lys Ala Leu Val His Gln Phe

180 185 190

Gln Pro His Lys Gly Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Gly Lys Asp Ile Asn

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210 215 220

Arg Val Lys Trp Trp Gln Ala Met Ala Leu Val Tyr His Ala Thr Gly

225 230 235 240

Asp Glu Lys Tyr Ala Arg Glu Trp Val Tyr Gln Tyr Ser Asp Trp Ala

245 250 255

Arg Lys Asn Pro Leu Gly Leu Ser Gln Asp Asn Asp Lys Phe Val Trp

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275 280 285

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Ala Glu Gln Gly Asn His Arg Leu Phe Glu Ala Gln Arg Asn Leu Phe

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Ala Gly Val Ser Phe Pro Glu Phe Lys Asp Ser Pro Arg Trp Arg Gln

340 345 350

Thr Gly Ile Ser Val Leu Asn Thr Glu Ile Lys Lys Gln Val Tyr Ala

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Asp Gly Met Gln Phe Glu Leu Ser Pro Ile Tyr His Val Ala Ala Ile

370 375 380

Asp Ile Phe Leu Lys Ala Tyr Gly Ser Ala Lys Arg Val Asn Leu Glu

385 390 395 400

Lys Glu Phe Pro Gln Ser Tyr Val Gln Thr Val Glu Asn Met Ile Met

405 410 415

Ala Leu Ile Ser Ile Ser Leu Pro Asp Tyr Asn Thr Pro Met Phe Gly

420 425 430

Asp Ser Trp Ile Thr Asp Lys Asn Phe Arg Met Ala Gln Phe Ala Ser

435 440 445

Trp Ala Arg Val Phe Pro Ala Asn Gln Ala Ile Lys Tyr Phe Ala Thr

450 455 460

Asp Gly Lys Gln Gly Lys Ala Pro Asn Phe Leu Ser Lys Ala Leu Ser

465 470 475 480

Asn Ala Gly Phe Tyr Thr Phe Arg Ser Gly Trp Asp Lys Asn Ala Thr

485 490 495

Val Met Val Leu Lys Ala Ser Pro Pro Gly Glu Phe His Ala Gln Pro

500 505 510

Asp Asn Gly Thr Phe Glu Leu Phe Ile Lys Gly Arg Asn Phe Thr Pro

515 520 525

Asp Ala Gly Val Phe Val Tyr Ser Gly Asp Glu Ala Ile Met Lys Leu

530 535 540

Arg Asn Trp Tyr Arg Gln Thr Arg Ile His Ser Thr Leu Thr Leu Asp

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Asn Gln Asn Met Val Ile Thr Lys Ala Arg Gln Asn Lys Trp Glu Thr

565 570 575

Gly Asn Asn Leu Asp Val Leu Thr Tyr Thr Asn Pro Ser Tyr Pro Asn

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Leu Asp His Gln Arg Ser Val Leu Phe Ile Asn Lys Lys Tyr Phe Leu

595 600 605

Val Ile Asp Arg Ala Ile Gly Glu Ala Thr Gly Asn Leu Gly Val His

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Arg Val Tyr Thr Thr Tyr Arg Asp Gly Asn Asn Leu Met Ile Gln Ser

645 650 655

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740