一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试纸条、检测卡及试剂盒

摘要

本发明提供了一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试纸条，包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上包被有相互分离且依次分布的封闭线、抗环瓜氨酸肽抗原检测线、羊抗鼠IgG质控线，所述封闭线上固相有荧光抗体线，所述封闭线和荧光抗体线的喷涂方式如下：将配置好的封闭液喷涂于硝酸纤维素膜上封闭线对应的位置，干燥0.5h，制得封闭线，将荧光抗体用稀释液稀释，混匀之后，喷涂于干燥之后的封闭线正中间位置，制得荧光抗体线。解决了荧光抗体包被于硝酸纤维素膜上长时间存放难以释放的难题，降低了生产成本，同时解决了湿式免疫荧光层析法荧光抗体不能常规存放的难题，提高了荧光抗体的稳定性，有利于试剂盒的运输与储存，延长了试剂盒的保质期。

说明书

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种针对抗环瓜氨酸肽抗体的检测试纸条、检测卡及试剂盒。

背景技术

类风湿关节炎（RA）是一种最常见的自身免疫性疾病，也是最多发的慢性炎症关节疾病，在全世界大约有1%的人患有此病，大约75%是女性患者。病理表现为关节滑膜的慢性炎症、血管翳形成，并出现关节的软骨和骨破坏，若不能及时诊断及时正规治疗，最终可导致关节畸形和功能丧失。RA早期、可靠的诊断对于采取适当的治疗控制病情发展、避免不可逆的关节损坏是十分重要的。

RA患病早期表现多样化，对疑似RA患者最常用的血清学检测除了常规炎症参数外，就是类风湿因子（RF）。RF是抗γ球蛋白抗体（主要是IgM抗体），在RA中的阳性率为60～80%。由于在健康人群和各种感染性疾病以及其它自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮、干燥综合征和硬皮病等）患者中也可以检出RF，特异性差，不利于早期诊断。

近年来发现，抗环瓜氨酸肽抗体（抗环瓜氨酸肽）是环状聚丝蛋白的多肽片段，其对RA是有很好的敏感度和特异性，在RA的早期阶段就可出现阳性，具有很高的阳性预测值，同时可以用来预测RA的严重程度。

研究表明，在RA 患者的血清中可以检测到抗核周因子(APF)和抗角蛋白抗体(AKA)，其抗原位点是环瓜氨酸多肽，抗环瓜氨酸肽抗体（抗环瓜氨酸肽）主要是IgG类抗体，对RA的特异性为95%，70～80%患者在疾病很早期就在血清和滑膜液中出现抗环瓜氨酸肽抗体（抗环瓜氨酸肽），因此，抗环瓜氨酸肽抗体（抗环瓜氨酸肽）的检测对RA早期诊断以及预后具有重要意义。

目前，检测抗环瓜氨酸肽抗体（抗环瓜氨酸肽）的方法有很多，酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金免疫层析法、免疫比浊法、化学发光法、放射免疫法等方法进行测定，但缺乏更为快速简易而又可靠的检测方法。酶联免疫法法自动化程度不高，检测时间长，且受人为因素影响较大；胶体金免疫层析法操作简便，但判读结果存在人为误差，只能定性检测；免疫比浊法受样本内容物的影响，结果区分度差、漏检率较高；放射免疫法存在着环境污染问题；而化学发光法灵敏度虽高，但测定线性范围较小且检测成本较高，需要特定化学发光检测仪，这些原因导致其应用范围较小。

荧光免疫层析法检测血清中的抗环瓜氨酸肽抗体（抗环瓜氨酸肽），与其他几种方法相比较，存在操作简单、时间短、灵敏度高、线性范围宽、无污染、仪器自动显示结果，定量检测等显著的特点，因此，荧光免疫层析法有着极大的研究价值。目前，荧光免疫层析法多为液相反应模式，试剂盒需要2～8℃放置，对试剂盒的储存及运输带来不便。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试纸条，其检测灵敏度高、特异性好、检测快速、准确。

还提供一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试剂卡，便于携带，快速、准确的检测。

还提供一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试剂盒，其使用便捷、操作简单，便于储存和运输。

为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试纸条，包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上包被有相互分离且依次分布的封闭线、抗环瓜氨酸肽抗原检测线、羊抗鼠IgG质控线，所述封闭线上固相有荧光抗体线，所述封闭线和荧光抗体线的喷涂方式如下：

将配置好的封闭液以1.5μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜上封闭线对应的位置，然后放在37℃条件下干燥0.5h，制得封闭线，将荧光抗体用荧光抗体稀释液按照1:10的比例稀释，混匀之后，以0.5μL/cm的喷量喷涂于干燥之后的封闭线正中间位置，制得荧光抗体线。

在硝酸纤维素膜上先喷涂封闭液，先封闭硝酸纤维素膜，再通过喷涂方式固相荧光抗体，解决了荧光抗体包被于硝酸纤维素膜上长时间存放难以释放的难题，荧光抗体固相在硝酸纤维素膜上而不是固相于独立的结合垫上，降低了生产成本，同时解决了湿式免疫荧光层析法荧光抗体不能常规存放的难题，提高了荧光抗体的稳定性，有利于试剂盒的运输与储存，延长了试剂盒的保质期。

作为一种优化方案，所述荧光抗体的制备方法如下：

荧光抗体的标记：用PBS缓冲液将鼠抗人IgG抗体稀释到终浓度为2～10mg/mL，用纯水配制NaHCO

荧光抗体的纯化：将标记结束的荧光抗体取出，通过葡聚糖凝胶柱进行分离纯化。

作为一种优化方案，所述封闭液包括以下组份：

20～100mM Tris；NaCL 0.1～1.5g；牛血清白蛋白0.5～3g；酪蛋白0.1～0.5g；PVP0.1～5g；蔗糖1～10g；海藻糖1～3g；吐温0.01～0.1mL，Tris缓冲液的PH为8.0～8.5。

作为一种优化方案，所述荧光抗体稀释液包括以下组份：

20～100mM Tris；NaCL 0.1～1.5g；牛血清白蛋白0.5～3g；PVP 0.1～5g；蔗糖1～10g；海藻糖1～3g；Tris缓冲液的PH为8.0～8.5。

作为一种优化方案，所述抗环瓜氨酸肽抗原检测线的包被方法如下：

将抗环瓜氨酸肽抗原与载体蛋白偶联，载体蛋白经过55℃热破坏处理，载体蛋白为牛血清白蛋白。

将偶联后的抗环瓜氨酸肽抗原用抗原稀释液稀释到0.5mg/mL，以1.0μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的抗原检测线处。

所述羊抗鼠IgG质控线的包被方法如下：

用PBS缓冲液将羊抗鼠IgG稀释到1.0mg/mL，以1.0μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的质控检测线处。

作为一种优化方案，所述抗原稀释液制备方法如下：

60.5mgTris、0.9g的氯化钠、3g的海藻糖溶于100mL蒸馏水中，再加入10mL甘油混匀，过滤，装入广口瓶备用。

一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测卡，检测卡包括扣合的上盖和下盖，所述下盖上具有凹槽，所述凹槽内放置有上述的试纸条。

一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试剂盒，包括上述的检测卡和样本稀释液，所述样本稀释液包括20～100mM Tris、NaCL 0.1～1.5g、酪蛋白0.1～0.5g、PEG 0.1～5g、明胶0.05～0.5g、S9 0.1～1mL、吐温0.1～1mL、PC300 0.1～1mL，Tris缓冲液的PH为8.0～8.5。

本发明采取以上技术方案，具有以下优点：

（1）本试剂盒采用干式免疫荧光层析法，在硝酸纤维素膜上先喷涂封闭液，先封闭硝酸纤维素膜，再通过喷涂方式固相荧光抗体,利于荧光抗体释放，解决了荧光抗体包被于硝酸纤维素膜上长时间存放难以释放的难题，荧光抗体固相在硝酸纤维素膜上而不是固相于独立的结合垫上，降低了生产成本，同时解决了湿式免疫荧光层析法荧光抗体不能常规存放的难题，提高了荧光抗体的稳定性，有利于试剂盒的运输与储存，延长了试剂盒的保质期。

（2）通过葡聚糖凝胶柱对荧光抗体进行分离纯化，根据分子筛效应，比较于常规的透析法，实现荧光抗体与游离荧光的彻底分离，降低检测过程的基线本底，增加结果的特异性。

（3）抗原稀释液中添加一定浓度的海藻糖增强了抗原结构的稳定性，通过添加甘油增加了亲水性，加快抗原抗体的接触反应，提高了试剂盒检测的敏感度，同时使结合在抗原线处的荧光抗体更加均一，避免了中空效应带来的仪器吸收荧光不均匀而产生的重复性问题。

（4）将短肽的抗原与大分子物质牛血清白蛋白进行偶联，解决了层析过程中，由于抗原分子量过小不易包被于硝酸纤维素膜的难题，将偶联剂牛血清白蛋白进行热破坏处理，提高了抗原的偶联率。

（5）样本缓冲液中加入酪蛋白，对非特异性结合反应起到了一定的封闭作用，降低了本底；通过添加大分子物质PEG，提高了敏感度；通过添加一定量的明胶，阳性显色更加明显，阴性更加白净，提高了仪器的区分度，降低了可疑样本的判断。通过添加合适浓度的表面活性剂，解决了抗环瓜氨酸肽抗原与55℃破坏的牛血清白蛋白偶联后，偶联抗原长期与膜结合，浸润性变差而带来的的重复性难题，同时也解决了样本中的抗体在检测线处反应时间过长引起的假阳问题，提高了检测的特异性。

（6）本试剂盒用于体外定性或半定量检测人血清、血浆、全血中的抗环瓜氨酸肽（抗环瓜氨酸肽）抗体。实际操作过程中，只需要1μL血清、血浆或2μL全血，静脉取血或采集末梢血均能达到要求，微量加样操作，减少了患者在采血过程中的痛苦，尤其对于小孩解决了取血的难题，将血清、血浆或全血与样本缓冲液混匀之后，5～10min即将测出结果，方便快捷，缩短了等待过程。

（7）本发明试剂盒具有保质期较长、特异性好，灵敏度高，样本需求量小，操作方便简单、检测速度快，仪器直接显示结果，准确可靠。可满足医院诊所及卫生检疫部门的临床需求，也可用于大专院校和科研机构的疾病诊断研究。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

附图1是本发明检测卡的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：如附图1所示，一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试纸条，包括底板8，底板8为PVC板，底板8上粘贴有依次搭接的全血过滤垫9、硝酸纤维素膜10和吸水纸11，全血过滤垫9一端压住硝酸纤维素膜10一端1mm，吸水纸11的一端压住硝酸纤维素膜10另一端1mm，在底板8的中间位置粘贴制备的硝酸纤维素膜10，在底板8固定硝酸纤维素膜10位置的上方粘贴全血过滤垫9和吸水纸11，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。

所述硝酸纤维素膜10上包被有相互分离且依次分布的封闭线12、抗环瓜氨酸肽抗原检测线5、羊抗鼠IgG质控线6，所述封闭线12上固相有荧光抗体线13，封闭线12距离硝酸纤维素膜10左端4mm，宽度1.5mm，荧光抗体线13距离硝酸纤维素膜10左端4.5mm，宽度0.5mm。

所述封闭线12和荧光抗体线13的喷涂方式如下：

将配置好的封闭液以1.5μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜上封闭线对应的位置，然后放在37℃条件下干燥0.5h，制得封闭线12; 将荧光抗体用荧光抗体稀释液按照1:10的比例稀释，混匀之后，以0.5μL/cm的喷量喷涂于干燥之后的封闭线12正中间位置，制得荧光抗体线13。

由于硝酸纤维素膜对蛋白具有较强的吸附力，在固相荧光抗体之前，需要在固相荧光抗体的位置处先将膜进行封闭，然后固相荧光抗体，利于荧光抗体的释放。

采用干式荧光免疫层析法，将荧光抗体直接固相在硝酸纤维素膜上，而不是常规的固相在全血过滤垫9上，区别于湿式荧光免疫层析法将荧光抗体单独放在特定2～8℃环境中存放，提高了荧光的稳定性。由于硝酸纤维素膜对蛋白具有较强的吸附力，在固相荧光抗体之前，用封闭液先将膜进行封闭，然后固相荧光抗体，利于荧光抗体的释放。

所述荧光抗体的制备方法如下：

荧光抗体的标记：用PBS缓冲液将鼠抗人IgG抗体稀释到终浓度为2mg/mL，用纯水配制NaHCO

荧光抗体的纯化：将标记结束的荧光抗体取出，通过葡聚糖凝胶柱进行分离纯化；根据分子筛效应，实现游离的荧光染料与标记的荧光抗体之间的彻底分离。

通过葡聚糖凝胶柱对标记好的荧光抗体进行分离纯化，比较于常规的透析法，实现荧光抗体与游离荧光的彻底分离，降低检测过程的基线本底，增加结果的特异性。

封闭液的组成：缓冲系统、蛋白保护剂、大分子物质、表面活性剂和蛋白质。

所述封闭液包括以下组份：

20mM Tris；NaCL 0.1g；牛血清白蛋白0.5g；酪蛋白0.1g；PVP 0.1g；蔗糖1g；海藻糖1g；吐温0.01mL，Tris缓冲液的PH为8.0。

荧光抗体需要用荧光抗体稀释液稀释到合适的浓度，荧光抗体稀释液的组成：缓冲系统、蛋白保护剂、大分子物质和蛋白质。

所述荧光抗体稀释液包括以下组份：

20mM Tris；NaCL 0.1g；牛血清白蛋白0.5g；PVP 0.1g；蔗糖1g；海藻糖1g；Tris缓冲液的PH为8.0。

所述抗环瓜氨酸肽抗原检测线的包被方法如下：

将抗环瓜氨酸肽抗原与载体蛋白偶联，载体蛋白经过55℃热破坏处理，载体蛋白为牛血清白蛋白。

将偶联后的抗环瓜氨酸肽抗原用抗原稀释液稀释到0.5mg/mL，以1.0μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的抗原检测线处。

常规方法通常是将抗环瓜氨酸肽抗原直接包被在膜上，但是抗环瓜氨酸肽抗原通常为12～20个AA的短肽，不容易包被，本发明提供了一种将抗原与一种大分子蛋白物质进行偶联解决不容易包被难题，并将大分子物质进行热破坏处理改变结构，提高了抗原的偶联率。

所述羊抗鼠IgG质控线的包被方法如下：

用PBS缓冲液将羊抗鼠IgG稀释到1.0mg/mL，以1.0μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的质控检测线处。

所述抗原稀释液制备方法如下：

60.5mgTris、0.9g的氯化钠、3g的海藻糖溶于100mL蒸馏水中，再加入10mL甘油混匀，过滤，装入广口瓶备用。

硝酸纤维素膜的干燥处理，喷涂完荧光抗体线、抗环瓜氨酸肽抗原检测线、羊抗鼠IgG质控线后，将硝酸纤维素膜放在37℃、湿度小于40%的环境下平衡2h。

实施例2：如附图1所示，一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试纸条，包括底板8，底板8为PVC板，底板8上粘贴有依次搭接的全血过滤垫9、硝酸纤维素膜10和吸水纸11，全血过滤垫9一端压住硝酸纤维素膜10一端1mm，吸水纸11的一端压住硝酸纤维素膜10另一端1mm，在底板8的中间位置粘贴制备的硝酸纤维素膜10，在底板8固定硝酸纤维素膜10位置的上方粘贴全血过滤垫9和吸水纸11，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。

所述硝酸纤维素膜10上包被有相互分离且依次分布的封闭线12、抗环瓜氨酸肽抗原检测线5、羊抗鼠IgG质控线6，所述封闭线12上固相有荧光抗体线13，封闭线12距离硝酸纤维素膜10左端4mm，宽度1.5mm，荧光抗体线13距离硝酸纤维素膜10左端4.5mm，宽度0.5mm。

所述封闭线12和荧光抗体线13的喷涂方式如下：

将配置好的封闭液以1.5μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜上封闭线对应的位置，然后放在37℃条件下干燥0.5h，制得封闭线12; 将荧光抗体用荧光抗体稀释液按照1:10的比例稀释，混匀之后，以0.5μL/cm的喷量喷涂于干燥之后的封闭线12正中间位置，制得荧光抗体线13。

由于硝酸纤维素膜对蛋白具有较强的吸附力，在固相荧光抗体之前，需要在固相荧光抗体的位置处先将膜进行封闭，然后固相荧光抗体，利于荧光抗体的释放。

采用干式荧光免疫层析法，将荧光抗体直接固相在硝酸纤维素膜上，而不是常规的固相在全血过滤垫9上，区别于湿式荧光免疫层析法将荧光抗体单独放在特定2～8℃环境中存放，提高了荧光的稳定性。由于硝酸纤维素膜对蛋白具有较强的吸附力，在固相荧光抗体之前，用封闭液先将膜进行封闭，然后固相荧光抗体，利于荧光抗体的释放。

所述荧光抗体的制备方法如下：

荧光抗体的标记：用PBS缓冲液将鼠抗人IgG抗体稀释到终浓度为10mg/mL，用纯水配制NaHCO

荧光抗体的纯化：将标记结束的荧光抗体取出，通过葡聚糖凝胶柱进行分离纯化；根据分子筛效应，实现游离的荧光染料与标记的荧光抗体之间的彻底分离。

通过葡聚糖凝胶柱对标记好的荧光抗体进行分离纯化，比较于常规的透析法，实现荧光抗体与游离荧光的彻底分离，降低检测过程的基线本底，增加结果的特异性。

封闭液的组成：缓冲系统、蛋白保护剂、大分子物质、表面活性剂和蛋白质。

所述封闭液包括以下组份：

100mM Tris；NaCL 1.5g；牛血清白蛋白3g；酪蛋白0.5g；PVP 5g；蔗糖10g；海藻糖3g；吐温0.1mL，Tris缓冲液的PH为8.5。

荧光抗体需要用荧光抗体稀释液稀释到合适的浓度，荧光抗体稀释液的组成：缓冲系统、蛋白保护剂、大分子物质和蛋白质。

所述荧光抗体稀释液包括以下组份：

100mM Tris；NaCL 1.5g；牛血清白蛋白3g；PVP 5g；蔗糖10g；海藻糖3g；Tris缓冲液的PH为8.5。

所述抗环瓜氨酸肽抗原检测线的包被方法如下：

将抗环瓜氨酸肽抗原与载体蛋白偶联，载体蛋白经过55℃热破坏处理，载体蛋白为牛血清白蛋白。

将偶联后的抗环瓜氨酸肽抗原用抗原稀释液稀释到0.5mg/mL，以1.0μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的抗原检测线处。

常规方法通常是将抗环瓜氨酸肽抗原直接包被在膜上，但是抗环瓜氨酸肽抗原通常为12～20个AA的短肽，不容易包被，本发明提供了一种将抗原与一种大分子蛋白物质进行偶联解决不容易包被难题，并将大分子物质进行热破坏处理改变结构，提高了抗原的偶联率。

所述羊抗鼠IgG质控线的包被方法如下：

用PBS缓冲液将羊抗鼠IgG稀释到1.0mg/mL，以1.0μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的质控检测线处。

所述抗原稀释液制备方法如下：

60.5mgTris、0.9g的氯化钠、3g的海藻糖溶于100mL蒸馏水中，再加入10mL甘油混匀，过滤，装入广口瓶备用。

硝酸纤维素膜的干燥处理，喷涂完荧光抗体线、抗环瓜氨酸肽抗原检测线、羊抗鼠IgG质控线后，将硝酸纤维素膜放在37℃、湿度小于40%的环境下平衡4h。

实施例3：如附图1所示，一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试纸条，包括底板8，底板8为PVC板，底板8上粘贴有依次搭接的全血过滤垫9、硝酸纤维素膜10和吸水纸11，全血过滤垫9一端压住硝酸纤维素膜10一端1mm，吸水纸11的一端压住硝酸纤维素膜10另一端1mm，在底板8的中间位置粘贴制备的硝酸纤维素膜10，在底板8固定硝酸纤维素膜10位置的上方粘贴全血过滤垫9和吸水纸11，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。

所述硝酸纤维素膜10上包被有相互分离且依次分布的封闭线12、抗环瓜氨酸肽抗原检测线5、羊抗鼠IgG质控线6，所述封闭线12上固相有荧光抗体线13，封闭线12距离硝酸纤维素膜10左端4mm，宽度1.5mm，荧光抗体线13距离硝酸纤维素膜10左端4.5mm，宽度0.5mm。

所述封闭线12和荧光抗体线13的喷涂方式如下：

将配置好的封闭液以1.5μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜上封闭线对应的位置，然后放在37℃条件下干燥0.5h，制得封闭线12; 将荧光抗体用荧光抗体稀释液按照1:10的比例稀释，混匀之后，以0.5μL/cm的喷量喷涂于干燥之后的封闭线12正中间位置，制得荧光抗体线13。

由于硝酸纤维素膜对蛋白具有较强的吸附力，在固相荧光抗体之前，需要在固相荧光抗体的位置处先将膜进行封闭，然后固相荧光抗体，利于荧光抗体的释放。

采用干式荧光免疫层析法，将荧光抗体直接固相在硝酸纤维素膜上，而不是常规的固相在全血过滤垫9上，区别于湿式荧光免疫层析法将荧光抗体单独放在特定2～8摄氏度环境中存放，提高了荧光的稳定性。由于硝酸纤维素膜对蛋白具有较强的吸附力，在固相荧光抗体之前，用封闭液先将膜进行封闭，然后固相荧光抗体，利于荧光抗体的释放。

所述荧光抗体的制备方法如下：

荧光抗体的标记：用PBS缓冲液将鼠抗人IgG抗体稀释到终浓度为6mg/mL，用纯水配制NaHCO

荧光抗体的纯化：将标记结束的荧光抗体取出，通过葡聚糖凝胶柱进行分离纯化；根据分子筛效应，实现游离的荧光染料与标记的荧光抗体之间的彻底分离。

通过葡聚糖凝胶柱对标记好的荧光抗体进行分离纯化，比较于常规的透析法，实现荧光抗体与游离荧光的彻底分离，降低检测过程的基线本底，增加结果的特异性。

封闭液的组成：缓冲系统、蛋白保护剂、大分子物质、表面活性剂和蛋白质。

所述封闭液包括以下组份：

60mM Tris；NaCL 0.9g；牛血清白蛋白1g；酪蛋白0.3g；PVP 2.5g；蔗糖5g；海藻2g；吐温0.05mL，Tris缓冲液的PH为8.2。

荧光抗体需要用荧光抗体稀释液稀释到合适的浓度，荧光抗体稀释液的组成：缓冲系统、蛋白保护剂、大分子物质和蛋白质。

所述荧光抗体稀释液包括以下组份：

60mM Tris；NaCL 0.9g；牛血清白蛋白2g；PVP 2.5g；蔗糖5g；海藻糖2g；Tris缓冲液的PH为8.2。

所述抗环瓜氨酸肽抗原检测线的包被方法如下：

将抗环瓜氨酸肽抗原与载体蛋白偶联，载体蛋白经过55℃热破坏处理，载体蛋白为牛血清白蛋白。

将偶联后的抗环瓜氨酸肽抗原用抗原稀释液稀释到0.5mg/mL，以1.0μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的抗原检测线处。

常规方法通常是将抗环瓜氨酸肽抗原直接包被在膜上，但是抗环瓜氨酸肽抗原通常为12～20个AA的短肽，不容易包被，本发明提供了一种将抗原与一种大分子蛋白物质进行偶联解决不容易包被难题，并将大分子物质进行热破坏处理改变结构，提高了抗原的偶联率。

所述羊抗鼠IgG质控线的包被方法如下：

用PBS缓冲液将羊抗鼠IgG稀释到1.0mg/mL，以1.0μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的质控检测线处。

所述抗原稀释液制备方法如下：

60.5mgTris、0.9g的氯化钠、3g的海藻糖溶于100mL蒸馏水中，再加入10mL甘油混匀，过滤，装入广口瓶备用。

硝酸纤维素膜的干燥处理，喷涂完荧光抗体线、抗环瓜氨酸肽抗原检测线、羊抗鼠IgG质控线后，将硝酸纤维素膜放在37℃、湿度小于40%的环境下平衡3h。

实施例4：如图1所示，一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测卡，检测卡包括扣合的上盖1和下盖2，所述下盖2上具有凹槽7，所述凹槽7内放置有实施例1～3任一项所述的试纸条。

上盖1上具有加样孔3和检测窗4，加样孔3的位置对应全血过滤垫9所在的位置，使样品能滴加到全血过滤垫9上，检测窗4的位置对应抗环瓜氨酸肽抗原检测线5和羊抗鼠IgG质控线6所在的位置，荧光抗体线13需要避光，被上盖1所遮挡，上盖1和下盖2均为塑料材质。

实施例5：一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试剂盒，包括实施例4所述的检测卡和样本稀释液，所述样本稀释液包括20mM Tris、NaCL 0.1g、酪蛋白0.1g、PEG 0.1g、明胶0.05g、S9 0.1mL、吐温0.1mL、PC300 0.1mL，Tris缓冲液的PH为8.0。

在硝酸纤维素膜上依次包被荧光标记的鼠抗人IgG抗体、检测线包被抗环瓜氨酸肽抗原、质控线包被羊抗鼠IgG抗体，加入待检血清，待检血清中的抗环瓜氨酸肽抗体和与荧光标记的鼠抗人IgG抗体结合，在层析作用下，与检测线处包被的抗环瓜氨酸肽抗原结合，形成复合物，荧光标记的鼠抗人IgG抗体继续迁移至质控线处时，与羊抗鼠IgG抗体结合，形成复合物，通过荧光免疫分析仪，检测抗环瓜氨酸肽抗体的相对含量。

在实际操作检测过程中，用微量加样器吸取1μL血清或2μL全血样本，加入到样本稀释液管中，混匀，即得到待测样本液，吸取75μL待测样本液加入到加样孔中，5～l0min 仪器检测结果，根据仪器显示的数值直接判断结果。

实施例6：一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试剂盒，包括实施例4所述的检测卡和样本稀释液，所述样本稀释液包括100mM Tris、NaCL 1.5g、酪蛋白0.5g、PEG 5g、明胶0.5g、S91mL、吐温1mL、PC300 1mL，Tris缓冲液的PH为8.5。

在硝酸纤维素膜上依次包被荧光标记的鼠抗人IgG抗体、检测线包被抗环瓜氨酸肽抗原、质控线包被羊抗鼠IgG抗体，加入待检血清，待检血清中的抗环瓜氨酸肽抗体和与荧光标记的鼠抗人IgG抗体结合，在层析作用下，与检测线处包被的抗环瓜氨酸肽抗原结合，形成复合物，荧光标记的鼠抗人IgG抗体继续迁移至质控线处时，与羊抗鼠IgG抗体结合，形成复合物，通过荧光免疫分析仪，检测抗环瓜氨酸肽抗体的相对含量。

在实际操作检测过程中，用微量加样器吸取1μL血清或2μL全血样本，加入到样本稀释液管中，混匀，即得到待测样本液，吸取75μL待测样本液加入到加样孔中，5～l0min 仪器检测结果，根据仪器显示的数值直接判断结果。

实施例7：一种抗环瓜氨酸肽抗体的检测试剂盒，包括实施例4所述的检测卡和样本稀释液，所述样本稀释液包括60mM Tris、NaCL 0.8g、酪蛋白0.3g、PEG 2.5g、明胶0.25g、S9 0.5mL、吐温0.5mL、PC300 0.5mL，Tris缓冲液的PH为8.2。

在硝酸纤维素膜上依次包被荧光标记的鼠抗人IgG抗体、检测线包被抗环瓜氨酸肽抗原、质控线包被羊抗鼠IgG抗体，加入待检血清，待检血清中的抗环瓜氨酸肽抗体和与荧光标记的鼠抗人IgG抗体结合，在层析作用下，与检测线处包被的抗环瓜氨酸肽抗原结合，形成复合物，荧光标记的鼠抗人IgG抗体继续迁移至质控线处时，与羊抗鼠IgG抗体结合，形成复合物，通过荧光免疫分析仪，检测抗环瓜氨酸肽抗体的相对含量。

在实际操作检测过程中，用微量加样器吸取1μL血清或2μL全血样本，加入到样本稀释液管中，混匀，即得到待测样本液，吸取75μL待测样本液加入到加样孔中，5～l0min 仪器检测结果，根据仪器显示的数值直接判断结果。

实验数据：

1、质控品数据。

将实施例1-3试纸条用于企业内部质控品（阴性质控品、阳性质控品、最低检出限）进行检测，每个质控品重复3次，检测结果如下表所示。

通过下表对不同企业内部质控品的检测结果可以发现，本发明实施例1、实施例2和实施例3中的试纸条具有较好的检测效果。

2、特异性和敏感性数据。

对比例1是将标记好的荧光抗体经过PBS进行透析分离，实现游离的荧光染料与荧光抗体的分离，其与实施例1上的区别为未通过葡萄糖凝胶柱进行分离纯化。

采用实施例1荧光抗体与对比例1荧光抗体分别对不同样本进行检测，检测结果如下表所示：

通过上表对不同类型的样本的检测结果可以发现，本发明将标记好的荧光抗体经过葡萄糖凝胶柱进行分离纯化，实现游离的荧光染料与荧光抗体的分离，增加了检测结果的特异性及敏感性。

3、荧光相对强度数据。

对比例2牛血清白蛋白未进行热破坏处理，然后进行偶联。将制备好的抗环瓜氨酸肽抗原用抗原包被液分别稀释到0.5、0.6、0.75、1.0mg/ml，以1.0μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的抗原检测线处，用PBS缓冲液将羊抗鼠IgG稀释到1.0mg/ml，以1.0μL/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜相应的质控检测线处。

采用实施例1与对比例2荧光分别对不同企业内部质控品进行检测，查看荧光的相对信号强度，检测结果如下表所示：

通过上表对制备好的抗环瓜氨酸肽抗原进行不同的包被浓度检测荧光相对强度可以发现，先将牛血清白蛋白进行热破坏处理，再与抗环瓜氨酸肽抗原进行偶联，能极大地提高偶联效率；破坏后包被浓度0.5mg/ml与未破坏包被浓度0.75mg/ml的荧光相对强度一致，标记效率提高了50%，节省了原料，降低了生产成本。

4、准确性数据

对比例3与实施例1不同的是：

将荧光抗体用荧光抗体稀释液按照1:10的比例稀释，混匀之后，不喷封闭线，直接以0.5μ L/cm的喷量喷涂于硝酸纤维素膜上。

采用实施例1与对比例3进行37℃加速破坏考察荧光抗体的残留，检测结果如下表所示：

通过上表对检测残留荧光强度可以发现，不喷封闭液直接固相荧光抗体，随着37℃破坏时间的延长，荧光抗体残留逐渐增多，剩下参与反应的荧光逐渐减少，对结果有很大的影响。根据阿伦尼乌斯公式：d(In k)/dT=Ea/RT2 Ea， 37℃破坏6个月相当于常温下保存2年；本发明试剂盒先喷封闭液再喷荧光抗体，在试剂盒的有效期2年内，荧光抗体的残留很少且不随破坏时间的延长而增加，对检测结果无任何影响，保证了试剂盒的准确性。

5、抗环瓜氨酸肽抗体干式免疫荧光层析法检测试剂盒的线性范围。

对偶联载体大分子物质牛血清白蛋白进行热破坏处理，然后将其与抗环瓜氨酸肽抗原进行偶联，用实施例2所述方法制备检测板。将接近线性范围上限的抗环瓜氨酸肽的高浓度样本(640RΜ/ml)，用阴性血清倍比稀释到1024倍，共配制成10个不同浓度的溶液，每浓度重复测定3次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程为y=0.9998x+0.0249，相关系数为R

6、抗环瓜氨酸肽抗体干式免疫荧光层析法检测试剂盒稳定性实验考察。

将本发明所述试剂盒置于37℃温度下进行破坏性试验，考察周期6个月，分别于第1天、第3天、第7天、第10天、第15天、1个月、45天、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月考察试剂盒稳定性，标准如下：

（1）稀释液物理状态

外观：无色透明澄清液体，无颗粒、絮状物、沉淀。

（2） 性能指标

阴性符合率：用阴性参考品N1-N3进行检测，结果应均为阴性（阴性符合率：3/3）。

阳性符合率：用阳性参考品P1-P5进行检测，结果应均为阳性（阳性符合率：5/5）。

最低检出限：用最低检出限参考品S进行检测，结果应为阳性。

重复性：阴性参考品、阳性参考品、最低检出限从第1天～6个月的结果变异系数应均不大于15%。

试剂盒稳定性考察结果如下：

样本稀释液物理状态稳定性结果

试剂盒 37℃加速破坏实验结果

注：阴性参考品浓度≤10RΜ/ml，阳性参考品浓度＞10RΜ/ml。

经试验在37℃可稳定至少半年。根据阿伦尼乌斯公式：d(In k)/dT=Ea/RT2 Ea，37℃破坏6个月相当于常温下保存2年，可满足医院诊所及卫生检疫部门的临床需求，也可用于大专院校和科研机构的疾病诊断研究。

7、抗环瓜氨酸肽抗体干式免疫荧光层析法检测试剂盒与上市公司上海科新酶免法检测试剂盒的符合率。

从临床中收集到300份确诊为RA病人的血清，健康查体血清200份，用抗环瓜氨酸肽抗体干式免疫荧光层析法检测试剂盒与上海科新酶免法检测试剂盒同时检测，特异性、检出率如下表：

不同血清两种试剂盒的特异性、检出率对比

总符合率如下表：

500例样本两种试剂盒的总符合率

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。