一种基于Y-STR基因座和Y-Indel的荧光检测试剂盒及其使用方法和应用

摘要

本发明提供一种基于Y‑STR基因座和Y‑Indel的荧光检测试剂盒及其使用方法和应用。所述荧光检测试剂盒能够在单次PCR反应中同时分析38个Y‑STR基因座和3个Y‑indel。所述试剂盒采用多色荧光标记复合扩增技术，能够快速完成扩增，独特的基因座组合方式和引物序列更符合中国人遗传特征，保留了足够通用基因座，便于DNA数据的交流与共享，而且更符合中国人群遗传特点；同时，扩增产物稳定长效，Y染色体特异性高，对于高背景女性DNA条件仍然能够获得完整男性DNA的分型，适用于提取DNA、血斑、唾液斑、口腔拭子等样本，可用于父系亲缘关系的鉴定、个体识别以及公安建库等多种用途。

说明书

技术领域

本发明涉及基因座荧光标记复合扩增检验系统，具体涉及一种人类DNA分型试剂盒，尤其涉及一种基于Y-STR基因座和Y-Indel的荧光检测试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术

Y染色体为性染色体，根据遗传方式不同可以将其分为两个区，即位于Y染色体两端的拟常染区(pseudoautosomal region，PAR)和男性特异区(male-specific region，MSY)。男性特异区又称为非重组区(non-recombining region,NRY)，约占Y染色体95％的区域，不会与任何染色体发生重组，呈严格父系遗传，同一家系的后代拥有完全相同的Y染色体非重组区(排除突变的情况下)。

Y染色体遗传标记，包括短串联重复序列(STR)、单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失多态性(Indel)和和Alu插件被发现，它们具有男性特有、父系遗传和单倍体遗传三大特性。其中STR和SNP是Y染色体上最常用的两种遗传标记。目前法医上利用Y染色体STR建库以进行家系搜索，根据由Y-STRs位点组成的单倍型在家系间具有高度多态性，可广泛用于家系排查，可锁定犯罪嫌疑人所在家系，缩小搜索范围，提高侦查破案的效率。

CN102676676公开了一种Y染色体STR基因座荧光检测试剂盒及其应用，包含人Y染色体上24个基因座(DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS587、DYS527a/b、DYS460、Y-GATA-AlO、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、DYS570和DYS444)相对应的扩增引物。然而，该试剂盒中检测的Y-STR基因座数量较少，可能会导致检测结果不准确，影响家系搜索。

CN110878359A公开了一种基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒，包括9个慢突变Y染色体STR基因座的复合扩增引物混合物，复合扩增反应混合液，等位基因分型标准物和标准DNA9948；所述9个慢突变Y染色体STR基因座为DYS593、DYS443、DYS645、DYS388、DYS531、DYS596.DYS426.DYS454和DYS455。该试剂盒未避免快突变基因座带来的影响，仅使用9个慢突变Y染色体STR基因座进行检测，也可能会导致检测结果不准确或者灵敏度较差。

目前，法医上利用Y-STR建库以进行家系搜索，有助于指明侦查方向，从而缩小嫌疑人范围。在Y-STR建库的实际操作过程中，往往只对一个大家系中的一个或几个成员进行采样建库，那么这一个或几个人即代表了整个家系的Y-STR信息。若构建Y数据库的试剂盒中Y-STR基因座的突变率较高或检测结果不准确，同一家系个体之间也可能由于突变表现为不同的单倍型，可能会对家系搜索带来干扰。同时，若采样过程中，采集到的样本量较少，则需要试剂盒具有较好的灵敏度，否则无法扩增得到样本并对其进行正确的分析。

因此，提供一种低突变率、高灵敏度的人类Y染色体分型试剂盒，是本领域亟需解决的问题。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于Y-STR基因座和Y-Indel的荧光检测试剂盒及其使用方法和应用。所述荧光检测试剂盒符合中国人群遗传特点且扩增产物稳定长效，Y染色体特异性高，对于高背景女性DNA条件仍然能够获得完整男性DNA的分型。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于Y-STR基因座和Y-Indel的荧光检测试剂盒，所述荧光检测试剂盒中包含用于同时扩增38个STR基因座和3个Y-Indel的41个引物对；

所述3个Y-Indel为rs199815934，rs771783753和rs759551978；

所述38个Y-STR基因座为：DYS533、DYS19、DYS635、DYS456、DYS447、DYS444、DYS645、DYS643、DYS460、DYS437、DYS439、DYS557、DYS385a、DYS385b、DYF387S1a、DYF387S1b、DYS522、DYS549、DYS389I、DYS448、DYS389II、DYS596、GATA H4、DYS518、DYS393、DYS391、DYS390、DYS392、DYS449、DYS527a、DYS527b、DYS593、DYS438、DYS576、DYS570、DYS481、DYS627和DYS458。

本发明提供的荧光检测试剂盒，可以在单次PCR反应中同时分析38个Y-STR基因座和3个中国人特有的Y-indel，其中38个Y-STR基因座在中国人群中具有低突变、高多态性的特点，其单倍型具有更好的家系代表性，更加适合Y-STR数据库建设，降低了同系异型的风险，且包含了3个公安建库最新要求的备选位点：DYS593、DYS522、DYS645以及3个中国人特有的Y-indel：rs199815934，rs771783753和rs759551978；独特的基因座组合方式和引物序列更符合中国人遗传特征，保留了足够通用基因座，便于DNA数据的交流与共享，而且更符合中国人群遗传特点。

作为本发明优选的技术方案，所述引物对中至少一条序列的5′端携带荧光染料标记物，所述荧光染料标记物包括FAM、JOE、TAM、ROX、AF594或AF633中的任意一种。

优选地，所述41个引物对按携带荧光染料标记物的种类分为5组，所述荧光染料标记物包括FAM、JOE、TAM、ROX和AF594。

需要注意的是，本发明中依据荧光染料标记物的种类将扩增引物和其对应的引物对进行分类，但是每组携带的标记物种类并不是固定的。例如：第一组携带FAM、第二组携带JOE、第三组携带TAM、第四组携带ROX、第五组携带AF594；或者第一组携带AF594、第二组携带JOE、第三组携带TAM、第四组携带ROX、第五组携带FAM；只要保持五组引物对携带五种不同颜色的(且与内标颜色)不同的荧光标记物即可。

作为本发明优选的技术方案，所述41个引物对按携带荧光染料标记物的种类分为5组：

第一组包括扩增rs199815934，rs771783753、rs759551978、DYS533、DYS19、DYS635、DYS456、DYS447、DYS444和DYS645的引物对，荧光标记颜色为蓝色；

第二组包括扩增DYS643、DYS460、DYS437、DYS439、DYS557、DYS385a、DYS385b、DYF387S1a、DYF387S1b和DYS522的引物对，荧光标记颜色为绿色；

第三组包括扩增DYS549、DYS389I、DYS448、DYS389II、DYS596、GATAH4和DYS518的引物对，荧光标记颜色为黄色；

第四组包括扩增DYS393、DYS391、DYS390、DYS392、DYS449、DYS527a、DYS527b和DYS593的引物对，荧光标记颜色为红色；

第五组包括扩增DYS438、DYS576、DYS570、DYS481、DYS627和DYS458的引物对，荧光标记颜色为紫色。

本发明中所述引物对按照各基因座的核苷酸序列进行设计，所得引物能够正常扩增目标序列，满足荧光检测试剂盒的检测标准。

优选地，所述荧光检测试剂盒中各引物对的浓度相同或不同。

优选地，所述引物对中上引物和下引物的浓度相同，所述上引物的浓度为0.2～3μM，例如可以是0.2μM、0.5μM、0.8μM、1μM、1.5μM、1.8μM、2μM、2.2μM、2.5μM、2.8μM或3μM等；所述下引物的浓度为0.2～3μM，例如可以是0.2μM、0.5μM、0.8μM、1μM、1.5μM、1.8μM、2μM、2.2μM、2.5μM、2.8μM或3μM等。

优选地，所述荧光检测试剂盒中还包含PCR反应液、阳性对照样本和分型试剂。

优选地，所述分型试剂中使用的Ladder为Allelic Ladder。

PCR试剂与分型试剂初次运输采用干冰运输，储存温度为-25～-15℃(例如可以是-25℃、-23℃、-21℃、-20℃、-18℃、-16℃或-15℃等)，首次使用后于2～8℃(例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃等)分区保存，避免反复冻融。

第二方面，本发明一种如第一方面所述的荧光检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)以采集到的样本直接作为扩增模板或将采集到的样本进行纯化后得到的DNA作为扩增模板，配制得到反应体系后进行扩增；

(2)对扩增产物进行荧光检测，分析检测数据得到样本的基因分型。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中所述扩增的反应体系中PCR反应液、引物对混合物与扩增模板的体积比为(1～4):(2～3):1，例如可以是1:2:1、1:2.5:1、1:2.8:1、1:3:1、2:2:1、3:2:1、4:2:1或4:3:1等，优选为2:2:1。

优选地，所述扩增模板的工作浓度为0.01～0.2ng/μL，例如可以是0.01ng/μL、0.02ng/μL、0.05ng/μL、0.08ng/μL、0.1ng/μL、0.12ng/μL、0.15ng/μL、0.18ng/μL或0.2ng/μL等。

优选地，步骤(1)中所述扩增的循环参数为：95℃预变性5min；95℃变性10s，62℃退火60s，70℃延伸20s，共26～28个循环；60℃终延伸15min；4℃保存。

所述荧光检测试剂盒能够在90min内完成扩增，适用于提取DNA、血斑、唾液斑、口腔拭子等样本。

作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中所述荧光检测时毛细管电泳体系中扩增产物的使用量为0.5～1.5μL，例如可以是0.5μL、0.6μL、0.8μL、1μL、1.2μL、1.3μL、1.4μL或1.5μL等。

本发明中，在对扩增产物进行荧光检测前，还需要进行荧光光谱校正。3100/3130/3130XL、3500/3500XL光谱校正参数和操作参考光谱校正说明书，设备必须经过光谱校正，设备进行激光管更换、校准或者更换CCD相机、或者更换胶的种类、毛细管等主要部件维修后，仪器必须运行新的matrix文件。

本发明中，检测时使用的毛细管电泳体系如表1所示：

表1

为保证样本正确分型，电泳时必须设置Ladder孔位，Allelic Ladder的推荐量为1μL。

优选地，步骤(2)中所述荧光检测时毛细管电泳的进样时间为5～25s，例如可以是5s、6s、8s、10s、12s、15s、16s、18s、20s、22s、24s或25s等。可以根据样本的种类或峰值的高低调整进样时间，峰值与进样时间成正相关。

根据遗传分析仪的不同对进样电压和时间进行调整，推荐参数如表2所示：

表2

本发明中，采用如下方法进行数据分析：

(1)初次使用本发明中提供的试剂盒需要先导入提供的Panel、bins、Analysismethod以及Size Standard；

(2)导入电泳数据，选择相应的Panel、Analysis method以及Size Standard等电泳参数，在“Sample Type”栏中，将Ladder的样本类型改为“Allelic Ladder”；开始分析数据。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的荧光检测试剂盒在法医家系搜索、个体识别、父系亲缘关系的鉴定、公安建库或人口迁徙进化中的应用。

本发明提供的试剂盒应用广泛，对于血斑、唾液斑、口腔拭子等可以进行直接扩增而无需模板提取和纯化，同时也适用于案件样本提取的DNA模板。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供的荧光检测试剂盒采用6色能量转移荧光标记复合扩增技术，在单次PCR反应中同时分析38个Y-STR基因座和3个中国人特有的Y-indel，独特的基因座组合方式和引物序列更符合中国人遗传特征，保留了足够通用基因座，便于DNA数据的交流与共享，而且更符合中国人群遗传特点，适用于提取DNA、血斑、唾液斑、口腔拭子等样本，优化的反应体系大幅缩短扩增时间至90min，扩增产物稳定长效；Y染色体特异性高，对于高背景女性DNA条件仍然能够获得完整男性DNA的分型，检测灵敏度高达62.5pg，可用于父系亲缘关系的鉴定、个体识别以及公安建库等多种用途。

(2)本发明提供的荧光检测试剂盒的提供的荧光标准物，峰高在2500相对荧光强度单位以下时，不会出现高于50相对荧光强度单位的渗透峰；等位基因分型标准物不会产生错误的基因分型，各等位基因峰高低峰/高峰在50％以上：所有等位基因分型与试剂盒设定的bin偏差在±0.2bp之间：每个基因座的相邻两个等位基因片段差与试剂盒设定的bin偏差在±0.l bp之间；在等位基因范围内出现的非特异性片段应低于相邻等位基因峰高的5％；阳性样本9948在0.125ng时仍然能够检测出全部Y染色体STR基因座分型，并且分型正确无等位基因丢带现象，一次性检测88份血卡样本，检出率可达到97.60％；同时，所述荧光检测试剂盒满足刑事技术产品质量监督检验中的各项技术要求。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例提供一种荧光检测试剂盒，所述荧光检测试剂盒包括如表3所示的组分：

表3

其中，等位基因及阳性对照分型信息如下表4所示：

表4

其中引物对按照各基因座的核苷酸序列进行设计即可。

实施例2

本实施例用于鉴定实施例1提供的荧光检测试剂盒对各等位基因的分型是否正确。

(1)扩增：实施例1提供的试剂盒中的试剂在使用前需要完全溶解，涡旋震荡混匀，短暂离心后根据实际样本量采用不同的扩增体系。本实施例中使用的扩增体系如下表5所示；

其中PCR反应液：引物对混合物：扩增模板＝2:2:1；

表5

扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，62℃退火60s，70℃延伸20s，共28个循环；60℃终延伸15min；4℃保存。

(2)检测：对扩增产物进行荧光检测，分析检测数据得到样本的基因分型。(3)结果分析：等位基因分型标准物的检测结果如表6所示：

表6

结合上表的结果可知，检测图谱基因分型完全正确，每个等位基因分型的峰高大于500相对荧光强度单位，各等位基因峰高低峰/高峰在50％以上：所有等位基因分型与试剂盒设定的bin偏差在±0.2bp之间：每个基因座的相邻两个等位基因片段差与试剂盒设定的bin偏差在±0.l bp之间；在等位基因范围内出现的非特异性片段应低于相邻等位基因峰高的5％；经软件分析，等位基因分型标准物未产生错误的基因分型。

实施例3

本实施例用于验证实施例1中提供的检测试剂的其他相关性能，所使用的检测方法同实施例2.

(1)荧光标准物检测：所有基因座等位基因分型和分子量标准在应用荧光标准物进行光谱校正后，峰高在2500相对荧光强度单位以下时，未出现高于50相对荧光强度单位的渗透峰。

(2)分子量标准物检测：内标所含有的条带应清晰明确；与重复检验的等位基因分型标准物间标准偏离小于±0.2bp：内标中每个DNA片段的峰高大于500相对荧光强度单位：单独电泳检测内标，不出现非特异性谱带。

(3)阳性DNA对照样本检测：，阳性标准物的分型在有效检测区域内未出现高于目的等位基因峰高5％的非特异峰：全部Y-STR基因座的等位基因片段长度与Ladder相应基因座的片段长度偏差小于±0.5bp。

(4)阴性对照样本：阴性样本在每个基因座均无等位基因谱带出现。

(5)灵敏度检测：0.125ng阳性样本9948检出全部Y染色体STR基因座分型。

(6)直接扩增试剂盒检出率：一次性检测88份血卡样本，检出率可达到94.31％。

(7)一致性检测：同一样本不同检测人员检测结果应一致；同一样本使用不同的DNA测序仪进行检测结果应一致：对己知分型的同一样本检测，相同基因座分型结果无差异。

(8)均衡性检测：同色荧光标记物的不同基因座之间均衡性应大于50％；不同荧光标记基因座的均衡性应大于50％。同色荧光标记物的不同基因座之间均衡性均大于54.13％；不同荧光标记基因座的均衡性均大于67.57％。

(9)男性样本特异性检测：混合比为1:500时应检测出男性样本全部分型，且无荧光强度高于100rfu的非目的片段。男女混合比1:1000时可检测出男性样本全部分型结果。在个别基因座出现荧光强度高于100rfu的非目的片段。

(10)稳定性检测：在试剂有效期内反复冻融后，阳性DNA对照样本的结果仍符合阳性对照样本的相关要求，且灵敏度、均衡性在最后一次冻融与第一次冻融结果无明显差异，阳性、阴性对照未出现信号高于50相对荧光强度单位的随机伪峰。

(12)种属特异性检测：在分型范围内，非人源样本不出现特异性谱带。

(13)人源性DNA污染检测：无人源性DNA污染。

综上所述，本发明提供了一种满足刑事技术产品质量监督检验中的各项技术要求的荧光检测试剂盒，所述试剂盒兼容性好，灵敏度高，检测速度快，具有广泛的应用空间。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。