用于预测晚期肺腺癌免疫治疗疗效的试剂盒和系统

摘要

本发明涉及用于预测晚期肺腺癌免疫治疗疗效的试剂盒和系统，属于精准医疗临床分子诊断领域。具体而言，本发明涉及一种预测晚期肺腺癌免疫治疗疗效的生物标志物、试剂盒、系统、计算设备和存储介质；通过检测7基因生物标志物的体细胞非同义突变，快速高效地评估和预测晚期肺腺癌的免疫治疗疗效。

说明书

技术领域

本发明属于精准医疗临床分子诊断领域，涉及一种预测晚期肺腺癌的免疫治疗，例如使用免疫检查点抑制剂的免疫治疗的疗效的试剂盒、系统、计算设备和存储介质。

背景技术

非小细胞肺癌是中国人群中最为常见及致命的癌种之一，其中肺腺癌是最为常见的亚型（约占60-70%）。晚期肺腺癌经典的治疗手段为化疗和/或放疗，当存在EGFR等敏感突变时使用受体酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）有较好的治疗效果。然而这些治疗面临的主要问题是癌细胞终将适应并逐渐发展出相应的耐药抗性。

免疫治疗，特别是以免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）为代表的生物大分子药物带来了晚期肺腺癌治疗的极大变革。然而，仅有部分晚期肺腺癌患者（大约20-30%左右）能获益于这种治疗方法，因此亟需有效的生物标志物预测临床获益人群。目前临床上常见的免疫治疗疗效预测生物标志物包括PD-L1、MSI和TMB，已展现出一定的预测效力，然而依然存在很多的局限，包括较高的检测成本和缺少统一的衡量标准等。

免疫治疗通过重新激活人体适应性免疫系统特别是CD8+ T细胞识别来自肿瘤细胞的抗原（肿瘤新抗原，tumor neoantigen）。这些新抗原来自肿瘤细胞中发生的体细胞非同义变异所产生的异常氨基酸序列，并与I型HLA特异性识别与结合。通常肿瘤新抗原数量与肿瘤突变负荷存在显著正相关性。

PD-L1作为免疫治疗biomarker应用最为广泛。PD-L1是一种表达于细胞膜表面的蛋白，由人体CD274基因编码。通过与CD8+ T细胞上的PD-1及B7.1结合，传导免疫抑制信号，抑制效应T细胞。临床上通过免疫组化方法对手术或穿刺后取得的肿瘤组织进行切片染色，镜下观察根据着色深浅来评价表达情况。通常PD-L1蛋白高表达的实体瘤患者，对免疫治疗应答率更高。

但是，多个临床试验结果显示PD-L1表达对免疫治疗疗效的预测能力并不一致，部分PD-L1阴性患者依然能从免疫治疗获益，且持续缓解时间并不逊于PD-L1阳性患者。同时，PD-L1检测由于不同抗PD-(L)1药物都有各自对应的PD-(L)1检测抗体和平台，导致缺乏统一的标准；另外PD-L1的表达具有动态变化的特点，导致PD-L1表达与免疫治疗效果之间的关系仍有一些争议。

另一方面，TMB（肿瘤突变负荷，tumor mutational burden）是获得NCCN指南推荐的免疫治疗生物标志物(biomarker)。通过全外显子组测序（WES）或大基因panel（如MSK-IMPACT）对肿瘤组织或外周血游离肿瘤DNA（ctDNA）的全部或特定基因编码区进行深度测序，并通过一定的生物信息学变异识别软件，计算得到每Mb基因区域内发生体细胞非同义突变的个数。多个独立临床研究表明，在包括黑色素瘤及非小细胞肺癌在内的多个癌种中，TMB与免疫治疗疗效存在显著的正相关关系。但是TMB依然只能反映肿瘤突变数量，而不能提示肿瘤微环境的状态，且TMB检测对技术平台要求较高，工作周期较长，成本较高都制约其临床应用。同时，TMB的疗效预测力有限，并且测序成本高昂，而各家临检机构的大基因panel所选取的基因集合也存在一定的差异，TMB阈值难以建立共识，也难以统一衡量比较分析。

此外，还有MSI检测，即微卫星不稳定性（Microsatellite Instability，MSI），是指由于在DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星（Microsatellite, MS）序列长度改变的现象，常由错配修复功能（Mismatch repair, MMR）缺陷引起。通常MSI高的实体瘤患者，对免疫治疗应答率更高。但是肺腺癌中MSI-H比例太低，临床推广有一定局限性。

综上所述，现有技术（TMB检测、PD-L1检测和MSI检测）的主要缺点有：1、疗效预测力有限；2、成本高昂，带来较高的医疗负担；3、不同机构的基因panel所选取的基因集合存在一定的差异，很难统一衡量比较；4、阈值设定标准不统一；5、临床上难以推广。

因此，本领域仍然需要更高效、更准确地鉴定适用于预测癌症免疫治疗疗效的方法和工具。

发明内容

为了解决所述问题，本发明通过筛选与免疫治疗直接相关的重要基因，排除掉大部分与免疫治疗应答无关的基因，获得与预测晚期肺腺癌患者免疫治疗疗效的关键生物标志物，提高疗效预测效力的同时降低检测成本和分析时间。

具体地，通过公共数据挖掘，针对晚期肺腺癌转移灶基因检测数据和免疫治疗疗效评估数据，筛选出7个最重要的相关基因。这些基因的体细胞突变状态能有效预测免疫检查点抑制剂对晚期肺腺癌的治疗疗效，并且预测效力优于TMB指标。

首先，在第一方面，本发明涉及生物标志物，其用于预测晚期肺腺癌患者对免疫治疗（例如使用免疫检查点抑制剂的免疫治疗）的敏感性，以预测免疫治疗的疗效，所述生物标志物包括突变的7基因。它们分别是EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和EPHB1。

在另一方面，本发明提供了一种用于预测晚期肺腺癌免疫治疗疗效的试剂盒，所述试剂盒包含特异性检测EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和/或EPHB1基因突变的试剂。

本发明提供一种用于预测晚期肺腺癌免疫治疗，例如免疫检查点抑制剂治疗的疗效的方法，所述方法包括以下步骤：

a）其评估所述患者的肿瘤组织中的EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和/或EPHB1基因的体细胞非同义突变；

b）将所述发生了体细胞非同义突变的基因数进行加和得到SUM值；

所述SUM值的计算方法为：若样本在所述7基因中的n个基因中发生了体细胞非同义突变，而其他7-n个基因中无体细胞突变或仅有同义突变或突变发生在非编码区，则该样本的SUM=n；若在7基因中均无体细胞突变或仅有同义突变或突变发生在非编码区，则SUM=0；

其中n为整数，且0

c）基于步骤b）的SUM值结果，与界定值比较，若大于或等于界定值则判断免疫治疗有效，低于界定值则无效；从而预测晚期肺腺癌的免疫治疗的疗效。

在一些实施方案中，所述界定值为1、2、3、4、5、6或7；优选地，所述界定值为1。

在本发明中，基因非同义突变可以包括点突变(point mutation)和片段突变(fragment mutation)；点突变可以是单核苷酸多态性(SNP)、碱基取代、单碱基插入或碱基缺失；片段突变可以是融合/重排突变、扩增突变、插入/缺失和截短突变。

在本文的实施方案中，所述免疫治疗可以是免疫检查点抑制剂的免疫治疗。

如本文所用，术语“免疫检查点”是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路。机体在正常情况下，免疫检查点可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受，然而机体在受到肿瘤侵袭时，免疫检查点的激活会抑制自身免疫，有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。通过使用免疫检查点抑制剂，可以恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制和清除肿瘤。本领域已知多种可用于肿瘤治疗的免疫检查点抑制剂。

本发明所述免疫检查点包括已知免疫检查点例如PD-1和PD-L1。本发明所述免疫检查点抑制剂包括但不限于PD1抑制剂或PD-L1抑制剂，例如帕博丽珠单抗（Pembrolizumab，商品名Keytruda）、纳武利尤单抗（Nivolumab，商品名Opdivo）、阿特珠单抗（Atezolizumab，商品名Tecentriq）及德瓦鲁单抗（Durvalumab，商品名Imfinzi）等。

在一些实施方案中，通过比较肿瘤组织与对照组织的测序数据，例如全外显子组测序或靶向测序数据评估肿瘤组织中的EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和/或EPHB1基因的体细胞非同义突变。

在一些实施方案中，所述肿瘤组织为癌组织；进一步地，所述肿瘤组织为原发灶或转移灶。

在一些实施方案中，所述对照组织是来自所述对象的正常组织（非肿瘤组织），例如癌旁组织或白细胞等正常组织或细胞。

在一些实施方案中，评估EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和/或EPHB1的突变包括确定其编码区是否存在非同义突变，例如移码突变等。

在一些实施方案中，通过全外显子组测序或靶向测序评估EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和/或EPHB1的突变状态。本领域已知各种可以检测具体基因突变状态的方法都可以应用于本发明。

术语“突变负荷”，在肿瘤的背景下，在本文中又称为“肿瘤突变负荷”或“TMB”。肿瘤突变负荷(TMB)被定义为每百万碱基中被检测出的体细胞非同义突变的个数，包括基因错义突变、移码或框内插入或缺失等突变的总数。TMB一般以非同义突变的总数量除以测量基因区间大小即每1Mb（1兆碱基）的非同义突变数量来表示(mutants/Mb)。

在一些实施方案中，如果i) EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和/或EPHB1的体细胞非同义突变至少存在一个，则预测所述免疫治疗有效。在另一些实施方案中，如果ii) EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和/或EPHB1的基因无体细胞非同义突变或突变发生在非编码区，则预测所述免疫治疗无效。

在本发明中，通过组合考虑EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和/或EPHB1突变状态，能够准确预测晚期肺腺癌患者中对免疫检查点抑制剂敏感的群体，避免盲目用药，提高免疫检查点抑制剂治疗的经济性能。

本领域技术人员可以理解，上述方法步骤的全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。

当上述方法步骤中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现上述功能。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现上述全部或部分功能。另外，当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的系统进行版本更新，当通过处理器执行存储器中的程序时，即可实现上述实施方式中全部或部分功能。

在另一方面，本发明提供一种用于预测晚期肺腺癌的免疫治疗，例如免疫检查点抑制剂治疗的疗效的系统或装置，所述系统或装置包括以下三个模块：

评估模块I），其评估所述患者的肿瘤组织中的EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和/或EPHB1基因的体细胞非同义突变；

计算模块II），将所述发生了体细胞非同义突变的基因数进行加和得到SUM值；

所述SUM值的计算方法为：若样本在所述7基因中的n个基因中发生了体细胞非同义突变，而其他7-n个基因中无体细胞突变或仅有同义突变或突变发生在非编码区，则该样本的SUM=n；若在7基因中均无体细胞突变或仅有同义突变或突变发生在非编码区，则SUM=0；

其中n为整数，且0

判断模块III），基于计算模块的SUM值结果，与界定值比较，若大于等于界定值则判断免疫治疗有效，低于界定值则无效；从而预测晚期肺腺癌的免疫治疗的疗效。

在一些实施方案中，所述界定值可为1、2、3、4、5、6或7；优选地，所述界定值为1。

在一些实施方案中，评估模块I）通过比较肿瘤组织与对照组织的测序数据，例如全外显子组测序或靶向测序数据评估所述EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和/或EPHB1的突变。

在一些优选的实施方案中，评估模块I）确定EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和/或EPHB1的编码区是否存在体细胞非同义突变，例如移码突变等。

在一些实施方案中，如果i) EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和/或EPHB1的体细胞非同义突变至少存在一个，则预测所述免疫治疗有效。在另一些实施方案中，如果ii) EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和/或EPHB1无体细胞非同义突变或突变发生在非编码区，则预测所述免疫治疗无效。

在优选的实施方案中，根据计算模块II）中，体细胞突变的基因数进行加和得到的SUM值，在判断模块III）中，当SUM值≥1时，则可判断免疫治疗有效；SUM值为1是本发明优选采用的预测界定值。

在另一方面，本发明还涉及了特异性检测7基因突变的试剂在用于预测晚期肺腺癌免疫治疗疗效的试剂盒、系统和装置中的用途。所述试剂例如基因组测序试剂、基因特异性引物或探针等。

进一步地，所述试剂盒为上文所述的试剂盒；所述系统和装置为上文所述的系统或装置。

在另一方面，本发明还提供一种计算设备，其包含：

至少一个处理单元；和至少一个存储器，所述存储器与耦合至所述处理单元，并存储用于由所述处理单元执行的指令，所述指令当被执行时，所述设备能够实现本发明上文所述的预测晚期肺腺癌免疫治疗疗效的方法。

在另一方面，本发明涉及一种计算机可读存储介质，其存储有计算机程序，该程序能够被机器执行，以实现本发明上文所述的预测晚期肺腺癌免疫治疗的疗效的方法。

本发明的有益效果：本发明提供了一种有效预测晚期肺腺癌免疫治疗疗效的低成本高效力检测手段。与需要评估多达数百乃至全部基因体细胞非同义突变状态的TMB不同的是，本发明只通过7个关键基因有无体细胞非同义突变划分疗效评估分组。有利于简化检测内容，降低检测成本，加快检测报告出具效率，相比PD-L1免疫组化方法需要人工判读免疫组化片子以及TMB需要人为确定阈值而言，7个基因突变状态的检测更为简单、直接、可靠。

附图说明

为更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。以下描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。

图1：本发明分析预测方法流程图。

图2A：风险比率（Hazard Ratio）分析结果图，本发明SUM值作为变量的多因素分析结果，综合考虑性别（Gender）和年龄（Age）因素的影响；其中第一列为变量名称，第二列为变量分组，第三列为HR值，最后一列为P值。

图2B：风险比率（Hazard Ratio）分析结果图，TMB作为变量的多因素分析结果，综合考虑性别（Gender）和年龄（Age）因素的影响；其中第一列为变量名称，第二列为变量分组，第三列为HR值，最后一列为P值。

图3A：存活概率（Survival probability）分析结果图，SUM值的Survivalprobability分析。

图3B：存活概率（Survival probability）分析结果图，TMB的Survivalprobability分析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式以及附图对本发明进行详细的说明。

实施例1：预测免疫治疗疗效的靶标筛选和预测效力评估

在肿瘤相关基因组检测数据库MSKCC下载了266例晚期肺腺癌（LUAD）队列数据，包括患者临床基线资料、患者基因组数据（包括基因突变数据）、治疗方案数据、转移灶数据和总体生存（OS）数据。

只选择接受了PD-1或PD-L1治疗的晚期肺腺癌病人共250例，然后选择其中转移灶病例132例，排除肝转移和脑转移32例得100例，最后剔除OS小于3个月（实际应用中可选取ECOG评分在0-1之间的病例），共得82例。随后进行单因素分析与OS最相关（P<0.1）的基因共7个，具体信息如表1所示。

表1：7基因具体信息表

注：第一列基因名；第二列和第三列分别是HR值（Hazard Ratio，风险比率）及其显著性P值；第四列和第五列分别是该基因野生型和突变型的数目（N=82）；最后一列是该基因编码蛋白的具体功能。

随后将这7个基因组合为一个基因集合，将其中发生了体细胞突变的基因数进行加和得到SUM值（SUM of mutated genes in the gene set）。例如：若样本A在EGFR和ERBB4两个基因发生体细胞非同义突变（无论具体的总突变数多少或每个基因突变数多少），而PTPRD、NTRK3、ZFHX3、RB1和EPHB1无体细胞突变或仅有同义突变或突变发生在非编码区，则该样本的SUM值为2。

对SUM值的预测效力进行多因素分析（以7基因集合中是否发现非同义体细胞突变分为SUM=0和SUM>=1两组，同时考虑年龄和性别因素的作用），发现SUM>=1的HR值=0.194（95%CI: 0.086-0.43, P<0.001），即当SUM>=1时病人死亡风险仅为SUM=0时的19%。而对TMB值的预测效力进行多因素分析（以10mutants/Mb为阈值分为TMB-高和TMB-低两组，同时考虑年龄和性别因素的作用），发现TMB-高的HR值=0.66（95%CI: 0.34-1.3, P=0.227）。具体Hazard Ratio分析结果如图2A和2B。

图3A和图3B显示了具体存活概率（Survival probability）分析结果。根据上述结果结合图3A和图3B（其中3A为SUM值的Survival probability分析；3B为TMB的Survivalprobability分析），在晚期肺腺癌中，7基因集合的体细胞非同义突变SUM值状态是一个比TMB更加显著而有效的预测生物标志物，仅以7个基因的体细胞非同义突变的有无对晚期肺腺病人进行分组，就能很好地预测免疫治疗的疗效获益人群。

实施例2：7基因预测晚期肺腺癌免疫治疗疗效的应用

1）对受试者的肺腺癌组织样品以及正常组织样品（对照样品）分别进行基因组DNA的抽提和纯化，采用定量聚合酶链反应分别扩增EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和EPHB1基因，将产物定量和均一化后，进行数据分析；

2）对所得的7基因EGFR、PTPRD、ERBB4、NTRK3、ZFHX3、RB1和EPHB1进行测序；比较肿瘤组织和正常组织测序结果，确定各基因的体细胞突变；

3）将其中发生了体细胞非同义突变的基因数进行加和得到SUM值；计算方法为：例如样本在EGFR和ERBB4发生体细胞非同义突变，而PTPRD、NTRK3、ZFHX3、RB1和EPHB1无体细胞突变或仅有同义突变或突变发生在非编码区；即样本在7基因的2个基因中发生了体细胞非同义突变，则该样本的SUM值为2；7基因中，若有3个基因存在体细胞非同义突变，则该样本SUM值为3；以此类推。若样本在7基因中均无体细胞突变或仅有同义突变或突变发生在非编码区，则SUM值为0；

4）按照步骤3）方法计算，得到SUM值，其SUM值为2>1，因此可预测该受试者接受免疫治疗有效；因而输出预测结果为有效。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。