CD155在宫颈癌诊治中的应用

摘要

本发明涉及生药医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种CD155在宫颈癌诊治中的应用。本发明首次发现CD155的表达量与宫颈癌的多项分子病理学指标相关，沉默CD155可抑制AKT/mTOR活性和NF‑κB通路并激活自噬和凋亡，并且通过特异性敲除CD155可有效抑制宫颈癌的恶性进展。此外，沉默CD155通过下调CyclinD1和上调P27KIP1抑制细胞周期进程。这些发现表明，CD155可以作为诊治宫颈癌的分子生物标志物，还可以潜在地用作宫颈癌患者的有价值的治疗靶点，因此具有良好的实际应用之价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生药医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种CD155在宫颈癌诊治中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

宫颈癌是女性发病率和死亡率第四高的恶性肿瘤，已经成为威胁女性健康的重要疾患。据报道，女性罹患宫颈癌呈逐年上升趋势，2018年有超过569,000例宫颈癌新增病例和311,000例死亡。宫颈癌是所有癌症中目前唯一明确病因的癌症，人乳头瘤病毒感染(HPV)是宫颈癌的主要原因。尽管已经使用HPV疫苗预防宫颈癌，但是通过大规模接种HPV疫苗有效降低宫颈癌的发病率需要很长时间，在这段时间内，将产生大量新的HPV感染和宫颈癌患者。

CD155，也称为NECL-5，是免疫球蛋白超家族的成员。CD155具有四个剪接亚型，分别定义为α，β，δ和γ。α亚型包含肿瘤细胞内在生物学所必需的基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)。CD155通过ITIM募集酪氨酸磷酸酶2(SHP-2)启动细胞信号转导、细胞粘附、细胞增殖和存活。CD155在许多癌症中呈高表达，其中包括肺腺癌、胰腺癌、卵巢癌、骨髓性白血病、神经母细胞瘤、结直肠癌和胆管癌。然而，CD155在宫颈癌发展中的分子机制尚不清楚。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供CD155在宫颈癌诊治中的应用。本发明研究发现，CD155的表达量与宫颈癌的多项分子病理学指标相关，沉默CD155可抑制AKT/mTOR活性和NF-κB通路并激活自噬和凋亡，并且通过特异性敲除CD155可有效抑制宫颈癌的恶性进展。因此，CD155可作为诊治宫颈癌的分子生物标志物，还可作为宫颈癌的潜在治疗靶点。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供CD155作为诊断标志物在制备宫颈癌诊断或辅助诊断产品中的应用；

其中，所述诊断包括对宫颈癌分化程度的诊断。

本发明第二个方面，提供检测CD155的试剂盒在制备宫颈癌诊断或辅助诊断产品中的应用。

本发明第三个方面，提供一种诊断宫颈癌的产品，所述产品能够通过检测CD155表达水平来诊断宫颈癌或辅助诊断宫颈癌。

本发明第四个方面，提供CD155在制备抑制或激活AKT/mTOR和/或NF-κB通路的产品中的应用。

本发明第五个方面，提供用于降低或提高CD155表达水平的物质在制备产品中的应用。

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(b1)抑制或促进宫颈癌细胞增殖迁移和侵袭，促进或抑制宫颈癌细胞的凋亡；

(b2)促进或抑制宫颈癌细胞的凋亡；

其中，所述产品可以为实验试剂。

本发明第六个方面，提供用于提高或降低CD155表达水平的物质在制备宫颈癌动物模型中的应用。

本发明第七个方面，提供一种产品，其活性成分包括用于降低或提高CD155表达水平的物质；

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(b1)抑制或促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进或抑制宫颈癌细胞的凋亡；

(b2)促进或抑制宫颈癌细胞自噬。

本发明的一个或多个实施方式至少具有以下有益效果：

上述技术方案首次发现CD155的表达量与宫颈癌的多项分子病理学指标相关，沉默CD155可抑制AKT/mTOR活性和NF-κB通路并激活自噬和凋亡，并且通过特异性敲除CD155可有效抑制宫颈癌的恶性进展。此外，沉默CD155通过下调CyclinD1和上调P27KIP1抑制细胞周期进程。这些发现表明，CD155可以作为诊治宫颈癌的分子生物标志物，还可以潜在地用作宫颈癌患者的有价值的治疗靶点，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为CD155在宫颈癌和高级别上皮内肿瘤(HSIL)患者中表达水平图。(A)CD155在健康妇女(n＝17)，HSIL患者(n＝20)和宫颈癌患者(n＝30)血浆中的分布；(B，C)血浆CD155在健康妇女和宫颈癌患者，以及健康妇女和宫颈癌+HSIL患者的受体工作特征(ROC)曲线分析。通过血浆中CD155的表达量计算ROC曲线下的面积(AUC)以诊断HSIL和宫颈癌；(D)在GEO数据库GSE67522，GSE39001和GSE29570中CD155mRNA的表达水平；(E)在宫颈癌组织，HSIL组织和正常宫颈组织中CD155免疫组织化学染色的代表图像；癌组织中Ki67免疫组织化学(IHC)染色的代表性图像(左：X 100，右：X200)；(F)正常宫颈组织(n＝18)，HSIL(n＝20)和宫颈癌(n＝66)的CD155 IHC评分；(G)在宫颈癌中CD155的表达与Ki67的表达显着正相关(r＝0.6608，p＝0.0004)。

图2为CD155影响子宫颈癌细胞的生物学行为图。用NC-CD155，si-CD155，PCMV-NC和PCMV-CD155转染CaSki和HeLa细胞。(A)CCK8分析检测了Hela和CaSki细胞的细胞增殖；(B)在用膜联蛋白Annexin V-APC和7AAD染色后，通过流式细胞术检测凋亡；(C)通过流式细胞术进行细胞周期分析；(D)在CD155过表达或敲低后，使用Transwell测定法评估CaSki和HeLa的侵袭和迁移能力。

图3为CD155对CaSki和HeLa细胞中细胞周期和凋亡相关蛋白表达影响示意图。(A)用NC-CD155，si-CD155，PCMV-NC和PCMV-CD155转染CaSki和HeLa细胞后，通过蛋白质印迹法进行分析CD155，CDK2，CyclinD1，P27KIP1，C-myc，E2F1，Ki67，CL-caspase3，CL-caspase9和CL-PARP的蛋白表达情况。β-actin用作阴性对照；(B)使用Image J对(A)中所示的蛋白质印迹检测带进行定量分析。统计分析使用t检验进行。

图4CD155调节宫颈癌的AKT/mTOR和NF-κB(NF-κB)通路并且激活自噬。(A)在CD155敲低CaSki的细胞中。红色和蓝色分别表示水平升高或降低超过12％的磷酸化蛋白；(B)用CD155 siRNA(si-CD155)，阴性对照RNA(NC-CD155)和PCMV-CD155转染的CaSki和HeLa细胞中LC3B的免疫荧光染色，比例尺：10μm；(C)蛋白印迹分析AKT，p-AKT，mTOR，p-mTOR，p-4EBP1，p-p70S6K，Beclin1，LC3I，LC3II，p-NF-κB，p-IKKα/β，p-IKKγ在NC-CD155，si-CD155，PCMV-NC和PCMV-CD155转染的CaSki中的表达；(D)蛋白印迹分析AKT，p-AKT，mTOR，p-mTOR，p-4EBP1，p-p70S6K，Beclin1，LC3I，LC3II，p-NF-κB，p-IKKα/β，p-IKKγ在NC-CD155，si-CD155，PCMV-NC和PCMV-CD155转染的HeLa中的表达。β-actin用作阴性对照。

图5为AKT敲低逆转了CD155过表达诱导的AKT/mTOR/NF-κB通路激活的抗凋亡作用图。(A)用AKT-siRNA处理过表达CD155的CaSki和HeLa细胞系。Annexin-V-APC和7AAD染色后，通过流式细胞仪检测细胞凋亡。用Flowjo10定量分析CaSki和HeLa细胞中的细胞凋亡率；(B)通过蛋白质印迹检测CD155，p-AKT，p-mTOR，Beclin-1，LC3BI，LCBII，p-IKKγ，p-IKKα/β，CL-caspase9，Ki67的表达。β-actin用作阴性对照。使用Image J定量分析Western印迹法。

图6为CD155过表达促进了子宫颈癌在体内的生长。(A)用PCMV-CD155或PCMV-NC转染的CaSki细胞接种移植瘤肿瘤；(B)PCMV-CD155或PCMV-NC的CaSki细胞接种肿瘤体积；(C)用PCMV-CD155或PCMV-NC转染的形成的肿瘤的重量；(D)移植肿瘤的HE染色(X200)；(E，F)IHC测定法用于检测形成的肿瘤中的Ki67的表达水平(X 200)。

图7为CaSki和HeLa细胞分别转染NC-CD155，si-CD155，PCMV-NC和PCMV-CD155。(A，B)通过蛋白免疫印迹分析CaSki或HeLe细胞中CD155的表达，β-actin用作阴性对照。(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

图8为NC-CD155，si-CD155，PMC-NC，PMV-CD155转染CaSki和HeLa细胞。(A)Annexin-V和7AAD染色后，通过流式细胞术检测凋亡。用Flowjo10定量分析CaSki和HeLa细胞中的细胞凋亡率。(B)显示了通过流式细胞术进行的细胞周期分析和细胞周期的定量分析。(C，D)CaSki和HeLa中CD155敲低或过表达的细胞的侵袭和迁移的定量分析。(数据是平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01)。

图9为NC-CD155，si-CD155，PMC-NC，PMV-CD155转染CaSki和HeLa细胞(A，B)在CaSki和HeLa中含有LC3B点状细胞(>5)的细胞比例。(C，D，E，F)图4C-4D中相对蛋白表达水平的定量分析(*p<0.05，**p<0.01)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

技术人员应理解，术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mRNA来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mRNA)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量PCR、多重连接依赖性探针扩增(Multiplex ligation-dependent probeamplification，MLPA)。

术语指标的水平“上调”、“升高”或“提高”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。

术语指标的水平“下调”、“降低”或“下降”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。

正如背景技术所介绍的，现有技术中目前本领域内针对CD155与宫颈癌关系的研究还较少，关于CD155在宫颈癌细胞中的临床意义以及其功能的潜在机制仍缺乏深入研究。

鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供CD155作为诊断标志物在制备宫颈癌诊断或辅助诊断产品中的应用；

其中，所述诊断包括对宫颈癌分化程度的诊断。

本发明通过研究发现，CD155的表达水平在宫颈癌中显著上调，免疫组化和ELISA(酶联免疫吸附测定)显示CD155的表达随着宫颈病变程度的加重而逐渐升高。因此，CD155可作为一种新的宫颈癌诊断标志物。

本发明的又一具体实施方式中，提供检测CD155的试剂盒在制备宫颈癌诊断或辅助诊断产品中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种诊断宫颈癌的产品，所述产品能够通过检测CD155表达水平来诊断宫颈癌或辅助诊断宫颈癌。

本发明的又一具体实施方式中，CD155在制备抑制或激活AKT/mTO和/或NF-κB通路的产品中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供用于降低或提高CD155表达水平的物质在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(b1)抑制或促进宫颈癌细胞增殖迁移和侵袭，促进或抑制宫颈癌细胞的凋亡；

(b2)促进或抑制宫颈癌细胞的凋亡；

优选的，所述产品为实验试剂。

本发明还发现，降低CD155的表达可在体外和体内抑制宫颈癌细胞增殖，阻止细胞周期从G0/G1到S期，降低细胞活力并抑制肿瘤形成。磷酸化抗体芯片阵列分析表明，敲低CD155的表达可以抑制AKT/mTOR/NF-κB通路并激活自噬和细胞凋亡。因此，CD155可作为一种新的宫颈癌的治疗靶点。

本发明的又一具体实施方式中，降低/提高CD155表达水平的物质可以是包括针对CD155的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，以及实施慢病毒感染或基因敲除的物质；

优选的，所述CD155siRNA序列为5-CCCGUAACGCCAUCAUCUUTT-3(SEQ ID NO.1)；反义5-AAGAUGAUGGCGUUACGGGTT-3(SEQ ID NO.2)。

本发明的又一具体实施方式中，提供用于提高或降低CD155表达水平的物质在制备宫颈癌动物模型中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，其活性成分包括用于降低或提高CD155表达水平的物质；

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(b1)抑制或促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进或抑制宫颈癌细胞的凋亡；

(b2)促进或抑制宫颈癌细胞自噬。

所述产品或物质为药物。

根据本发明，“治疗”的概念表示任一适用于治疗宫颈癌相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

根据本发明，上述药物还包括至少一种药物非活性成分。

所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

本发明的又一具体实施方式中，所述动物模型中的动物可以是非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物或物质施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

本发明所涉及的核酸序列如下表所示：

实施例

1、材料和方法

1.1人体组织样本

收集了70份血清样本，包括31例宫颈癌，21例HSIL和18例正常宫颈。此外，还收集了100份石蜡样本，包括66例宫颈癌，16例HSIL和18例正常宫颈。所有患者均按照FIGO指南进行临床分期。临床资料来自齐鲁医院病历管理系统。齐鲁医院伦理委员会批准了本研究。

1.2免疫组织化学

免疫组织化学按照免疫组织化学检测试剂盒(中山金桥SP-9001)进行。将四微米厚的石蜡切片去蜡，并与CD155抗体在4℃孵育过夜。将生物素标记的山羊抗兔IgG二抗与切片在37℃下孵育10分钟。将链霉亲和素过氧化物酶与切片在37℃下孵育15分钟，然后进行DAB染色。苏木精染色切片5分钟。脱水后，用中性胶密封切片。阳性细胞密度的百分比分为五个级别：0-3％[0]，3-25％[1]，26-50％[2]，51-75％[3]和76-100％[4]。阳性细胞的染色强度也分为四个级别：阴性[0]，弱阳性[1]，中等阳性[2]和强阳性[3]。然后计算免疫组织化学评分：免疫反应评分(IRS)＝强度评分×阳性评分。最终的IRS分为四组：0-1，不表达；2-3，轻度阳性表达；4-7，中度阳性表达，8-12，强阳性表达(16)。根据IRS，我们将宫颈癌患者分为低CD155表达组(IRS<7)和高CD155表达组(IRS>7)。

1.3免疫荧光染色

用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞3次，并用4％多聚甲醛固定15分钟。在37℃下用BSA封闭30分钟。用PBS洗涤3次后，于4℃下孵育LC3B抗体过夜。然后在黑暗中37℃孵育山羊抗兔二抗。DAPI将细胞复染1小时后，在共聚焦荧光显微镜下分析LC3B自噬斑的数量。

1.4细胞系和细胞培养

CaSki和HeLa细胞系购自山东大学妇科肿瘤中心实验室(中国济南)。CaSki和Hela分别在补充有10％胎牛血清的RPMI1640和DMEM中培养。所有细胞均在37℃，5％CO2的培养箱中培养。

1.5小干扰RNA(RNAi)

Gene Pharma合成特定的siRNA和阴性对照siRNA。CD155 siRNA序列5-CCCGUAACGCCAUCAUCUUTT-3(SEQ ID NO.1)；反义5-AAGAUGAUGGCGUUACGGGTT-3(SEQ IDNO.2)。AKT siRNA序列5-GCACUUUCGGCAAGGUGAUTT-3(SEQ ID NO.3)；反义5-AUCACCUUGCCGAAAGUGC-TT-3(SEQ ID NO.4)。对照NC-RNA序列5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3(SEQ ID NO.5)；反义5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3(SEQ ID NO.6)。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂进行siRNA转染。

1.6CD155过表达载体的构建和转染

质粒购自上海和元生物。我们使用慢病毒载体PGLVH1-Puro来提高转染效率。慢病毒感染细胞后48小时，用嘌呤霉素筛选稳定过表达CD155的细胞系。

1.7 ELISA测定

CD155的血清样品在-80℃下冷冻。ELISA试剂盒购自Biorbyt公司。按照说明进行操作。

1.8蛋白免疫印迹

用PBS洗涤细胞3次，然后使用免疫沉淀分析缓冲液(RIPA，1％苯基甲基磺酰氟(PMSF)；1％NaF)在冰上裂解30分钟。在4℃下以12,000rpm离心细胞裂解液10分钟。通过SDS-PAGE分离蛋白质并将其转移至PVDF膜，将PVDF膜与一抗孵育过夜，然后与适当的二抗孵育，最后使用化学发光进行检测。

1.9细胞增殖测定

使用细胞计数试剂盒(CCK-8)评估细胞活力，将3x10

1.10流式细胞仪

用预冷的PBS洗涤细胞两次，然后在4℃的75％酒精中固定过夜。用PI重悬细胞并孵育30min,通过FACS Calibur流式细胞仪检测细胞周期分布.我们使用细胞凋亡试剂盒(62700-80，Biogems)来检测细胞凋亡。按照说明进行操作。所有结果均使用Flowjo10进行分析。

1.11 Transwell迁移和侵袭分析

将细胞消化后，重悬细胞于200μl无血清1640和DMEM中，然后在不存在或存在100μl Matrigel的情况下，将细胞接种到Transwell的上腔室。将具有20％FBS的培养基作为化学吸引剂添加到下腔室中。16小时后，用结晶紫染色从上室穿至下室的细胞。在显微镜下，随机选取三个视野的细胞进行计算(放大倍数，x200)。

1.12磷酸化抗体阵列的癌症信号转导分析

癌症信号磷酸抗体微阵列CSP100 plus由Full Moon Biosystems设计和制造，包含304种抗体。每种抗体都有六份重复样本以及多个阳性和阴性对照，并将这些样品印在带涂层的玻璃显微镜载玻片上。根据他们的设计方案进行实验。

1.13裸鼠肿瘤形成实验

使用了12只无特定病原体的SPF级雌性裸鼠(18-22g，4-6周龄)，并得到山东大学动物研究所的批准。我们将裸鼠随机分为PCMV-CD155组和NC-CD155组，每组六只。用胰蛋白酶消化细胞，用PBS洗涤3次，并重悬于PBS中。将200μl(1×10

1.14统计分析

所有实验均独立重复至少3次。我们使用GraphPad Prism 7.0(进行数据处理和统计分析。使用χ2检验分析CD155的表达水平与临床病理参数之间的关系。当数据呈正态分布时，使用t检验来分析两个独立组之间的统计比较，但是当数据不符合正态分布时，则使用非参数检验。结果显示为平均值±标准偏差(SD)。P＜0.05认为有显著差异。

2.结果

2.1 CD155在宫颈癌组织中高表达，其表达与宫颈癌的分化程度及Ki67的表达相关

为了检测血浆中CD155的表达，我们使用ELISA检测了17名健康女性，20例HSIL患者和30例宫颈癌患者血浆中CD155的表达水平。我们的结果表明，CD155在宫颈癌和高度鳞状上皮内病变(HSIL)患者中明显升高(图1A)。在此基础上，我们评估了CD155在宫颈癌和HSIL中的诊断意义。CD155在宫颈癌患者中具有很高的诊断价值，曲线下面积(AUC)为0.727，灵敏度为0.63，特异性为0.76(图1B)。同时，我们将正常组与HSIL+进行了比较。ROC分析显示，用于诊断HSIL+的CD155的AUC为0.769，敏感性为0.6，特异性为0.88(图1C)。然后，我们从GEO下载了包括宫颈癌组织和正常宫颈组织样本的基因表达数据，并使用“limma”软件包分析了CD155在mRNA水平的表达。与ELISA结果一致，子宫颈癌中CD155转录组的表达水平高于正常子宫颈组织中的表达水平(图1D)。为了进一步检查CD155在宫颈癌进展中的作用，通过IHC检测了CD155蛋白在宫颈癌(n＝66)，HSIL(n＝20)和正常子宫颈(n＝18)中的表达。结果表明，CD155在宫颈癌中的免疫染色强度显着高于HSIL和正常宫颈上皮细胞。而且，HSIL中CD155的表达高于正常的宫颈上皮细胞，代表性的图像显示在(图1E，F)中。临床病理特征分析表明，CD155表达与子宫颈癌的低分化有关(表1)。此外，我们在宫颈癌组织(n＝30)上进行了Ki67 IHC染色，分析结果表明宫颈癌中Ki67的表达与CD155正相关(图1G)。

*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。

2.2 CD155调节子宫颈癌细胞的增殖和凋亡

通过在CaSki和HeLa中转染siCD155和PCMV-CD155来下调或上调CD155。与对照组相比，CaSki和HeLa中蛋白质水平的沉默或过表达效率均高于60％(图7A，B)。通过CCK-8测定法检测CD155对子宫颈癌细胞增殖的影响。数据显示，沉默CD155可显着降低HeLa和CaSki细胞的细胞增殖率。另一方面，当两种细胞系上调CD155时，细胞增殖均显着增加(图2A)。流式细胞仪用于检测CD155是否与细胞凋亡相关。用siCD155转染Caski和HeLa细胞48小时后，敲除组凋亡率与NC组相比有明显的增加(图2B)，用Flowjo10定量分析CaSki和HeLa细胞的凋亡率(图8A)。此外，流式细胞术检测细胞周期实验表明，沉默CD155后，CaSki和HeLa细胞的数量在G0/G1期增加，而在S期减少，反之亦然(图2C)，细胞周期进行定量分析(图8B)。我们的实验还证明，沉默CD155组中CaSki和HeLa细胞的迁移和侵袭数量显着减少，而过表达CD155组中的细胞迁移和侵袭数量则显着增加(图2D)。细胞数量进行定量分析(图8C，2D)。

2.3 CD155对细胞周期和凋亡相关蛋白表达的影响

通过蛋白质免疫印迹分析了CD155与细胞增殖，凋亡和细胞周期相关蛋白的蛋白表达情况。与对照组相比，沉默CD155可以减少HeLa和CaSki细胞中与细胞周期相关蛋白CDK2，CyclinD1，C-myc的下调和P27KIP1的上调。此外，在CD155沉默组增殖相关蛋白E2F1，Ki67的表达降低，凋亡相关蛋白CL-PARP，CL-Caspase-3和CL-Caspase-9上调。但是，当CD155在CaSki和HeLa中过表达时，这些蛋白的表达水平出现相反的结果(图3A，B)。

2.4 CD155调节子宫颈癌的AKT/mTOR和NF-κB(NF-κB)通路并且激活自噬

为了探讨CD155在宫颈癌进展中的分子机制，我们使用了磷酸化抗体阵列对16条癌症相关通路中的300多个分子进行筛选。我们发现在沉默CD155后，AKT/mTOR和NF-κB相关通路分子的表达差异最明显(图4A)。因此，CD155对宫颈癌细胞中AKT/mTOR和NF-κB的机制研究是我们下一步工作重点。蛋白免疫印迹显示沉默的CD155的CaSki和HeLa细胞中LC3BII/LC3BI比值和Beclin1的表达增加。但是，PCMV-CD155CaSki和PCMV-CD155 HeLa细胞中的LC3BII/LC3BI比值和Beclin1表达显著降低(图4C)。与蛋白质免疫印迹结果一致，免疫荧光分析表明，在用CD155 siRNA转染的细胞中，含LC3B自噬斑块的细胞比例增加(>3)，而在用PCMV-CD155转染的细胞中LC3B自噬斑块比例降低(图4B),定量分析LCB自噬斑块(图9A，B)。以上结果表明，CD155的敲低显著增强了CaSki和HeLa细胞的自噬，而CD155的过表达则相反。为了确定CD155是否调节宫颈癌细胞中的AKT/mTOR途径，我们检测了AKT/mTOR途径中的关键分子AKT，p-AKT，mTOR和p-mTOR，p-4EBP1，p-P70S6K的表达。蛋白免疫印迹结果表明，在沉默CD155的CaSki和HeLa细胞中，AKT和mTOR的总表达没有明显变化，但p-AKT，p-mTOR，p-4EBP1和p-P70S6K的表达明显降低。但是，在PCMV-CD155 CaSki和PCMV-CD155 HeLa细胞中，p-AKT，p-mTOR，p-4EBP1和p-P70S6K的表达显着增加。这些结果表明，CD155调节宫颈癌细胞中的AKT/mTOR信号传导途径并激活自噬(图4C,D)。然后我们检测了NF-κB相关通路蛋白在宫颈癌细胞系中的表达。如图4C所示，沉默子宫颈癌细胞系中的CD155可以下调NF-κB相关蛋白(如p-NF-κBP65，p-IKKα/β和p-IKKγ)的表达。过表达CD155则具有相反的结果，定量计算相对蛋白的表达(图9C,D,E,F)。

2.5沉默AKT可逆转CD155过表达诱导的AKT/mTOR/NF-κB通路的激活和抗凋亡作用

为了进一步检查CD155的抗凋亡作用是否通过AKT/mTOR和AKT/NF-κB信号通路激活而实现，以AKT为靶点的siRNA在过表达CD155的细胞中进行挽救实验。siAKT转染后48小时，检测到细胞自噬蛋白变化，细胞凋亡和细胞增殖。因为我们以前的研究结果表明p-AKT在CD155促进宫颈癌进展的机制中起作用，所以我们检测p-AKT而不是AKT的表达。蛋白免疫印迹实验结果表明，siAKT转染细胞后，将近70％的p-AKT基因表达被抑制。流式细胞仪和蛋白质印迹检测结果显示，PCMV-CD155CaSki和PCMV-CD155 HeLa细胞中p-AKT的下调可以增加PCMV-CD155CaSki和PCMV-CD155 HeLa的凋亡(图5A)。敲低p-AKT也可以显著下调PCMV-CD155CaSki和PCMV-CD155 HeLa的p-mTOR，p-IKKα/β和p-IKKγ的表达，自噬蛋白Beclin-1，LC3BII/LC3BI的比例明显增加。同时，敲低p-AKT还可以增加PCMV-CD155CaSki和PCMV-CD155 HeLa中的CL-caspase9的表达，抑制Ki67的表达(图5B)。

2.6 CD155促进宫颈癌裸鼠移植瘤的生长

为了进一步验证CD155对宫颈癌细胞增殖的影响，我们使用CaSki细胞构建了PCMV-NC和PCMV-CD155过表达的裸鼠模型。体内实验表明，PCMV-CD155细胞组的肿瘤重量和体积显著高于PCMV-NC细胞组的肿瘤重量和体积(图6A，B，C)。HE染色裸鼠移植肿瘤组织(图6D)。通过免疫组织化学在裸鼠移植小鼠组织中评估了Ki67的表达。CD155过表达细胞形成的肿瘤组织中Ki67的染色也明显强于对照组(图6E，F)。以上结果表明，CD155的过表达可以显着促进宫颈癌裸鼠移植瘤的生长。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110> 山东大学齐鲁医院

<120> CD155在宫颈癌诊治中的应用

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