灵长类动物DNA甲基化相对定量试剂盒

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种灵长类动物DNA甲基化相对定量试剂盒。该试剂盒包括：a）幼斑马鱼DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA，以及b）DNA定量检测试剂，其至少包含用于定量检测a）的试剂；所述幼斑马鱼为自受精卵形成至发育120小时以内的斑马鱼。该试剂盒能够实施实现灵长类动物DNA甲基化的准确定量，避免了内源内参容易受到自身因素或收样原因导致的不稳定或基因组DNA污染的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种灵长类动物DNA甲基化相对定量试剂盒。

背景技术

现在对于特定基因或特定DNA序列甲基化水平的研究，大多基于亚硫酸氢盐转化方法。亚硫酸氢盐转化后可通过测序法、PCR法、数字PCR法、限制酶消化法、芯片等方法检测甲基化水平。在实际临床应用和检测试剂盒开发中，采用最多的方法是PCR方法。

PCR方法用于甲基化定量研究，起始DNA量较多的情况（如：组织来源DNA或脱落细胞DNA等）通常使用绝对定量方法；微量DNA（如血浆游离ctDNA等），有研究使用预扩增方法，预扩增PCR的循环数通常为30个循环以上：预扩增产物稀释后，使用绝对定量方法定量。但微量DNA甲基化定量检测，使用最多的是相对定量方法，利用靶标与ACTB的CP值，根据公式：2

对于微量DNA（如血浆游离ctDNA等）甲基化定量检测，如果使用预扩方法，在实际应用中，过程繁琐，需两步PCR，且第一次PCR产物需开盖稀释，由于循环数通常在30个循环以上，开盖容易造成污染；如果使用相对定量方法，现在研究方法，使用ACTB作为内参，ACTB的水平容易受到外源或内源的影响，会影响到靶标的实际定量。

以血浆样本为例说明，外源影响例如：1）使用普通EDTA管采血，血浆样本未按照规定进行血浆分离，2）使用cfDNA保存管，未按照温度范围进行全血邮寄（气温过高或过低时需要加冰袋和暖宝宝运输）、未按规定进行血浆分离。内源影响：受试者有炎症、自身免疫疾病等疾病，体内白细胞数量，白细胞破裂升高现象，导致体内游离DNA水平升高。外源和内源影响产生的后果：细胞破裂，游离DNA的含量升高，检测CP值降低，当计算靶标基因甲基化相对于ACTB的含量时，其相对含量会降低。这种降低并非是肿瘤来源的异常甲基化DNA降低，而是由于背景增加导致的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明采用投入外源内参，进行靶基因甲基化水平的相对定量检测。

本发明第一方面涉及一种灵长类动物DNA甲基化相对定量试剂盒，包括：

a）幼斑马DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA，以及

b）DNA定量检测试剂，其至少包含用于定量检测a）的试剂；

所述幼斑马鱼为自受精卵形成至发育120小时以内的斑马鱼。

本发明第二方面涉及一种用于甲基化测定的灵长类动物DNA预处理方法，包括：

a）将幼斑马鱼DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA与待检测的灵长类动物靶核酸混合；所述幼斑马鱼为自受精卵形成至发育120小时以内的斑马鱼；

b）将幼斑马鱼DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA、灵长类动物靶核酸进行亚硫酸盐定序；

c）任选的纯化DNA；

其中，a）、b）无先后顺序。

本发明的有益效果为：

通过在灵长类动物DNA甲基化定量检测过程中，投入幼斑马鱼DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA以实现准确定量，避免了内源内参容易受到自身因素或收样原因导致的不稳定或基因组DNA污染的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中使用外源DNA作为内参测定甲基化相对定量水平，septin9的甲基化水平在各监控时间点的变化情况；

图2为本发明一个实施例中使用内源内参测定甲基化相对定量水平，septin9的甲基化水平在各监控时间点的变化情况；

图3为本发明一个实施例中外源内参计算甲基化相对定量水平；

图4为本发明一个实施例中内源内参计算甲基化相对定量水平。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及灵长类动物DNA甲基化相对定量试剂盒，包括：

a）幼斑马鱼DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA，以及

b）DNA定量检测试剂，其至少包含用于定量检测a）的试剂；

所述幼斑马鱼为自受精卵形成至发育120小时以内的斑马鱼。

不含CpG位点的斑马鱼DNA可以来自斑马鱼胚胎、幼斑马鱼会成年斑马鱼。

术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品（例如，包装或容器），试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。

试剂盒中的各组分优选以冻干形式，例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后（在所述制造后物质通常作为粉末存在）被压制成球形的冻干物。因此，可以例如以冻干形式提供PCR批次所需的组分，特别是DNA聚合酶、核酸组分以及反应缓冲剂组分。以这种方式，可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始PCR过程。特别地，冻干形式的提供非常有利于自动化应用。

如本文所用，DNA定量检测试剂可以为能够定量检测目标核酸的核苷酸组成的任何方法，且所述方法能够区分甲基化定序前后的核酸片段。核酸检测测定包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法、结构特异性裂解测定(例如，INVADER测定，(Hologic,Inc.)并且描述于例如美国专利号5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543和6,872,816；Lyamichev等人,Nat.Biotech.,17:292(1999),Hall等人,PNAS,USA,97:8272(2000),以及US 2009/0253142，其各自出于所有目的全文以引用的方式并入本文)；酶错配裂解方法(例如，Variagenics，美国专利号6,110,684、5,958,692、5,851,770，其全文以引用的方式并入本文)；以上所述的聚合酶链反应(PCR)；分支杂交方法(例如，Chiron，美国专利号5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，其全文以引用的方式并入本文)；滚环式复制(例如，美国专利号6,210,884、6,183,960和6,235,502，其全文以引用的方式并入本文)；NASBA(例如，美国专利号5,409,818，其全文以引用的方式并入本文)；分子信标技术(例如，美国专利号6,150,097，其全文以引用的方式并入本文)；E-传感器技术(Motorola，美国专利号6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573，其全文以引用的方式并入本文)；环状探针技术(例如美国专利号5,403,711、5,011,769和5,660,988，其全文以引用的方式并入本文)；Dade Behring信号扩增方法(例如美国专利号6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614，其全文以引用的方式并入本文)；连接酶链反应(例如，BaranayProc.Natl.Acad.Sci USA 88,189-93(1991))；以及夹心杂交方法(例如，美国专利号5,288,609，其全文以引用的方式并入本文)。

不含CpG位点的斑马鱼DNA可以包括成年斑马鱼DNA和幼斑马鱼DNA、胚胎期斑马鱼DNA。

幼斑马鱼是指从受精卵形成到发育约120小时以内的斑马鱼，例如12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时或108小时的胚胎和幼体。

在一些实施方式中，所述幼斑马鱼DNA选自核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：30所示DNA片段中的至少一种，所述不含CpG位点的斑马鱼DNA选自核苷酸序列如SEQ IDNO：1～SEQ ID NO：15所示DNA片段中的至少一种。

在一些实施方式中，所述幼斑马鱼DNA选自核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：18所示DNA片段中的至少一种，所述不含CpG位点的斑马鱼DNA选自核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示DNA片段中的至少一种。

在一些实施方式中，所述DNA定量检测试剂还包含用于定量检测灵长类动物靶核酸的试剂。

在一些实施方式中，所述靶核酸为已知的疾病相关的甲基化基因。

在一些实施方式中，所述靶核酸为肿瘤相关的甲基化基因。

在一些实施方式中，所述靶核酸选自：

septin9、SDC2、SHOX2、NDRG4、RPRM、RASSF1、MGMT、PITX2、SOX17、vimentin、BMP3、GSTP1、RNF180、RUNX3、MIN25、Twist1、SCNN1B、Vimentin、ZNF545、RASSF2、TAPK、TFPI2、APC、TCF21、p16、hMLH1、BRCA1、DAPK、MDR1、Rb、THBS1、BCL-2、IGF-2、K-ras、MAGE-1、VHL、APAF1、CASP8、FAS、ABCG2、OCT4和WTH3中的至少一种。

在一些实施方式中，所述DNA定量检测试剂还包含用于定量检测灵长类动物看家基因的试剂。

在一些实施方式中，所述看家基因为Actin、Tubulin或GAPDH。

在一些实施方式中，所述DNA定量检测试剂为引物和任选的探针，所述探针标记有信号物质。

术语“引物”是指短核酸（寡核苷酸），其充当在合适条件下通过核酸聚合酶合成多核苷酸链的起始点。多核苷酸合成和扩增反应一般包括合适的缓冲剂、dNTPs和/或rNTPs以及一种或多种任选的辅因子，并且于合适的温度进行。引物一般包括至少一个与靶序列至少基本上互补的靶杂交区。这个区域的长度一般为约15至约40个核苷酸。“引物对”是指与靶序列的相反链互补并被设计用于扩增靶序列的正向引物和反向引物（有时称为5'和3'引物）。正向和反向引物在靶序列上彼此可扩增的距离内排列，例如，约10-5000个核苷酸或约25-500个核苷酸。

如本文所用的，“探针”意指能够选择性地结合具体预期的靶生物分子（例如，将被探针结合、捕获或杂交的感兴趣的核酸序列）的任何分子。在本发明中，用于结合靶核酸的探针能够用于区分甲基化定序前后的序列变化；可以理解，此时探针与甲基化及其附近位点结合。

在一些实施方式中，所述信号物质是荧光团、比色标记、胶体金、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子（如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发基团），也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物（比如拟肽），非天然核酸及其类似物（拟核苷酸）和纳米结构（包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等）。

在一些实施方式中，所述探针为自身淬灭探针。

在一些实施方式中，各探针的荧光发射基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。

在一些实施方式中，各探针的淬灭基团独立地选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。

在一些实施方式中，所述的试剂盒还包含亚硫酸盐定序试剂。

在一些实施方式中，所述亚硫酸盐定序试剂包含亚硫酸盐。

亚硫酸盐定序法目前应用最普遍的甲基化检测方法，其原理是亚硫酸氢盐的处理将非甲基化的C转化U，经过PCR过程后转变为T，而甲基化的C经过亚硫酸氢盐处理后不会发生变化。

在一些实施方式中，所述的试剂盒还含有如下成分的中的至少一种：

DNA聚合酶、扩增缓冲液、dNTP、Mg

在一些实施方式中，所述DNA聚合酶具有5'外切酶活性，例如选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶以及Klenow片段中的任一种。

在一些实施方式中，所述水通常为无核酸和/或无核酸酶的水。水可以为蒸馏水、去离子水或反渗水。

在一些实施方式中，所述灵长类动物为人。

在一些实施方式中，所述幼斑马鱼DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA为分离自斑马鱼的天然DNA。

斑马鱼天然DNA作为内参性能稳定，使用天然DNA成本更低，能产生更大的成本效益比。

在一些实施方式中，所述幼斑马鱼DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA为基因组DNA。

根据本发明的再一方面，还涉及用于甲基化测定的灵长类动物DNA预处理方法，包括：

a）将幼斑马鱼DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA与待检测的灵长类动物靶核酸混合；所述幼斑马鱼为自受精卵形成至发育120小时以内的斑马鱼；

b）将幼斑马鱼DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA、灵长类动物靶核酸进行亚硫酸盐定序；

c）任选的纯化DNA；

其中，a）、b）无先后顺序，所述幼斑马鱼DNA、所述不含CpG位点的斑马鱼DNA、所述灵长类动物靶核酸为如上所述试剂盒中所定义。

在一些实施方式中，所述灵长类动物靶核酸来自如下样本：组织或组织裂解液、血液、血清、血浆、尿液、粪便、唾液、痰液、胸腹水、灌洗液、脑脊液、鼻咽拭子、宫颈刮片、精液、细胞培养液。

在一些实施方式中，所述血液、血清、血浆来自外周血或骨髓血。

本文使用的“组织裂解物”也可与“裂解物”、“裂解的样品”、“组织或细胞提取物”等用语通用，表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语“裂解”包括。

本发明还涉及一种甲基化测定的灵长类动物DNA的方法，包括：

使用如上所述的预处理方法进行预处理；

测定处理前后的靶核酸含量以及斑马鱼DNA含量，使用所述斑马鱼DNA作为内参对所述靶核酸进行相对定量；

其中，所述斑马鱼DNA为幼斑马鱼DNA或不含CpG位点的斑马鱼DNA；

所述幼斑马鱼为自受精卵形成至发育120小时以内的斑马鱼。

在一些实施方式中，相对定量采用的2

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

在以下实施例中，该测在荧光定量PCR检测平台上运行，检测血浆游离DNA中靶基因的甲基化水平。荧光定量PCR检测采用Lightcycle480平台检测。若无特别说明，则各实施例所采用的相对定量方法均为2

实施例1

在以下实施例中，该测在荧光定量PCR检测平台上运行，检测血浆游离DNA中靶基因的甲基化水平。荧光定量PCR检测采用Lightcycle480平台检测。

1. 外源DNA

病毒（双链DNA病毒）：Lambda噬菌体DNA，DNA购自NEB（货号：N3011L）。

质粒合成：合成不含CG位点的DNA片段（质粒合成，载体为PUC57，宿主菌株为DH5a），质粒酶切成线性使用。

斑马鱼胚胎、幼体、幼鱼及成鱼，购自苏州木芮生物科技有限公司，DNA提取先用组织匀浆机将胚胎（幼体、幼鱼或剪成碎片的尾鳍）匀浆，再用DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN，货号：69582）试剂盒提取DNA。

小鼠购自苏州恒新晨生物医药有限公司，剪取小鼠尾尖约0.5cm，切碎后放到EP管中，用组织匀浆机匀浆，再用DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN，货号：69582）试剂盒提取DNA。

2. 血浆处理：

使用EDTA采集全血，室温1小时内离心分离得到血浆。离心条件：1500g，10分钟，吸取上清，再次离心：15000g，离心10分钟，吸取上清，即为分离得到的血浆。

3. DNA提取使用试剂盒：QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（55114），每次样本的起始量为2mL。阳性质控（靶标甲基化阳性的细胞DNA+外源基因DNA）和样本同流程处理，作为全程质控，并且其CP进行相对定量值的计算。

4. DNA的亚硫酸氢盐转化和纯化使用试剂盒：ZYMO（EZ DNA Methylation GoldKit）。

5. PCR反应体系：双重和三重PCR体系见表1。

表1 PCR反应体系

6. PCR反应程序见表2。

表2 PCR反应条件

7. 相对定量值的计算

用1000*2

实施例2 检测靶标在不同外源DNA中的扩增情况

取20ng外源DNA，经亚硫酸氢盐转化后，考察几个癌症研究中常见的几个靶标（septin9、SDC2、SHOX2和NDRG4）在外源bisDNA(Bisulfite conversion DNA)中的扩增情况，需满足检测靶标在外源DNA中不扩增的要求。DNA转化操作见实施例1，PCR检测使用两重PCR体系。

1. Septin9检测区域及引物和探针

检测区域-DNA原始序列

TGGCTGCTGCGGCCGCGGACGTGCTGGAGAGGACCCTGCGGGTGGGCCTGGCGCGGGACGGGGGTGCGCTGAGGGGAGACGGGAGTGCGCTGAGGGGAGACGGGACCCCTAATCCAGGCGCCCTCCCGCTGAGAGCGCCGCGCGCCCCCGGCCCCGTGCCCGCGCCGCCTACGTGGGGGACCCTGTTAGGGGCACCCGCG

检测区域-亚硫酸氢盐转化后的序列

TGGTTGTTGCGGTCGCGGACGTGTTGGAGAGGATTTTGCGGGTGGGTTTGGCGCGGGACGGGGGTGCGTTGAGGGGAGACGGGAGTGCGTTGAGGGGAGACGGGATTTTTAATTTAGGCGTTTTTTCGTTGAGAGCGTCGCGCGTTTTTGGTTTCGTGTTCGCGTCGTTTACGTGGGGGATTTTGTTAGGGGTATTCGCG

根据转化后的序列，设计检测的引物和探针

检测组合1

F：GTTGTTGCGGTCGCGGACGTG

R：CGTCTCCCCTCAACGCACTCCCG

PROBE：GCGGGTGGGTTTGGCGCGGG

检测组合2

F：TTGGCGCGGGACGGGGGTGCG

R：CGCCTAAATTAAAAATCCCGTCTCC

PROBE：GACGGGAGTGCGTTG

检测组合3

F：CGTTGAGAGCGTCGCGCG

R：CAAAATCCCCCACGTAAACG

PROBE：TGGTTTCGTGTTCGCG

2. SDC2检测区域及引物和探针

检测区域-DNA原始序列

AGATACCCCCGGAGCTCCAGCCGCGCGGATCGCGCGCTCCCGCCGCTCTGCCCCTAAACTTCTGCCGTAGCTCCCTTTCAAGCCAGCGAATTTATTCCTTAAAACCAGAAACTGAACCTCGGCACGGGAAAGGAGTCCGCGGAGGAGCAAAACCACAGCAGAGCAAGAAGAGCTTCAGAGAGCAGCCTTCCCGGAGCACCAACTCCGTGTCGGGAGTGCAGAAACCAACAAGTGAGAGGGCGCCGCGTTCCCGGGGCGCAGCTGCGGGCGGCGGGAGCAGGCGCAGGAGGAGGAAGCGAGCGCCCCCGAGCCCCGAGCCCGAGTCCCCGAGCCTGAGCCGCAATCGCTGCGGTACTCTGCTCCGGATTCGTGTGCGCGGGCTGCGCCGAGCGCTGGGCAGGAGGCTTCGTTTTGCCCTGGTTGCAAGCAGCGGCTGGGAGCAGCCGGTCCCTGGGGAATATGCGGCGCGCGTGGATCCTGCTCACCTTGGGCTTGGTGGCCTGCGTGTCGGCGGAGTCG

检测区域-亚硫酸氢盐转化后的序列

AGATATTTTCGGAGTTTTAGTCGCGCGGATCGCGCGTTTTCGTCGTTTTGTTTTTAAATTTTTGTCGTAGTTTTTTTTTAAGTTAGCGAATTTATTTTTTAAAATTAGAAATTGAATTTCGGTACGGGAAAGGAGTTCGCGGAGGAGTAAAATTATAGTAGAGTAAGAAGAGTTTTAGAGAGTAGTTTTTTCGGAGTATTAATTTCGTGTCGGGAGTGTAGAAATTAATAAGTGAGAGGGCGTCGCGTTTTCGGGGCGTAGTTGCGGGCGGCGGGAGTAGGCGTAGGAGGAGGAAGCGAGCGTTTTCGAGTTTCGAGTTCGAGTTTTCGAGTTTGAGTCGTAATCGTTGCGGTATTTTGTTTCGGATTCGTGTGCGCGGGTTGCGTCGAGCGTTGGGTAGGAGGTTTCGTTTTGTTTTGGTTGTAAGTAGCGGTTGGGAGTAGTCGGTTTTTGGGGAATATGCGGCGCGCGTGGATTTTGTTTATTTTGGGTTTGGTGGTTTGCGTGTCGGCGGAGTCG

根据转化后的序列，设计检测的引物和探针

检测组合1

F：TAATAAGTGAGAGGGCGTCGCG

R：CGCTTCCTCCTCCTACGCCTACTCCCG

PROBE：CGGGGCGTAGTTGCGGGC

检测组合2

F：GCGTTTTCGGGGCGTAGTTGCG

R：CTCGAACTCGAAACTCGAAAACG

PROBE：CGGCGGGAGTAGGCG

检测组合3

F：CGGTATTTTGTTTCGGATTCG

R：CCAAAACAAAACGAAACCTCCTACCCAACG

PROBE：GTGCGCGGGTTGCGTCG

3. SHOX2检测区域及引物和探针

检测区域-DNA原始序列

CGAGAGCAACAGACCCCGGTGTTGTGCCGCACAGGGAGCCGCATCCGCAGACGCCCCTCGCTGCCCCTGGGCTCGGGCCAAACCCTGCATAAGGTCCCCTGGACAGCCAGGTAATCTCCGTCCCGCCTGCCCGACCGGGGTCGCACGAGCACAGGCGCCCACGCCATGTTGGCTGCCCAAAGGGCTCGCCGCCCAAGCCGGGCCAGAAGGCAGGAGGCGGAAAACCAGCCTCCGGTGGCGGGCGAAAGCAACCGCTCTTTCTGTTCTCTCTTCGCCCTCCCTCGTGGAAACGCAGACTCGACCCTAAACGCTTAACCCACAGAGATCAACAGGTTCAAGCGGAATATTCGCGATCCTCGGTTTCTATTGGTTGCTCAAAGCCTTTTCATGCAACCAGCAGCTCGGATGTTTAATAAAATATGAATTTTTCTGCTCTGGGT

检测区域-亚硫酸氢盐转化后的序列

CGAGAGTAATAGATTTCGGTGTTGTGTCGTATAGGGAGTCGTATTCGTAGACGTTTTTCGTTGTTTTTGGGTTCGGGTTAAATTTTGTATAAGGTTTTTTGGATAGTTAGGTAATTTTCGTTTCGTTTGTTCGATCGGGGTCGTACGAGTATAGGCGTTTACGTTATGTTGGTTGTTTAAAGGGTTCGTCGTTTAAGTCGGGTTAGAAGGTAGGAGGCGGAAAATTAGTTTTCGGTGGCGGGCGAAAGTAATCGTTTTTTTTGTTTTTTTTTCGTTTTTTTTCGTGGAAACGTAGATTCGATTTTAAACGTTTAATTTATAGAGATTAATAGGTTTAAGCGGAATATTCGCGATTTTCGGTTTTTATTGGTTGTTTAAAGTTTTTTTATGTAATTAGTAGTTCGGATGTTTAATAAAATATGAATTTTTTTGTTTTGGGT

根据转化后的序列，设计检测的引物和探针

检测组合1

F：CGAGAGTAATAGATTTCGGTGTTGTGTC

R：CCCGAACCCAAAAACAACGAAAAACG

PROBE：TAGGGAGTCGTATTCGTAG

检测组合2

F：GTAATTTTCGTTTCGTTTGTTC

R：AAACAACCAACATAACGTAAACGC

PROBE：CGGGGTCGTACGAGTATA

检测组合3

F：AGTCGGGTTAGAAGGTAGGAGGC

R：GAAAAAAAAACAAAAAAAACGATTACTTTCGCC

PROBE：GAAAATTAGTTTTCGGTGGC

4. NDRG4，检测区域及引物和探针

检测区域-DNA原始序列

AGTCCGCGCGGCGGAGCGGGTGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGACCGGGGTGTCCCCCAGGCTCCGCGTCGCGGTCCCCGCTCGCCCTCCCGCCCGCCCACCGGGCACCCCAGCCGCGCAGAAGGCGGAAGCCACGCGCGAGGGACCGCGGTCCGTCCGGGACTAGCCCCAGGCCCGGCACCGCCCCGCGGGCCGAGCGCCCACACCCGCCAAACCCACGCGGGCACGCCCCCGCGGCGCACCG

检测区域-亚硫酸氢盐转化后的序列

AGTTCGCGCGGCGGAGCGGGTGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTTGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGTGTATCG

根据转化后的序列，设计检测的引物和探针

检测组合1

F：AGTTCGCGCGGCGGAGCGG

R：CGCGAAACCTAAAAAACACCCCGATCG

PROBE：GAAGTCGGCGGGGGCGCGG

检测组合2

F：GCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGC

R：AAACGCTCGACCCGCGAAACGATACCG

PROBE：TCGCGGTTCGTTCGGGATTAGT

几个靶标基因具体扩增情况见表3。

表3 几个靶标在不同外源bisDNA中的扩增情况

分析：几个常见的临床研究的靶标在噬菌体中未扩增，可能的原因是物种差异大，核酸序列同源性差，同理，在质粒中也没有扩增，因为质粒序列为：PUC57-细菌为宿主的载体+插入设计的人非同源序列；研究报道，斑马鱼基因组与人的同源性为87%，小鼠基因组与人的同源性＞90%，但是考察的几个常见的靶标，在斑马鱼bisDNA中均无扩增，而在小鼠bisDNA中均有扩增。

总结：由以上实验结果，外源DNA内参的选择排除小鼠基因组。

实施例3 在外源DNA经过亚硫酸氢盐处理后，选择的外源内参片段的PCR检测情况

取20ng、200ng和2μg外源D R扩增情况。DNA转化操作见实施例1，PCR检测使用三重PCR体系。噬菌体和质粒的扩增结果见表4，斑马鱼的扩增结果见表5。

表4 外源DNA（噬菌体DNA和质粒）经亚硫酸氢盐转化后的扩增情况

λ噬菌体检测片段：考虑到病毒甲基化状态和真核生物不同，所以选取检测片段中未包含CG位点

λ噬菌体检测片段1

原始序列

TCTTTCTGATTTAATAATAGATGATTCAGTTAAATATGAAGGTAATTTCTTTTGTGCAAGTCTGACTAACTTTTTTATACCAATGTTTAACATACTTTCATTTGTAATAAACTCAATGTCATTTTCTTCAATGTAAGATGAAATAAGAGTAGCCTTTGCCT

经过亚硫酸氢盐处理后

TTTTTTTGATTTAATAATAGATGATTTAGTTAAATATGAAGGTAATTTTTTTTGTGTAAGTTTGATTAATTTTTTTATATTAATGTTTAATATATTTTTATTTGTAATAAATTTAATGTTATTTTTTTTAATGTAAGATGAAATAAGAGTAGTTTTTGTTT

根据转化后的序列，设计检测的引物和探针

检测组合1

F：GATTTAATAATAGATGATTTAG

R：CTACTCTTATTTCATCTTACA

Probe：GTGTAAGTTTGATTAATT

检测组合2

F：AGTTAAATATGAAGGTAATTT

R：CAAAAACTACTCTTATTTCATCTTAC

Probe：TGTAATAAATTTAATGTTA

λ噬菌体检测片段2

原始序列

ATAAATCTTTAAGTCTTCTTTCCCATGGTTTTTTAGTCATAAAACTCTCCATTTTGATAGGTTGCATGCTAGATGCTGATATATTTTAGAGGTGATAAAATTAACTGCTTAACTGTCAATGTAATACAAGTTGTTTGATCTTTGCAATGATTCTTATCAGAAACCATATAGTAAATTAGTTACACAGGAAATTTTTAATATTATTATTATCATTCATTATGTATTAAAATTAGAGTTGTGGCTTGGCTCTGCTAA

经过亚硫酸氢盐处理后

ATAAATTTTTAAGTTTTTTTTTTTATGGTTTTTTAGTTATAAAATTTTTTATTT

检测组合1

F：

R：CAACTTATATTACATTAACAATTAAAC

Probe：TGATATATTTTAGAGGTGA

检测组合2

F：AATTGTTAATGTAATATAAGTTG

R：TAACAAAACCAAACCACAACTCTA

Probe：TAGTAAATTAGTTATATAGGA

λ噬菌体检测片段3

原始序列

CTTAACTCTTCATATTTAGAAATGAGGCTGATGAGTTCCATATTTGAAAAGTTTTCATCACTACTTAGTTTTTTGATAGCTTCAAGCCAGAGTTGTCTTTTTCTATCTACTCTCATACAACCAATAAATGCTGAAATGAATTCTA

经过亚硫酸氢盐处理后

TTTAATTTTTTATATTTAGAAATGAGGTTGATGAGTTTTATATTTGAAAAGTTTTTATTATTATTTAGTTTTTTGATAGTTTTAAGTTAGAGTTGTTTTTTTTTATTTATTTTTATATAATTAATAAATGTTGAAATGAATTTTA

检测组合1

F：ATATTTAGAAATGAGGTTG

R：CAACTCTAACTTAAAACTATCA

Probe：GAGTTTTATATTTGAAAAGT

检测组合2

F：GAAATGAGGTTGATGAGTTTTA

R：AAATTCATTTCAACATTTATTAATT

Probe：GATAGTTTTAAGTTAGAGTTG

合成质粒序列，合成的质粒，在细菌体内复制扩增，原核生物和真核生物的甲基化模式不同，合成片段中不含有CG位点。

质粒1原始序列

AATTAATTAGAAGGTCTTCTATTGGTTGTTAGGTATTTGTATTGTTATTGTGATTGATGATTATTCTTTTGATTGTTAGATAGTGGTGTTCCTGTTGATGTTTTGTGGAAGTAAGTGTATTGTTAGTGGTAGGATAATGTATTTGATGTGTTATTTGAAAGTATTGATGAATGGTGTGGTGATTTATGATGGGTATTTGGAAGGTAGGTG

经过亚硫酸氢盐处理后

AATTAATTAGAAGGTTTTTT

检测组合1

F：

R：CTAACAATACACTTACTTCCAC

Probe：GATTGTTAGATAGTGGTGTT

检测组合2

F：GGAAGTAAGTGTATTGTTAGTGGTA

R：CACCTACCTTCCAAATACCCATC

Probe：GTATTTGATGTGTTATTTGAAAG

质粒2原始序列

TTTAGAGGATGGAGGATGATGTAATGTTGATGATAGTATTAGAAGGGATTGTAGGAGGAGTCTGGTATGGTTGAATTGGTAGGTGATCTGGTTGTTGATCTGAGTTTGGATGTGGTTAGATTTGATGAGTAGATGGTTAGAGTTAGGTGTTATTCTTCTGGTATGGAAAGTGATGTGAAAAAAATAGTGGTAGTTGTTGAATAGTTGTTGAGTTGATAGGTGTTGGTTGTATAGAAAGTGGGGATTTTTGTTGGGTAGTATAAAGTGGTGTTGTTG

经过亚硫酸氢盐处理后

TT

检测组合1

F：

R：CATACCAAACTCCTCCTACAATC

Probe：

检测组合2

F：

R：CAACAACTATTCAACAACTACCACTAT

Probe：

质粒3原始序列

GAGAGTAGTTATATAATGGTGTGATTGTTATGTCTTCTGAATTGTTAGTCTTGTAGTGTATTGAGTATTCTGTCTTGATGAAATGGTAGGTAGAATAGGTGGAGTTAGATAGTAATTGGAAGTTTATTGTGGAAGATGTTATTAGAATTGGTGTGTCTTTGGTGGTGATGTCTTTGTGGTATAATTATCTGTAGAAGAGAGGTGGTTAGTAGTA

经过亚硫酸氢盐处理后

检测组合1

F：

R：CACCTATTCTACCTACCATTTCATC

Probe：

检测组合2

F：

R：TACTACTAACCACCTCTCTTCTAC

Probe：

分析：噬菌体DNA和质粒经亚硫酸氢盐处理后，出现不扩增或者扩增峰形差且CP大的现象，随着投入DNA量的增加，该现象并未好转。考虑到病毒和原核生物中的CG甲基化情况和真核不同，设计检测区域均不含CG位点，但经亚硫酸氢盐处理后，检测区域仍不能扩增，这些均为线性双链DNA，是能被试剂盒有效的回收的，造成该现象的原因推测是：病毒或原核生物中转甲基酶识别位点真核不同，通过亚硫酸氢盐处理后，产生的序列难以预测，且领域内研究较少，可能设计的引物不能有效的扩增。该结果结合实施例2分析，在噬菌体和质粒的bisDNA中，常见的靶标不扩增，也可能有该原因。

结论：由以上实验结果，外源DNA内参的选择排除噬菌体和质粒。

表5 斑马鱼胚胎DNA经亚硫酸氢盐转化后的扩增情况

表6 斑马鱼幼体、幼鱼、成鱼DNA经亚硫酸氢盐转化后的扩增情况

分析：斑马鱼基因组经亚硫酸氢盐处理后，不含CG位点的检测片段，无论是胚胎、幼体、幼鱼或成鱼DNA，均能扩增，且扩增效率相当；含有CG位点的片段，在胚胎DNA能正常扩增，且扩增效率相当，幼体DNA虽然也能扩增，但CP值有明显的后延，说明甲基化的水平有所下降，幼鱼和成鱼DNA不能扩增，说明检测区域无甲基化或甲基化水平很低，未达到检测限。

结论：由以上实验结果，外源DNA可选择斑马鱼基因组，如果选择不含CG位点的片段作为检测区域，无论是胚胎DNA或成鱼DNA都可使用；如果选择带有甲基化位点的检测区域，建议选择胚胎DNA或96小时的幼体DNA。

实施例4 不同批次购买的斑马鱼DNA的扩增情况考察

考察了3个批次的斑马鱼（胚胎期选择24和48小时、幼鱼选择1个月、成鱼选择12个月）DNA，分别取20ng经亚硫酸氢盐转化，考察选择的内参片段的PCR扩增情况。DNA转化操作见实施例1，PCR检测使用三重PCR体系。扩增结果见表7。

表7 不同批次斑马鱼DNA经亚硫酸氢盐转化后的扩增情况

分析：对于不含CG位点的片段，不同批次的胚胎、幼鱼和成鱼DNA，均能扩增，且扩增的CP值稳定；含有CG位点的片段，不同批次的斑马鱼胚胎DNA扩增的CP值稳定。满足作为内参的要求。

实施例5 考察加入斑马鱼DNA后对检测效果是否有影响，以及外源内参扩增是否稳定（检测靶标：septin9）

构建和优化3重PCR检测体系，以甲基化靶标septin9为例，在参考品和血浆样本中考察，加入斑马鱼DNA后，对靶标检测的影响，以及外源内参的扩增情况。本次实验投入的斑马鱼DNA为：24小时胚胎DNA，投入量为20ng。参考品和样本的DNA提取、转化见实施例1，PCR考察两重和三重的检测效果，具体结果分别见表8和表9。

表8 两重与三重体系1-3（外源内参片段不含CG位点）检测结果

表9 三重体系4-6（外源内参片段含CG位点）检测结果

结果分析：

1. 检出情况：

1）参考品检测，加与不加斑马鱼DNA，6个三重PCR与双重PCR检测下限一致，均在10ng/mL-0.1%。

2）样本检测，加与不加斑马鱼DNA，对结直肠癌的检出和健康人的特异性，检测结果一致：未加斑马鱼样本，双重PCR检测，10个结直肠癌检出8个，7个健康人均无扩增；加入斑马鱼DNA后，6个三重PCR体系对样本的检测结果均与双重PCR检测一致。

2. 靶标、ACTB及外源内参的的CP值差值分析

1）靶标CP值：相同浓度的参考品的septin9-CP值及同一例结直肠癌的septin9-CP值，在双重PCR（未投斑马鱼DNA）和6个三重PCR（投入斑马鱼DNA）检测中，CP值差异不大，均在一个CP值范围内。

2）ACTB-CP值：相同浓度的参考品的septin9-CP值及同一例结直肠癌的septin9-CP值，在双重PCR（未投斑马鱼DNA）和6个三重PCR（投入斑马鱼DNA）检测中，CP值差异不大，均在一个CP值范围内。

3）6个外源内参的CP值：

在参考品和样本中，相同的胚胎DNA均各投入20ng，检测了no-CG1、no-CG2、no-CG3、CG1、CG2、CG3共6个外源内参，各个外源内参的CP值差异不大，均在一个CP值范围内。

小结：

由以上实验可知，投入斑马鱼对检测下限、结直肠癌样本的检出和健康人特异性无影响；且投入后的三重PCR检测对靶标及ACTB的CP值无影响；相同的外源内参检测，CP值稳定（极差在一个CP值范围内），满足其作为内参的要求。

实施例6 考察加入斑马鱼DNA后对检测效果是否有影响，以及外源内参扩增是否稳定（检测靶标：RPRM）

构建和优化3重PCR检测体系，以甲基化靶标RPRM为例，在参考品和血浆样本中考察，加入斑马鱼DNA后，对靶标检测的影响，以及外源内参的扩增情况。本次实验投入的斑马鱼DNA为：6个月成鱼不含CG位点的DNA，投入量为20ng。参考品和样本的DNA提取、转化见实施例1，PCR考察两重和三重（不含CG位点的内参）的检测效果，具体结果分别见表10。

表10 两重与三重体系（外源内参片段不含CG位点）的检测结果

结果分析：由以上实验可知，投入斑马鱼对检测下限、胃癌样本的检出和健康人特异性无影响；且投入后的三重PCR检测对靶标及ACTB的CP值无影响；相同的外源内参检测，CP值稳定（极差在一个CP值范围内）。满足其作为内参的要求。

实施例7 分别以内源和外源内参，计算septin9的甲基化水平及连续变化情况，考察对结直肠癌术后的复发监控效果

考察了14例接受手术治疗的结直肠癌患者，检测术前、术后（手术后3-7天）、术后6、12、18个月的septin9甲基化水平，考察靶标对疾病复发的能力。CT检测在术后6、12、18个月，复发状态由临床诊断（CT或病理诊断）。临床确认复发的有2位患者，分别位13（12个月复发）和8（18个月复发）。临床诊断确定复发的患者，不入组下一个监控的时间点。在样本检测时，投入72小时的胚胎DNA，投入量为20ng。以含有CG位点的区域CG2作为外源内参，各监控时间点的靶标及内参的扩增情况见表11，以外源基因计算的septin9的甲基化水平见表12、其连续变化见图1，以内源内参计算的靶标水平见表13、其趋势图见图2。

表11 各监控时间点的靶标及内参的扩增情况

表12 以外源内参CG-2计算的靶标甲基化水平

表13 以内源内参ACTB计算的靶标甲基化水平

结果分析：

1，以外源内参计算的靶标趋势：

1）术前靶标检测均为阳性，甲基化水平不等，术后所有样本靶标甲基化水平均有明显的下降；

2）样本8和13：术后6个月的靶标甲基化水平有明显的上升；术后12个月，这两个样本甲基化水平仍然有上升趋势，此时样本13临床诊断为：复发；术后18个月，样本13的甲基化水平仍然有上升趋势，此时样本8临床诊断为：复发。

样本8靶标提示疾病进展和复发比临床诊断早：12个月，样本13靶标提示疾病进展和复发比临床诊断早：6个月。

3）样本6从12个月具有上升趋势，18个月甲基化水平上升幅度增大，临床诊断状态为：未复发。

4）其余样本术后的3次检测，甲基化水平保存在较低水平。

2，以内源内参计算的靶标趋势：

1）术前靶标检测均为阳性，甲基化水平不等，术后所有样本靶标甲基化水平均有明显的下降；

2）样本8：术后6个月的靶标甲基化水平有明显的上升；术后12和18个月靶标甲基化水平仍然呈上升趋势，18个月临床诊断为复发，靶标比临床早提示12个月。

3）样本13：术后6个月的靶标甲基化水平有明显的上升，术后12个月显示甲基化水平急剧下降，而此时临床诊断该患者结直肠癌复发。造成该现象的原因时，此次检测内参ACTB的CP值异常，CP值偏小，已经小于内参质控范围的下限，在相对定量计算时，造成靶标表达量下降的现象。

4）其余样本术后的3次检测，甲基化水平保存在较低水平。

3，小结：外源内参比较稳定，不会受样本收集（尤其时血浆样本收集）过程或者受试者身体原因的影响，能更准确的体现出靶标的变化。

实施例8 分别以内源和外源内参，计算RPRM的甲基化水平及连续变化情况，考察对化疗效果的评价

考察了16例治疗方案为姑息治疗（化疗治疗、姑息性化疗，排除手术治疗）的胃癌患者，每个化疗周期前后，分别检测RPRM甲基化水平，RPRM甲基化的水平变化与临床影像学的化疗疗效评价标准进行比较。评价靶标对化疗效果的指示作用。16例患者中，3个患者（4、7、10）临床评价为：进展性疾病（PD），其余13例为非进展期疾病（SD、CR、PR）。在样本检测时，投入48小时的胚胎DNA，投入量为20ng。以含有CG位点的区域CG3作为外源内参，化疗前后的靶标及内参的扩增情况见表14，不同内参计算的甲基化水平，及化疗前后的百分比变化分别见表15、16。若百分比变化＞50%，判读为疾病进展，反之疾病为非进展性。

表14 化疗前后靶标及内参的扩增情况

表15 外源内参计算的甲基化水平及变化值

表16 内源内参计算的甲基化水平及变化值

结果分析：

以外源内参计算：患者4、7、10、13判读为进展性疾病，其余为非进展性疾病。与临床诊断不相符的有1例：患者13，有可能分子靶标提前于CT检测，需进展密切随访，关注其疾病进展状态。

以外源内参计算：患者4、7、13判读为进展性疾病，其余为非进展性疾病。与临床诊断不相符的有2例：患者13可能的原因不再赘述。重点分析患者10，内源内参化疗后ACTB值偏小，已经小于内参质控范围的下限，在相对定量计算时，造成靶标表达量下降，所以造成该现象。

实施例9 分别以内源和外源内参，考察胎儿特异性的DNA标志物-甲基化的RASS1A1基因在不同妊娠期的相对含量

抽取18名妊娠妇女（包括早、中、晚期妊娠各6例）的全血，制备血浆，在样本检测时，投入12个月成鱼DNA，投入量为20ng。以不含CG位点的区域CG2作为外源内参，靶标及内参的扩增情况见表17，不同内参计算的靶标相对含量见表18和图3-4。

表17 甲基化的RASS1A1和内参的扩增情况

表18 不同内参计算的靶标相对含量水平

结果分析：

无论以外源或内源内参计算，胎儿特异的靶标含量整体水平是随着妊娠期的时长而上升的。

用外源内参分析，靶标的含量水平在各妊娠期的含量较为均一；用内源内参计算，在考察的6例中期妊娠孕妇，个别（12#）的胎儿游离DNA含量水平同组其他个体水平，12#的胎儿游离DNA水平在用外源计算含量水平时，无此现象。可能的原因是内源内参的DNA的水平可能受到体内其他因素的影响，检测CP值偏小导致的。

实施例10 在斑马鱼基因组内选取其他的区段，考察是否满足作为外源内参

在斑马鱼基因组上随机选取了24个片段（其中：含CG位点的片段12个，不含CG位点的片段12个），再加上之前的CG1-3和NO CG1-3，共30个片段，分别考察这些片段作为外源内参的检测效果。检测5个浓度梯度参考品：分别含有不同拷贝数靶标（甲基化的septin9基因）的参考品，5个浓度梯度分别为：606.06copy、303.03copy、60.60copy、30.30copy和15.15copy，分别命名为参考品1-5。参考品在提取前，各参考品中投入20ng的24小时的斑马鱼胚胎DNA。考察的标准有3个：1，各个多重PCR检测体系，是否能检测到下限（15.15copy）；2，各外源内参在5个参考品中的扩增的CV值是否小于5%；3，利用各外源内参计算的相对甲基化含量，和起始拷贝数的线性关系，R

表19 含CG位点的片段的检测结果

表20 不含CG位点的片段的检测结果

表21 不同外源内参在参考品扩增的CP值的CV、相对定量值与与参考品起始浓度的相关性

分析:由表19~20可知，选取的内参片段，在与靶标在多重PCR体系的检测中，均能检测到最低拷贝数的参考品，可知对检测体系的性能无影响；且各检测区域的CP值在参考品中的CV满足要求，说明在不同的检测其CP值较稳定，偏差不大；其相对定量值与内参的起始拷贝数的R

附录：

上述实施例中所用的30个斑马鱼核酸片段的染色体位置（参考基因组为）如表22所示。

表22

NO CG1～NO CG15的序列依次为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：15所示。

CG1～CG15的序列依次为SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：30所示。

上述斑马鱼核酸片段多对应的检测引物探针为表23所示。

表23

其中，组合1和组合2均用于检测经过亚硫酸氢盐处理后的序列。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 江苏为真生物医药技术股份有限公司

<120> 灵长类动物DNA甲基化相对定量试剂盒

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 147

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

ggttgcaaaa caaatagaga tgatgaccaa agttaagcag cagcagcagc agcagcaaca 60

acaacaacaa caacagcagc agcagcaaca acagcagcag cagcaagact acagaatgag 120

catgaatggc atgccaatga accagcc 147

<210> 2

<211> 114

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

ccacagagac ctgaaaccag agaacctgct gctggatgag aagaataata tcaggatagc 60

agactttggc atggcttctc tacaggttgg agacagtctc ttagaaacca gctg 114

<210> 3

<211> 140

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

gaccccagtg aacaggattc ccatcatggc caagcaggtg ctggacctct acatgctcta 60

ccagctggtg acagaaaagg gggggctggt ggaggtcata aataaaaagt tgtggaggga 120

gatcaccaag ggcttgaact 140

<210> 4

<211> 105

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

gaggagagct cagaggagga tccacctata gacatcacta ctgtgcagga catgttgagc 60

agtcaccact acaagtcctt caagatcagc atgatccaca agctc 105

<210> 5

<211> 90

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

agggtgaaga gccatgcaaa tgtccattcc actgcctcaa agaagaatga gaagaagcac 60

tggaagagaa accctgagag gagctgtgat 90

<210> 6

<211> 98

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

agggtctgtg caatgctcac atcaagccca ttcacatgct gctcagccca ccctaacaaa 60

acagtggagt ttgaatgaag gatgaagaag aagacata 98

<210> 7

<211> 125

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

ggagctttgg gaaggtgttg ggcctggact cctctgagtt gcccactctg gggatcctgc 60

aggaggggct gctcaacctg ggcaacagca tgggccaggt gcaggacctg ctggtgagac 120

tgctc 125

<210> 8

<211> 76

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

gggtggtggc aggacatcat aggccatgga gcccaatatg gagtactgtc tgacccaggt 60

gctacagaag gatgtt 76

<210> 9

<211> 144

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 9

ggactgtgtg aggcaggagg gcactaaccc tgacacccag cttcaggatg ggtacacctg 60

cagagcatgt aagcaggtgg aggaggagac cagacacagt caacctgtca gcagccagga 120

ggcttctctc actgacccag agcc 144

<210> 10

<211> 113

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 10

aaggtgatca aggtgtacag gaagtggatt ctacaggaga aacctgcttt catggctgag 60

cctgagacca caaaccagga ggaagataca gaggaagagc agctggtcac aga 113

<210> 11

<211> 167

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 11

gtatgcactc agtgtgggaa gagttttaac tgcttaacaa accttaatca ccacatgagg 60

atccacactg gagagaaacc attcaaatgc actcagtgtg ggaagagttt cagccaatca 120

tcatacctta atctacacat gaggatccat actggagaga aaccata 167

<210> 12

<211> 82

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 12

gagccctctg gcacagatgg aggaggagag gagagatcat gtggcaaaga tgaagaagat 60

ggaaatggag atggagcagg tg 82

<210> 13

<211> 131

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 13

acagtgagcc ctgcagccag agaggaaggg agggaggaga gtacattggg tgggagtttc 60

aggagagaga gagagagaga gagagagaga aagaaagaga gagagagaga aggattgtct 120

tgcattatat c 131

<210> 14

<211> 224

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 14

ggcaatgtgt gtggactgtg tggaaacttt gatggcaatg caaacaatga cttcatgaag 60

cacaatggag aagtggtgac agatccagag gagtttggca atagctggaa ggtggattca 120

aattgtcctg atgtgacaaa tgtgatgcat ccttgtgaag cacatccaca taggaattcc 180

tgggctatca agcaatgcag aatcatcaca agccctgtct ttac 224

<210> 15

<211> 114

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 15

gtgcagtgaa catgtgggtc acagtaaaca gtgtggatgg ggggcaacag accatgtttg 60

atgattcaac acctgtccac aagcagctca ttgacatcaa gtactccaaa gata 114

<210> 16

<211> 147

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 16

acgcggacgg acaactgcgg tttttatgcg tgactgaaga ccacaaacac ggactgttgc 60

tgcaagaact gacggagaaa taacaaacaa tcaactcaaa acatgagctg cgcaatgttg 120

cgacacgcgc tcgctttgct gctggcg 147

<210> 17

<211> 260

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 17

acgtgtagca gaaaagatcg cccaccggca gactgtcaga atcggtcgca ccatgaagct 60

tcagtgtcct gtggagggtg atccgccgcc cctcatcatg tggaccaaag acggacgaaa 120

cattcacagt ggctggatgc gcttcagggt tcttcagcaa gctctccgca tcaaagaggt 180

ggaggcagac gatgctggga cgttcatttg taaagccacg aatggattcg gcagtgtcaa 240

tatcaactac accctcatcg 260

<210> 18

<211> 151

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 18

cacgggggag tgaaccagct gggcggggtg ttcgtcaacg ggaggccttt acctgacgtc 60

gtgcgccaga gaatcgtgga gctcgcgcat cagggggtcc gaccctgcga catatcccga 120

cagctgaggg tcagtcacgg ctgcgtcagc a 151

<210> 19

<211> 133

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 19

cgtgtagcga tcagcgttca caaacagagc atcactctga ttttggactg taagaaaaag 60

gtgacgcgga cactctccag aagccctcat cccatcatcg acaccaaagg cattgtggtc 120

ttcggaacgc gga 133

<210> 20

<211> 142

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 20

cgagcagtgt cacgaccata tcatacagcg agaaaagcgg gattgtactg cgtttaagcg 60

gtttctgcga gaggatacga aacagccgct tctcgtttgt gaacatctgg gcagagatgt 120

aacagtttcc cggcattggc gt 142

<210> 21

<211> 274

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 21

tctgatggag aggatgctgg agtgggctgt gacggataac cgtgaggcgt cggcggtcac 60

cctgccacag cacacagaaa acgcggtgcg cctcctgcat gtggtgcagg atttcctgca 120

ggcggagggt ctggtgaatc cggctctgtg gacggagaag cttctggagg agacggtgac 180

cctgatggac gggctgatgg tgtggtacgc atccggcaca cagtggctgc agctctctca 240

ggtggggctg cggctgctgc tcggcttcat ggcg 274

<210> 22

<211> 135

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 22

tgcgtgtgta acatcgactg ctcccacatc agttttaacc ctgtgtgcgc atcagacggc 60

cgttcatatg acaacccatg ccaggtaaaa gaggcgtcgt gtcagcgaca ggagcgcatc 120

gaggtcaagt tcctg 135

<210> 23

<211> 186

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 23

acggcagcgg ctggagacaa tcttgaacct ctgcgctgag tataacaagg gcgacgggcc 60

gccgggtgat ttgggcagga tgggcgtctc tgggcttggc tcgagggacg ggcttaacgt 120

caggcgtcct tcaatggaca gcgtgaacag cgcttcacta agagcgactc aaagacaacg 180

ggaaag 186

<210> 24

<211> 176

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 24

atcgcgtttc gcgcgccaga gaataaagcg tcgctgaggc tcgtgccgga ttttctctgc 60

gtgcacgaga ctcattcgac aagtttaagc gcgtgatact gaacggactc gcgtcgacgg 120

tatatacagt caaggagaga agagcgagtt aacgtataga gcaggggaaa gcgcgt 176

<210> 25

<211> 140

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 25

cgccgaggcc cagcagtttc tgcggtatgc ccaggcctcc gaagtcctca aaaaccgcaa 60

gaatgtgggc tatcacatcg tctacaagga gggtcagttc tacccggtca acctggtgcg 120

caatgtggcg cttcgcaacg 140

<210> 26

<211> 87

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 26

acggctgtaa gctgatccgc aaccgctccg agtgcaaaga catcgactgg gccacgtaca 60

cctgcgtgct cggcttccac gtcttcg 87

<210> 27

<211> 208

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 27

cggagatgat ggatttgagc agtgacgtcg gtggtcctgg gatccccttt ctggattatc 60

gcacatacgc agaacgtgtt ttcttccccg gccagaaggg ggcgcctctg agtcagaacc 120

tggatttacc cgactctcgc aggcagacag tggagcaggg cctttctcag ctcaacaacc 180

tgctcaacaa cagactcttc ctcatacg 208

<210> 28

<211> 233

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 28

cgtcacaagg tgtgcgcaac aaaacccatc caccatcagt cgagctcttc acatcgcgac 60

gcgcacgagc caccatcagc cgagactgtc acaactcttt cgcacagata tacgctgaca 120

cgggacttac gcatcctcat ttattttctg tctggagttg attggatcat ttaaaacgcg 180

caaaataagg gatttaggtc tgctctcaaa ttgatttgaa ggcgaggagc tcg 233

<210> 29

<211> 119

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 29

cgattacgat aagatcggca agaacgatgc catcgggaag atctgggtgg gcagtaaagc 60

gcagggcacc gagctccggc actggtccga catgctggcc aacccacgca ggcccatcg 119

<210> 30

<211> 122

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 30

attacgcccg tcgccagttc aacctggtgg acacggaaca tctgcgatac cgacaactat 60

acgctttcga ccgtgacatg aatctcacag aagacaaata cagctggctg actgccgctc 120

ag 122