相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年7月18日提交的美国临时专利申请号62/700,084、和于2018年7月20日提交的美国临时专利申请号62/701,146、以及于2018年8月17日提交的美国临时专利申请号62/719,230、和于2019年5月7日提交的62/844,260的优先权利益。所述前述申请各自的公开内容在此。
技术领域
本公开内容涉及用于抗微生物剂敏感性测试和微生物鉴定的方法。
背景技术
抗微生物剂抗性的微生物感染与不良临床结果(包括受感染患者中的发病率、死亡率和健康护理成本增加)相关。在过去的30年中，这些生物在美国的流行率稳步增加。微生物的表型抗微生物剂敏感性测试(AST)对于告知医师适当的治疗方案至关重要。使用目前方法，AST测定一般需要最少8小时，由于许多临床微生物学实验室中的轮班工作而使其成为过夜过程。在等待来自目前AST方法的测定的同时，患者经常被施用广谱抗微生物剂，其经常对患者健康具有显著的不利作用和/或促成正在增加的抗微生物剂抗性流行。此外，获得准确的抗微生物治疗信息的这种时间延迟增加患者在医院中的停留，从而增加患者的成本和不便。
在这种背景下，政府和行业利益相关者已提议了促进医院中的抗微生物剂管理的规定。然而，由于目前AST方法和抗微生物剂处方实践的局限性，抗微生物剂管理努力可能变得很复杂。本发明人先前已公开了用于快速AST的方法，其可以减少AST测定所需的时间并促进抗微生物剂管理。例如，共同拥有的美国专利号9,834,808中描述了利用结合微生物表面的荧光探针的AST系统和方法。这些系统和方法的优点在于，它们以经济有效的方式解决了这个需求，并且可以与现有的测定硬件组件兼容。
在其中样品包含多于一个微生物物种的情况下，AST结果可能是复杂的，因为结果很可能受对样品中最快速生长的物种的抗微生物作用所支配，所述最快速生长的物种可能是或可能不是负责感染的物种。这在当前的AST实践中使用“纯度平板”得到解决，所述纯度平板通常是分离且鉴定各个细菌菌落的固相培养物。由于培养且分析菌落通常需要至少18个小时，并且一些临床实验室直到获得纯度平板结果才报告AST结果，因此纯度平板的使用可能导致AST工作流延迟，并且因而导致对患者的靶向疗法递送延迟。
发明内容
本公开内容提供了改善的快速AST系统和方法，其中加速了微生物物种和菌株的分离和鉴定，潜在地减少了来自患者样品的AST结果交付所需的时间。在一个方面，本公开内容涉及用于评价样品中的多个不同微生物物种的方法，例如评价样品是单微生物的还是多微生物的方法。该方法利用包含多种选择性和/或鉴别性生长培养基的选择性/鉴别性生长板(selective/differential growth panel, SDGP)，所述SDGP被接种且在适合于微生物生长的条件下孵育。这种方法可以包括用样品接种选择性/鉴别性生长板(SDGP)，该SDGP包含第一生长培养基和第二生长培养基，其中(a)所述第一生长培养基和第二生长培养基是鉴别性或选择性生长培养基，(b)每种选择性生长培养基包含(i)适合于促进微生物子集生长的一种或多种化合物、和/或(ii)抑制微生物子集生长的一种或多种化合物，(c)每种鉴别性生长培养基包含由一组微生物表达的酶的底物，和(d)其中由酶催化的底物的反应产生反应产物。SDGP可以在适合于微生物生长的条件下进行孵育。可以从SDGP的第一选择性生长培养基和第二选择性生长培养基各自中选择第一子样品和第二子样品。对于每个子样品或菌落，可以执行至少一种测定，以检测选择性生长培养基、底物和反应产物中存在的一种或多种微生物。对于每个子样品，基于微生物、底物和/或反应产物的检测，可以鉴定子样品中存在的微生物物种。可以比较每个子样品中存在的微生物物种组，以确定样品是单微生物的还是多微生物的，并且任选地，可以向用户报告该样品是单微生物的或多微生物的。
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括向用户报告至少一个子样品中存在的微生物物种。选择性或鉴别性生长培养基中的至少一种可以包含免疫球蛋白-G(IgG)或其片段。IgG或其片段可以包含一种或多种光学标记。该方法可以进一步包括执行凝固酶测定，并且基于凝固酶测定的结果以及来自选择性和/或鉴别性培养基的结果，确定样品是单微生物的还是多微生物的。SDGP可以包括最少4、6、8、10、12、14、16、18、20个储库。SDGP上的一个或多个储库可以包含非选择性培养基。如果对样品执行的革兰氏染色呈阳性，则可以使用第一SDGP，并且如果革兰氏染色呈阴性，则可以使用第二SDGP。至少一个SDGP储库可以包含至少一种探针化合物。探针化合物可以包括但不限于表面结合剂、锁核酸、肽核酸、其它荧光原位杂交探针。探针可以包含一种或多种光学标记。鉴定微生物的测定可以包括生成关于第一子样品和第二子样品的质谱，并且将质谱与关于微生物的标准质谱的一个或多个文库进行比较。生成质谱的步骤可以利用下述中的一种或多种：飞行时间(TOF)检测器、作为质量分析仪的静电和/或磁性扇区、四极杆质量分析仪和离子阱。生成质谱的步骤可以利用下述电离源中的一种或多种：化学电离、等离子体和辉光放电、电子碰撞、电喷雾电离、解吸电喷雾电离、快速原子轰击、场电离、激光电离、液体萃取表面分析、基质辅助激光解吸电离。生成质谱的步骤可以包括：将来自SDGP的孔储库的子样品点样到用于基质辅助激光解吸电离TOF质谱法(MALDI-TOF)的平板上，并且执行MALDI-TOF，从而生成质谱。点样和MALDI-TOF可以通过自动化或半自动化仪器来执行。质谱的分析可以反映微生物的蛋白质和/或糖脂。质谱分析可以包括成像。可以通过质谱法鉴定一个或多个SDGP储库中包含的一种或多种探针化合物。微生物可以在点样到MALDI-TOF靶上之前进行浓缩。微生物可以在点样到MALDI-TOF靶上之前通过离心进行浓缩。微生物可以在点样到MALDI-TOF靶上之前浓缩成沉淀。在点样到MALDI-TOF靶上之前，可以执行一个或多个洗涤步骤。可以执行SDGP储库的一种或多种光学测量，包括吸光度、荧光、发光、时间门控发光。可以在洗涤之前和/或洗涤之后执行一种或多种光学测量。在执行MALDI-TOF之前，可以在第一选择性/鉴别性生长培养基或第二选择性/鉴别性生长培养基中执行一种或多种生物化学测定。MALDI-TOF可以用于确定一种或多种抗性标记物的存在。可以从衍生自非选择性培养基和/或包含抗微生物剂的培养基的微生物确定抗性标记物。生成质谱的步骤可以包括在质谱法之前，利用用于样品分离的气相色谱仪和/或液相色谱仪。微生物物种可以是细菌、真菌、原生动物和/或古细菌。微生物物种可以进一步包含下述中的一种或多种：埃希氏菌属物种(Escherichiaspp.)、肠球菌属物种(Enterococcus spp.)、葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp.)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp.)、不动杆菌属物种(Acinetobacter spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、肠杆菌属物种(Enterobacter spp.)、链球菌属物种(Streptococcus spp.)、变形杆菌属物种(Proteus spp.)、柠檬酸杆菌属物种(Citrobacter spp.)、摩根菌属物种(Morganella spp.)、气球菌属物种(Aerococcusspp.)、气单胞菌属物种(Aeromonas spp.)、无色杆菌属物种(Achromobacter spp.)、放线菌属物种(Actinomyces spp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、巴尔通体属物种(Bartonella spp.)、博德特菌属物种(Bordetella spp.)、布鲁氏菌属物种(Brucellaspp.)、伯克霍尔德菌属物种(Burkholderia spp.)、弯曲杆菌属物种(Campylobacterspp.)、衣原体属物种(Chlamydia spp.)、嗜衣体属物种(Chlamydophila spp.)、梭菌属物种(Clostridium spp.)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp.)、埃立克体属物种(Ehrlichia spp.)、弗朗西斯菌属物种(Francisella spp.)、加德纳氏菌属物种(Gardenerella spp.)、嗜血杆菌属物种(Haemophilius spp.)、幽门螺杆菌属物种(Helicobacter spp.)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)、军团菌属物种(Legionellaspp.)、钩端螺旋体属物种(Leptospira spp.)、李斯特菌属物种(Listeria spp.)、分枝杆菌属物种(Mycobacterium spp.)、支原体属物种(Mycoplasma spp.)、奈瑟菌属物种(Neisseria spp.)、诺卡菌属物种(Nocardia spp.)、巴斯德氏菌属物种(Pasteurellaspp.)、普罗威登斯菌属物种(Providencia spp.)、立克次氏体属物种(Rickettsia spp.)、拉乌尔氏菌属物种(Raoultella spp.)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)、沙雷氏菌属物种(Serratia spp.)、志贺氏菌属物种(Shigella spp.)、窄食单胞菌属物种(Stenotrophomonas spp.)、密螺旋体属菌种(Treponema spp.)、脲原体属物种(Ureaplasma spp.)、弧菌属物种(Vibrio spp.)、耶尔森氏菌属物种(Yersinia spp.)及其组合。微生物物种可以包含肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的成员。真菌可以选自假丝酵母属物种(Candida spp.)、伊萨酵母属物种(Issatchenkia spp.)、芽生菌属物种(Blastomyces spp.)、球孢子菌属物种(Coccidioides spp.)、曲霉属物种(Aspergillusspp.)、隐球菌属物种(Cryptococcus spp.)、组织胞浆菌属物种(Histoplasma spp.)、肺囊虫属物种(Pneumocystis spp.)、葡萄状穗霉属物种(Stachybotrys spp.)、孢子丝菌属(Sporothrix)、突脐蠕孢属(Exserohilum)、枝孢菌属(Cladosporium)、癣菌(ringworm)、毛霉菌(mucormycetes)及其组合。
在一些实施方案中，患者样品可以是下述中的一种或多种：血液、尿、脑脊髓液、滑液、吸出物、灌洗液、伤口拭子或呼吸道样品。患者样品可以在接种SDGP之前进行进一步培养。示例性的培养方法包括但不限于血液培养，其它液体培养，固体培养，以及特别地在完全生长之前在其上收集菌落的固体培养平板，其可以被称为“涂抹平板(smudge plate)”。
在一些实施方案中，SDGP包括在单个消耗品上的两个或更多个独立的储库。进一步地，SDGP储库可以用机器人液体处理器(robotic liquid handler)进行接种。另外，机器人液体处理器可以接种SDGP储库以及抗微生物剂敏感性测试(AST)板的一个或多个储库两者。进一步地，SDGP和AST储库可以位于同一消耗品上。在另外一个实施方案中，在消耗品上可以存在两个或更多个SDGP储库，使得可以将两个或更多个患者样品接种到该消耗品内。
在一些实施方案中，测定可以包括在SDGP孵育之后鉴定微生物的核酸序列。测定可以包括对核酸进行测序，使探针与核酸杂交，或对核酸执行酶催化的反应。在SDGP培养基中的微生物孵育可以执行1至10小时、2至8小时、3至7小时、4至6小时。每种选择性培养基可以包含选自以下的一种或多种培养基：链球菌富集肉汤、Fraser肉汤、Giolitti Cantoni肉汤、粪链球菌(Streptococcus faecalis)培养基、月桂基硫酸钠、亚碲酸盐和表1中列出的那些培养基。SDGP的每个鉴别性储库可以包括包含以下的一种或多种培养基：吲哚、甲基红、Voges-Proskauer(VP)、柠檬酸盐利用(CRT)和选择性糖发酵测试[例如葡萄糖(MRG)、纤维二糖(MRC)、乳糖(MRL)、甘露醇(MRMTL)、甘露糖(MRMNS)、棉子糖(MRR)、蔗糖(MRSU)、海藻糖(MRT)、木糖(MRX)、卫矛醇(MRD)、阿东糖醇(MRAD)、肌醇(MRI)、山梨糖醇(MRSOR)、阿拉伯糖(MRARB)、麦芽糖、α-甲基-D-葡萄糖苷(MRAMG)、赤藓糖醇(MRE)、蜜二糖(MRMEL)、阿拉伯糖醇、甘油(MRGLY)和/或粘酸盐(MRMUC)发酵]、柠檬酸盐还原测试(CRT)；苯丙氨酸脱氨酶测试(PHD)；伴随或不伴随硫化氢检测的三糖铁；脲酶测试；使用赖氨酸(DCL)、鸟氨酸(DCO)、精氨酸(DCA)的脱羧测试；丙二酸盐、乙酸盐和/或酒石酸盐的利用；明胶水解测试；七叶苷水解测试；脂酶测试；DNA酶测试；氰化钾(KCN)中的生长；用新生物素(novobiotin)的生长测试；凝固酶测试(COAG)；氨基酸的脱羧；葡糖醛酸酶活性(GUS)；β-半乳糖苷酶活性；固有荧光；七叶苷水解；色氨酸水解等。SDGP可以包含液体培养基。SDGP可以包含固体培养基。SDGP可以包含液体培养基和固体培养基。鉴定可能报告至物种、属、科水平。可能报告革兰氏类型。可能报告一种或多种抗性标记物。可能报告对一种或多种抗微生物剂的抗性。
在一些实施方案中，选择性和/或鉴别性生长培养基中的至少一种包含免疫球蛋白-G(IgG)或其片段，并且执行至少一种测定以鉴定菌落或子样品中的反应产物的步骤包括：检测IgG或其片段的至少一种信号特征的存在或不存在。
在一些实施方案中，其中执行一种或多种凝固酶测定，并且将这一种或多种测定的结果连同来自选择性和/或鉴别性培养基的结果一起利用，以确定样品是单微生物的还是多微生物的。
在各个实施方案中使用的测定包括质谱法，例如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)和/或扩增核酸序列，使探针与核酸杂交，或对来自菌落或样品的核酸进行测序。当使用质谱法测定时，该方法任选地包括以下中的一种或多种：(a)将来自SDGP孔的微生物沉淀或液体点样到MALDI-TOF平板上，并且执行MALDI-TOF，(b)使用自动化/半自动化仪器执行MALDI-TOF，和/或在执行MALDI-TOF之前，在选择性培养基中执行一种或多种生物化学测定。该方法任选地包括在点样到MALDI-TOF靶上之前，将微生物浓缩。该方法进一步任选地包括在点样到MALDI-TOF靶上之前，将微生物浓缩成沉淀。
在各个实施方案中使用的测定可以进一步包括生成关于第一子样品和第二子样品的质谱，并且将质谱与关于微生物的标准质谱的一个或多个文库进行比较。其它实施方案可以进一步包括在质谱法之前，利用用于样品分离的气相色谱仪和/或液相色谱仪来生成质谱。
在其它实施方案中，可以在执行MALDI-TOF之前，在第一SDGP或第二SDGP中执行一种或多种生物化学测定。
继续本公开内容的这个方面，在一些实施方案中，SDGP是多孔平板(例如48、96或384孔平板)，并且该平板的多个孔包含不同的选择性培养基，例如在本文表1中列出的那些培养基。方法还任选地包括对样品执行抗微生物剂敏感性测试(AST)，并且如果样品未标记为多微生物的(即，确定为单微生物的)，则发布鉴定和AST的结果。在一些实施方案中，SDGP是包含以固体形式的多种选择性培养基的平板，在这种情况下，选择子样品或菌落的步骤可以包括获取SDGP的图像，鉴定图像中的微生物菌落，并且使微生物菌落与器具接触，从而将菌落的至少一部分剥离固体培养基(例如，用于点样到MALDI-TOF平板上)。在一些实施方案中，器具是拭子。在根据本发明的这个方面的各个实施方案中，任选地利用生长对照孔，其包含用样品接种的非选择性培养基。生长在孵育后的生长对照孔中进行评价并与预定阈值进行比较：如果生长水平达到或超过阈值，则选择菌落或子样品，然后继续进行该方法；如果生长水平低于阈值，则使SDGP进一步孵育，并且任选地再次检查生长对照孔中的生长水平，直至达到阈值。
在另一个方面，本公开内容涉及选择性/鉴别性生长板(SDGP)，其包括多个流体储库，每个流体储库包含多种不同的选择性生长培养基之一。SDGP任选地包括包含非选择性培养基的至少一个液体储库和/或AST板，其包括限定了关于多种抗微生物剂的稀释系列的第二多个液体储库。
在另一个方面，本公开内容涉及用于执行微生物鉴定(ID)测试顺序的方法，其包括如关于本公开内容的其它方面所述的，用样品接种SDGP，然后将SDGP加载到自动化系统内，用于执行ID测试顺序，并且操作系统以使SDGP孵育且搅动，将来自SDGP多个孔各自的液体培养物或微生物沉淀的一部分点样到MALDI-TOF平板上，添加基质溶液和溶剂，并且执行MALDI-TOF，以对于多个孔各自生成质谱。在一些情况下，在MALDI靶点样之前将SDGP离心，以在多个孔各自中形成微生物沉淀。如上文在本公开内容的其它方面中所述，SDGP可以包括限定了关于多种抗微生物剂的多个稀释系列的AST板，以及缺乏抗微生物剂并包含非选择性生长培养基的至少一个生长对照孔。在这些情况下，该方法还任选地包括下述步骤：在使SDGP孵育并搅动预定时期后，评价至少一个生长对照孔中的微生物生长水平；并且如果微生物生长超过预定阈值，则对多个稀释系列各自执行至少一种终点测定，并且鉴定关于多种抗微生物剂中的至少一种的最小抑菌浓度。
在又另外一个方面，本发明涉及用于评价患者是否为多微生物的系统，其中所述系统确定并报告物种鉴定。
在根据本公开内容的这个方面的一个实施方案中，选择性和/或鉴别性生长培养基中的至少一种包含IgG或其片段，并且检测模块被配置为检测IgG或其片段的至少一种信号特征。
在另一个实施方案中，执行一种或多种凝固酶测定，并且将这一种或多种测定的结果连同来自选择性和/或鉴别性培养基的结果一起利用，以确定样品是单微生物的还是多微生物的。
在另一个实施方案中，关于底物和/或反应产物的信息包含质谱，并且处理器被配置为将质谱与关于微生物的标准质谱的一个或多个文库进行比较。
在又另外一个实施方案中，生成质谱的步骤可以利用飞行时间(TOF)检测器、作为质量分析仪的静电和/或磁性扇区、四极杆质量分析仪或离子阱。该系统进一步包含通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)，以及MALDI-TOF的执行生成的质谱。该系统进一步包括自动化仪器，其(a)将来自每种鉴别性生长培养基的材料沉积到用于MALDI-TOF的平板上，并且(b)执行MALDI-TOF。该系统的进一步实施方案包括其中在执行MALDI-TOF之前，在第一鉴别性生长培养基或第二鉴别性生长培养基中执行一种或多种生物化学测定的那些实施方案。
在另一个实施方案中，生成质谱的步骤可以利用下述电离源中的一种或多种：化学电离、等离子体和辉光放电、电子碰撞、电喷雾电离、快速原子轰击、场电离、激光电离或基质辅助激光解吸电离。
在另一个方面，本公开内容描述了用于评价患者样品是否为多微生物的系统。该系统可以包括选择性/鉴别性生长板(SDGP)，其包含用于用衍生自患者的样品接种的第一选择性和/或鉴别性生长培养基和第二选择性和/或鉴别性生长培养基，其中(a)每种选择性生长培养基包含适合于促进微生物子集生长的一种或多种化合物，(b)每种选择性生长培养基包含抑制微生物子集生长的一种或多种化合物，(c)每种鉴别性生长培养基包含由一组微生物表达的酶的底物，和(d)其中由酶催化的底物的反应产生反应产物，以及处理器，其被配置为(1)从检测模块接受来自每种选择性/鉴别性生长培养基的关于微生物、底物和/或反应产物的信息，并基于该信息确定每种培养基中的一个或多个微生物物种的存在，并且(2)比较对每种选择性和/或鉴别性生长培养基分配的微生物物种，并且(3)如果仅鉴定了单个物种，则报告其鉴定，或者如果鉴定了两组或更多组物种，则将该样品标记为多微生物的，并且任选地报告该鉴定。
在一些实施方案中，系统确定并报告物种鉴定。选择性和/或鉴别性生长培养基中的至少一种可以包含标记的或结合的IgG或其片段，并且检测模块被配置为检测标记的或结合的IgG或其片段的至少一种信号特征。可以执行一种或多种凝固酶测定，并且可以将这一种或多种测定的结果连同来自选择性和/或鉴别性培养基的结果一起利用，以确定样品是单微生物的还是多微生物的。关于底物和/或反应产物的信息可以包含质谱，并且处理器可以被配置为将质谱与关于微生物的标准质谱的一个或多个文库进行比较。生成质谱的步骤可以利用下述中的一种或多种：飞行时间(TOF)检测器、作为质量分析仪的静电和/或磁性扇区、四极杆质量分析仪和离子阱。生成质谱的步骤可以利用下述电离源中的一种或多种：化学电离、等离子体和辉光放电、电子碰撞、电喷雾电离、快速原子轰击、场电离、激光电离、基质辅助激光解吸电离。质谱可以通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)，以及MALDI-TOF的执行来生成。该系统可以进一步包括自动化仪器，其(a)将来自每种鉴别性生长培养基的材料沉积到用于MALDI-TOF的平板上，并且(b)执行MALDI-TOF。可以在执行MALDI-TOF之前，在第一鉴别性生长培养基或第二鉴别性生长培养基中执行一种或多种生物化学测定。患者样品可以是下述中的一种或多种：血液、尿、脑脊髓液、滑液、吸出物、灌洗液、伤口拭子或呼吸道样品。患者样品可以在选择性/鉴别性生长板(SDGP)制备之前进行培养。SDGP可以包括在单个消耗品上的两个或更多个储库。SDGP储库可以用机器人液体处理器进行接种。机器人液体处理器可以接种SDGP储库以及抗微生物剂敏感性测试(AST)板的一个或多个储库两者。两个或更多个储库可以包括SDGP和AST储库。在消耗品上可以存在两个或更多个相同的SDGP储库，使得可以将两个或更多个患者样品接种到消耗品内。选择性或鉴别性生长培养基中的至少一种可以包含免疫球蛋白-G(IgG)或其片段。IgG或其片段可以包含一种或多种光学标记。该系统可以被配置为执行凝固酶测定，并且基于凝固酶测定的结果以及来自选择性和/或鉴别性培养基的结果，该系统可以被配置为确定样品是单微生物的还是多微生物的。SDGP可以包括最少4、6、8、10、12、14、16、18、20个储库。SDGP上的一个或多个储库可以包含非选择性培养基。第一SDGP可以被配置用于革兰氏阳性微生物，并且第二SDGP可以被配置用于革兰氏阴性微生物。至少一个SDGP储库可以包含至少一种探针化合物。探针化合物可以包括但不限于表面结合剂、锁核酸、肽核酸、其它荧光原位杂交探针。探针可以包含一种或多种光学标记。该测定可以被配置为鉴定微生物，其包括生成关于第一子样品和第二子样品的质谱，并且将质谱与关于微生物的标准质谱的一个或多个文库进行比较。该系统可以包括选自以下的质谱仪：飞行时间(TOF)检测器、作为质量分析仪的静电和/或磁性扇区、四极杆质量分析仪和离子阱。该系统可以包含选自以下的电离源：化学电离、等离子体和辉光放电、电子碰撞、电喷雾电离、解吸电喷雾电离、快速原子轰击、场电离、激光电离、液体萃取表面分析、基质辅助激光解吸电离。该系统可以被配置为用自动化或半自动化仪器，将来自SDGP储库的子样品点样到用于基质辅助激光解吸电离TOF质谱法(MALDI-TOF)的平板上，并且执行MALDI-TOF，从而生成质谱。该系统可以被配置为在点样到MALDI-TOF靶上之前，将微生物浓缩。该系统可以被配置为在点样到MALDI-TOF靶上之前，通过离心将微生物浓缩成沉淀。该系统可以被配置为在点样到MALDI-TOF靶上之前，执行一个或多个洗涤步骤。该系统可以被配置为执行SDGP储库的一种或多种光学测量，包括吸光度、荧光、发光、时间门控发光。该系统可以被配置为生成质谱，其包括在质谱法之前，利用用于样品分离的气相色谱仪和/或液相色谱仪。SDGP可以包括在单个消耗品上的两个或更多个独立的储库。SDGP储库可以用机器人液体处理器进行接种。机器人液体处理器可以接种SDGP储库以及抗微生物剂敏感性测试(AST)板的一个或多个储库两者。SDGP和AST储库可以包括在同一消耗品上。在消耗品上可以存在两个或更多个相同的SDGP储库，使得可以将两个或更多个患者样品接种到该消耗品内。该测定可以被配置为在SDGP孵育之后鉴定微生物的核酸序列。测定可以被配置为包括对核酸进行测序，使探针与核酸杂交，或对核酸执行酶催化的反应。
前述列表预期是示例性的而不是限制性的，并且技术人员将了解本公开内容的另外方面、以及对上述方面和实施方案的修改。
附图说明
图1显示了根据本公开内容的某些实施方案的AST工作流。
图2显示了根据本公开内容的某些实施方案的示例性液相纯度平板设计。
图3显示了根据本公开内容的某些实施方案的示例性固相纯度平板设计。
图4显示了根据本公开内容的某些实施方案，与AST整合的示例性工作流。
图5A显示了对于五个不同的多微生物浓度和对照，吲哚测试吸光度读数相对于肺炎克雷伯氏菌(
图6显示了在非选择性培养基(Mueller-Hinton肉汤，MHB)和甘露醇盐肉汤中的4小时生长后，关于肺炎链球菌(S. pneumoniae)/路邓葡萄球菌(S. lugdunensis)的五个不同掺料比率的MALDI结果和Bruker BioTyper MALDI-TOF结果。尽管不希望受任何理论的束缚，但认为路邓葡萄球菌在MHB中相对较慢的生长速率，致使肺炎链球菌能够支配来自非选择性培养基的样品中的MALDI信号。相比之下，在选择性甘露醇盐肉汤培养基中生长的样品的MALDI分析，揭示了样品中路邓葡萄球菌的存在。
图7呈现了在非选择性培养基(Mueller-Hinton肉汤)或选择性培养基(甘露醇盐肉汤和MacConkey肉汤)中的4小时生长后，关于大肠杆菌/金黄色葡萄球菌(
具体实施方式
概况
一般地，本公开内容的系统和方法致力于通过减少与微生物鉴定(“ID”)相关的测定时间，减少执行和交付抗生素敏感性测试(“AST”)结果所需的时间。许多临床实验室使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)平台来执行ID分析。由于质谱是复杂的，因此ID通常通过将来自临床样品的光谱与微生物标准的数据库进行比较来实现。对于技术人员显而易见的是，这些光谱的复杂性由于样品中多于一种微生物的存在而增加，并且污染或共培养的物种可能使ID调用复杂化或阻止ID调用。在当前的行业标准工作流中，纯度平板在非选择性琼脂上过夜运行，与来自用于AST的相同细菌接种物的AST加工平行。这种工作流确保AST结果衍生自单个细菌物种和/或菌株。尽管一些临床微生物实验室在获得纯度平板之前将AST结果发布到临床，但许多实验室要求在将AST结果发布到临床之前，通过纯度平板的单微生物样品确认。尽管在AST结果发布之前等待纯度平板结果有助于确保AST结果是可行的，但这可能导致AST数据的报告延迟，并且因而导致患者向靶向疗法的过渡延迟。
在本公开内容的各个实施方案中采用了多重策略，以减少对于给定患者样品的AST结果分程传递，并且基于这些结果来制定处方决定所需的时间。首先，在本公开内容的某些实施方案中，使用对于特定微生物或微生物范畴的生长选择性的条件，来培养用于微生物ID和/或单微生物确认(“纯度”)的样品，随后为通过合适的方法使这些培养的样品经受ID。
下表1列出了可以在本公开内容的系统和方法中使用的代表性选择性培养基。选择性培养基压制、抑制、减少等除了所述培养基经设计而支持的特异性微生物类型(即物种、科、属等)之外的微生物生长，但本领域技术人员将了解压制、抑制、减少等的程度可能取决于微生物。这些培养基可以固体或液体形式使用。其它选择性培养基可以包括链球菌富集肉汤、Fraser肉汤、Giolitti Cantoni肉汤、粪链球菌培养基、月桂基硫酸钠和亚碲酸盐。
在图1中描绘了根据本公开内容，利用选择性或鉴别性培养基的示例性工作流。包含一种或多种鉴别性或选择性培养基的“鉴别性生长平板”和/或“鉴别性生长板”用样品进行接种，并且在支持微生物生长的条件下进行孵育。对于选择性培养基，这些条件可以包括不同的(例如升高的)温度和受控的CO
在选择性培养基生长中生长ID样品的一个优点在于：在每种条件下待检测的有关物种的广度是有限的。例如，如果培养基仅支持葡萄球菌属的生长，则对于遗传ID仅需要关于葡萄球菌属的引物，而对于MALDI-TOF ID仅需要查询葡萄球菌属数据集。
可以将微生物样品直接加入鉴别性生长实平板或板中，或者可以在添加之前进行加工(例如浓缩)。在一些实施方案中，鉴别性生长平板包括指示微生物物种或菌株在生长条件下存在或不存在的底物(例如酶促底物)。可替代地或另外地，鉴别性生长平板可以包括识别抗原或核苷酸序列的试剂，例如抗体或其片段、适体、反义寡核苷酸等，所述抗原或核苷酸序列指示在生长条件下存在微生物物种或菌株。
根据本公开内容的鉴别性生长板一般利用盒(cassette)或平板，其包括多个流体储库，例如48、96、384等孔。将两种或更多种选择性培养基提供给盒的不同孔，并且盒的至少一个孔可以包括非选择性培养基，例如Mueller-Hinton肉汤、具有裂解的马全血的胰蛋白酶大豆琼脂，例如作为生长对照孔。在一些情况下，盒可以基本上包括两个或更多个的孔阵列，其包含不同的选择性或非选择性培养基，使得可以在单个盒上运行两个或更多个样品(例如，来自两个或更多个患者)。
在图2中显示了示例性的384孔鉴别性生长板布局。板包含多个等同的48孔阵列；在使用中，每个阵列用不同的样品进行接种，致使能够平行加工多重(最多8个)样品。在每个阵列内，除选择性培养基之外，还可以包括一个或多个生物化学或结合测试孔(例如，包括指示一个或多个微生物物种的存在或不存在的酶促底物或结合剂的孔)，其可以提供另外的物种信息，例如用于区分肠杆菌科和葡萄球菌属。可以利用仅包含用于革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的肉汤和测试的平板，但可能优选在单块平板上运行所有肉汤和测试。例如，通过将平板分开，可以将不同的生长条件用于不同的微生物类型。需要不同生长条件的特异性培养基和/或测试也可以在不同平板上平行运行。当液相平板用作用于多微生物鉴定的主要工具时，平行运行固相培养可能是有利的，因为在多微生物样品的情况下，这种方法可能提供可以用于ID和/或AST的分离株。
选择性/鉴别性生长板包含各种培养基，其选择性地生长或抑制微生物的子集。每种选择性生长培养基含有一种或多种化合物，其不同地促进或帮助微生物物种或物种组的生长，或者抑制或阻止微生物物种或物种组的生长。每种鉴别性生长培养基含有关于酶催化的反应的一种或多种底物，所述酶催化的反应是微生物物种或物种组的特征。当鉴别性生长培养基中的底物在酶催化的反应中与微生物反应时，产生反应产物和/或消除反应底物。基于底物和/或反应产物的存在或不存在或相对数量，用户可以推断接种物中的特定微生物物种或物种组的存在或不存在。
鉴别性生长培养基可以用于区分金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)。鉴别性生长培养基的实例在生长培养基中使用免疫球蛋白G(IgG)可见。金黄色葡萄球菌的蛋白A受体与IgG结合，而其它葡萄球菌属菌株则不结合。因此，如果金黄色葡萄球菌存在于样品中并与IgG结合，则将不存在其为IgG或其片段的特征的任何信号。可以例如用荧光标记光学检测IgG的存在。未结合的IgG可以通过离心去除。另一个实例是凝固酶测定的使用。在这些测定中，作为反应产物的凝固酶的存在指示样品中金黄色葡萄球菌的存在。在凝固酶测定中耗尽金黄色葡萄球菌后，可以执行其它的个别生长测试，以鉴定剩余的葡萄球菌属菌株。
虽然选择性生长培养基促进了微生物物种和/或菌株的选择性生长，但在一些情况下可能期望区分在给定的选择性生长培养基中相似地生长的物种或菌株(例如，以在肠杆菌科中区分)。用于区分此类物种或菌株的许多合适的试剂是本领域已知的，包括但不限于吲哚、甲基红、Voges-Proskauer(VP)、柠檬酸盐利用(CRT)和选择性糖发酵测试[例如葡萄糖(MRG)、纤维二糖(MRC)、乳糖(MRL)、甘露醇(MRMTL)、甘露糖(MRMNS)、棉子糖(MRR)、蔗糖(MRSU)、海藻糖(MRT)、木糖(MRX)、卫矛醇(MRD)、阿东糖醇(MRAD)、肌醇(MRI)、山梨糖醇(MRSOR)、阿拉伯糖(MRARB)、麦芽糖、α-甲基-D-葡萄糖苷(MRAMG)、赤藓糖醇(MRE)、蜜二糖(MRMEL)、阿拉伯糖醇、甘油(MRGLY)和/或粘酸盐(MRMUC)发酵]、柠檬酸盐还原测试(CRT)；苯丙氨酸脱氨酶测试(PHD)；伴随或不伴随硫化氢检测的三糖铁；脲酶测试；使用赖氨酸(DCL)、鸟氨酸(DCO)、精氨酸(DCA)的脱羧测试；丙二酸盐、乙酸盐和/或酒石酸盐的利用；明胶水解测试；七叶苷水解测试；脂酶测试；DNA酶测试；氰化钾(KCN)中的生长；用新生物素的生长测试；凝固酶测试(COAG)；氨基酸的脱羧；葡糖醛酸酶活性(GUS)；β-半乳糖苷酶活性；固有荧光；七叶苷水解等。在本公开内容的一些实施方案中，将前述试剂中的一种或多种加入选择性生长培养基中，以致使其成为鉴别性生长培养基。在不限制前述内容的情况下，在一些情况下，与选择性培养基中的生长评价平行执行另外的测试可能是有利的。例如，为了将金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)区分开，在葡萄球菌选择性培养基(如甘露醇盐)中执行凝固酶和/或个别生长测试，伴随鉴定金黄色葡萄球菌的一种或多种测试可能是有用的，例如，通过使用与蛋白A结合的免疫球蛋白G(IgG)，所述蛋白A是由金黄色葡萄球菌表达，但不由凝固酶阴性葡萄球菌表达的表面蛋白质。然后比较且分析未耗尽和耗尽的孔中的相对生长。
许多读出可以用于区分在鉴别性生长培养基中生长的物种或物种组，包括但不限于光吸收或透射。例如，如果使用伊红美蓝(EMB)培养基，则通过吸光度的光学查询用于解释菌落颜色。如美国授权前公开号2018/0088141中所述，在液体培养中(例如在测试板上)生长的细菌可以通过离心形成沉淀，随后为培养基抽吸(以及可能的后续洗涤)，随后为与特异性染色剂或其它试剂接触。这些方法允许评估在液相中生长的微生物菌落，其以前已限于在固相中生长的菌落。
在本公开内容的某些实施方案中，质谱法用作一种或多种鉴别性生长培养基的读出。质谱法且特别是MALDI-TOF，可以用于检测其为特异性微生物物种的代表的酶促反应产物。一旦已建立了质谱文库，质谱法就是鉴定样品中存在的微生物的有效且划算的方式。由于MALDI-TOF平板的设计，可以在短时帧内运行多重样品(大多数靶平板含有384个样品点)。进一步地，该方法足够灵敏，以甚至检测来自含有多重病原体的样品的细菌。最后，与使用中的其它方法相比，样品所需的制备是最低限度的，并且能够显著减小测试所需的时间，将该时期缩短2-3天。样品制备(培养条件、培养时间)中的变化并不影响使用MALDI-TOF的微生物鉴定，因此确保了结果的可靠性。
鉴别性生长平板和鉴别性生长板根据相同原理操作，但鉴别性生长平板在其在固相中的选择性或鉴别性培养基使用方面不同。每块平板用样品进行划线培养，在适合于微生物生长的条件下进行孵育，并且评价菌落形成。利用鉴别性生长平板的本公开内容的方法与当前采用的纯度平板工作流的不同之处在于：菌落生长在过夜孵育后并不在视觉上进行评价，而是使用在裸眼可见之前揭示菌落生长的成像技术(例如少于6个小时、7小时、8小时、10小时、12小时)进行评价。这些技术包括但不限于光学显微镜检查、近场成像和/或自发荧光。获取鉴别性生长平板的图像，并且可以基于图像变量如光密度和/或通过与单微生物和/或多微生物标准文库的比较，来进行单微生物相对于多微生物调用(call)。
鉴别性生长平板可以手动或使用自动化划线器进行划线培养。在一些情况下，使用不同的样品浓度，对多重鉴别性生长平板进行划线培养可能是有用的。
图3描绘了根据本公开内容的实施方案的示例性鉴别性生长平板300。非选择性培养基301，例如具有5%裂解血的胰蛋白酶大豆琼脂可以位于平板300的中央或外围部分，并且选择性培养基302、303等可以沿着平板径向布置。
使用上述方法和系统生成的微生物ID数据可以用于标记多微生物样品。在一些实施方案中，ID数据可以用于辅助AST结果的解释。
在一些实施方案中，单个盒包含如上所述的鉴别性生长板和AST板两者，其中多个孔包含多重抗微生物剂，在每个孔中具有不同的浓度。盒、AST板和利用其的自动化AST系统在共同转让的美国授权前公开号2018/0088141中进行描述，其为了所有目的引入作为参考。
在图4中显示了与快速AST平行的本文所述方法使用的实例。图中所示的孵育时间是快速AST平台的速度的示例，但并不预期是限制性的。在图示的情况下，多微生物ID结果返回决定性ID，然后将其报告给AST算法，以能够得到定量的AST结果以及定性的解释标准，以确定并报告给临床。这种情况进一步示出了通过多重模块(例如快速AST、MALDI、流体和样品处理)的系统集成而成为可能的自动化加工的使用。
根据本公开内容的某些实施方案的快速AST方法涉及下述步骤：首先，将含有微生物的样品接种到AST测试板上，所述AST测试板包括多个储库，其包括(a)不包括抗微生物剂的至少一个储库(即生长对照储库)，以及(b)至少一个测试储库，其包括取决于其阴离子表面电荷而区别地影响微生物生长的试剂-例如，相对于具有较低阴离子表面电荷的微生物，减少具有较高阴离子电荷的微生物生长的试剂。
测试板通常还包括多个储库，其限定了关于多种抗微生物剂的稀释系列，并且本公开内容的AST方法一般涉及评价跨越稀释系列的每种抗微生物剂中的微生物生长，以确定每种抗微生物剂的最小抑菌浓度，以及任选地，断点浓度。在对于抗微生物剂稀释系列评价微生物生长之前，在对于微生物生长适当的条件下，例如在25º、30º、35º、37º等温度下(以摄氏度计)，使测试板孵育一段时间，任选地在孵育期的至少一部分期间搅动。在孵育之后，评价至少一个生长对照储库中的微生物生长。如果生长达到或超过预定的最低水平，则执行一种或多种终点测定，以评价在每个测试浓度下每种抗微生物剂中的微生物生长水平。然后，手动或用算法评估这些结果，以鉴定样品对于其敏感的抗微生物剂连同其最小抑菌浓度。
MALDI-TOF
可以使用商购可得的MALDI靶平板和基质溶液来制备用于MALDI-TOF样品。在一般的样品制备中，将包含合适的MALDI基质的液体与适当的溶剂和微生物样品组合，以形成液体MALDI样品。将MALDI样品施加到(例如点样到)MALDI靶平板，所述靶平板在置于专用的MALDI TOF质谱仪内之前任选地进行干燥(例如通过溶剂蒸发)。可替代地，可以在添加包含合适的MALDI基质的液体之前，将液体微生物样品点样到MALDI靶平板上并允许干燥。可替代地，可以将微生物样品涂抹到靶平板上。如本领域技术人员已知的，可以对点样的微生物执行任选的提取步骤。生成质谱并且针对参考光谱的数据库进行比较，并且进行ID调用。
微生物样品可以包含完整的微生物、裂解的微生物或微生物组分，例如沉淀或分离的微生物蛋白、脂质、糖脂、糖蛋白等。在一些情况下，例如通过添加指示样品中的微生物物种或菌株的存在或不存在的生物化学底物、抗体、适体、反义寡核苷酸、或者其它报告或检测试剂，来加工微生物样品。
完整的微生物可以以固相提供，例如，作为从平板中挑选的单个微生物菌落，或者以液相提供，例如作为微生物菌落的液体培养物或作为得自患者样品的液体培养物。微生物裂解可以在点样到靶上之后例如用甲酸执行，或者在点样到靶上之前执行。微生物组分可以根据本领域已知的方法提供，所述方法例如蛋白质的裂解和乙醇沉淀。
可以使用定制的或商购可得的仪器来执行MALDI-TOF分析，所述仪器例如由Bruker Daltonics(MALDI Biotyper™)、bioMerieux(VITEK™ MS)、Shimadzu、WatersCorporation等出售的那些仪器。关于微生物ID的标准质谱数据库也是从Andromas、bioMeriux(SARAMIS)等商购可得的，并且开放源或公共数据库也是可获得的，例如mMASS、Mass-Up、pkDACLASS、MALDIquant、SpectraBank等。可替代地或另外地，自定义质谱数据库可以用于来自样品谱的ID。
用于微生物ID的合适MALDI-TOF基质可以包括但不限于α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)、2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、2,5-二羟基苯乙酮(DHAP)、芥子酸、3-羟基吡啶甲酸及其混合物。许多溶剂对于这些基质可以是合适的，包括水、乙醇、乙腈、三氟乙酸及其混合物。
MALDI-TOF样品制备和光谱法可以手动执行，或使用自动化系统，例如由Copan等出售的那些系统执行。
微生物
感染可以包括任何微生物起源的感染因子，例如细菌、真菌细胞、古生菌和原生动物。在一些实例中，感染因子为细菌，例如革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和非典型细菌。抗微生物剂抗性微生物可以是对抗微生物剂(即抗细菌药物、抗真菌药物、抗古生菌药剂和抗原生动物药物)抗性的微生物。
微生物(例如，微生物的液体悬浮液)可以包括一种菌株的微生物。微生物可以包括一个物种的微生物。微生物可以包括多于一种菌株的微生物。微生物可以包括一个目的微生物。微生物可以包括一个纲的微生物。微生物可以包括一个科的微生物。微生物可以包括一个界的微生物。
微生物(例如，微生物的液体悬浮液)可以包括多于一种菌株的微生物。微生物可以包括多于一个物种的微生物。微生物可以包括多于一个属的微生物。微生物可以包括多于一个目的微生物。微生物可以包括多于一个纲的微生物。微生物可以包括多于一个科的微生物。微生物可以包括多于一个界的微生物。
微生物可以是细菌。细菌的实例包括但不限于橙黄醋杆菌(Acetobacteraurantius)、沥青不动杆菌(Acinetobacter bitumen)、不动杆菌属物种、以色列放线菌(Actinomyces israelii)、放线菌属物种、气球菌属物种、放射形农杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、无形体属(Anaplasma)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)、维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)、芽孢杆菌属、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、梭状芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)、芽孢杆菌属物种、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus Thuringiensis)、拟杆菌属(Bacteroides)、脆弱拟杆菌、牙龈拟杆菌(Bacteroides gingivalis)、产黑色素拟杆菌(Bacteroides melaninogenicus)(也称为产黑色素普雷沃菌(Prevotellamelaninogenica))、巴尔通氏体属、汉氏巴尔通氏体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通氏体(Bartonella quintana)、巴尔通氏体属物种、博德特菌属、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、博德特菌属物种、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、布鲁氏菌属、流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、布鲁氏菌属物种、猪布鲁氏菌(Brucellasuis)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、假鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapseudomallei)、肉芽肿鞘杆菌(Calymmatobacterium granulomatis)、弯曲杆菌属、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、弯曲杆菌属物种、衣原体属、衣原体属物种、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、嗜衣原体属、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)(先前称为肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae))、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)(先前称为鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydia psittaci))、嗜衣原体属物种、梭菌属、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)(先前称为魏氏梭菌(Clostridiumwelchii))、梭菌属物种、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、棒状杆菌属、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、梭形棒状杆菌(Corynebacterium fusiforme)、棒状杆菌属物种、伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)、恰菲埃立克体(Ehrlichiachaffeensis)、埃立克体属物种、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、肠杆菌属物种、肠球菌属、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、粪肠球菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌(Enterococcus galllinarum)、病臭肠球菌(Enterococcusmaloratus)、肠球菌属物种、大肠杆菌(Escherichia coli)、弗朗西丝氏菌属物种(Francisella spp.)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、加德纳氏菌属物种、阴道加德纳氏菌(Gardnerellavaginalis)、嗜血杆菌属物种、嗜血杆菌属、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、百日咳嗜血杆菌(Haemophilus pertussis)、阴道嗜血杆菌(Haemophilus vaginalis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、螺杆菌属物种、肺炎克雷伯氏菌、克雷伯氏菌属物种、乳杆菌属、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳杆菌属物种、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、军团菌属物种、钩端螺旋体属物种、单核细胞增多性李斯特菌、李斯特菌属物种、Methanobacterium extroquens、多形微杆菌(Microbacterium multiforme)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、分枝杆菌属、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、类白喉分枝杆菌(Mycobacterium diphtheriae)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、鼠麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepraemurium)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、分枝杆菌属物种、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、支原体属、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、生殖道支原体(Mycoplasma genitalium)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、穿透支原体(Mycoplasmapenetrans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、支原体属物种、奈瑟菌属、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、奈瑟菌属物种、诺卡氏菌属物种、巴斯德氏菌属、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、巴斯德氏菌属物种、土拉巴斯德氏菌(Pasteurella tularensis)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、产黑色素普雷沃菌(Prevotellamelaninogenica)(先前称为产黑色素拟杆菌(Bacteroides melaninogenicus))、变形杆菌属物种、铜绿假单胞菌、假单胞菌属物种、放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、立克次氏体属、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、鹦鹉热立克次氏体(Rickettsiapsittaci)、五日热立克次氏体(Rickettsia quintana)、立氏立克次氏体(Rickettsiarickettsii)、立克次氏体属物种、沙眼立克次氏体(Rickettsia trachomae)、罗卡利马氏体(Rochalimaea)、汉氏罗卡利马氏体(Rochalimaea henselae)、五日热罗卡利马氏体(Rochalimaea quintana)、龋齿罗氏菌(Rothia dentocariosa)、沙门氏菌属、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、沙门氏菌属物种、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、志贺氏菌属物种、迂回螺菌(Spirillum volutans)、葡萄球菌属、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、葡萄球菌属物种、嗜麦芽窄食单胞菌、窄食单胞菌属物种、链球菌属、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、鸟链球菌(Streptococcusavium)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、大鼠链球菌(Streptococcus cricetus)、屎链球菌(Streptococcus faceium)、粪链球菌、野生链球菌(Streptococcus ferus)、鸡链球菌(Streptococcus gallinarum)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、温和链球菌(Streptococcus mitior)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、肺炎链球菌、酿脓链球菌、鼠链球菌(Streptococcus rattus)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、链球菌属物种、密螺旋体属、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、密螺旋体属物种、脲原体属物种、弧菌属、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、逗号弧菌(Vibriocomma)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、弧菌属物种、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、草绿色链球菌、沃尔巴克氏体(Wolbachia)、耶尔森氏菌属、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)和耶尔森氏菌属物种。
微生物可以是真菌。真菌的实例包括但不限于曲霉属物种、芽生菌属物种、假丝酵母属物种、枝孢菌属、球孢子菌属物种、隐球菌属物种、突脐蠕孢属、镰刀菌、组织胞浆菌属物种、伊萨酵母属物种、毛霉菌、肺囊虫属物种、癣菌、丝孢菌、孢子丝菌属和葡萄状穗霉属物种。微生物可以是原生动物。原生动物的实例包括但不限于溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)、疟原虫属物种(Plasmodium spp.)、兰氏贾第虫(Giardia lamblia)和布氏锥虫(Trypanosoma brucei)。
抗微生物剂
当微生物是细菌时，示例性的抗微生物剂包括阿米卡星、氨基糖苷、氨基糖苷阿莫西林、氨基糖苷类、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸盐、氨苄青霉素、氨苄青霉素/舒巴坦、抗毒素、胂凡纳明、阿奇霉素、阿洛西林、氨曲南、β-内酰胺、杆菌肽、卷曲霉素、碳青霉烯类、羧苄青霉素、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻吩(Cefalothin)、头孢噻吩(Cefalotin)、头孢羟唑、头孢唑啉、头孢地尼、头孢托仑、头孢吡肟、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢西丁、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢洛林(Ceftaroline)、头孢洛林酯(Ceftaroline fosamil)、头孢他啶、头孢布坦、头孢唑肟、头孢吡普、头孢曲松、头孢呋辛、头孢菌素、氯霉素、氯霉素(Bs)、环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、氯法齐明、氯唑西林、粘菌素、复方新诺明、环丝氨酸、达巴万星、氨苯砜、达托霉素、地美环素、双氯西林、地红霉素、多利培南、多西环素、依诺沙星、厄他培南、红霉素、乙胺丁醇、乙胺丁醇(Bs)、乙硫烟胺、氟氯西林、氟喹诺酮、氟喹诺酮类、磷霉素、呋喃唑酮、夫西地酸、加替沙星、格尔德霉素、吉米沙星、庆大霉素、格帕沙星、除莠霉素、亚胺培南/西司他丁、异烟肼、卡那霉素、左氧氟沙星、林可霉素、利奈唑胺、洛美沙星、氯碳头孢、溶葡萄球菌素、大环内酯类、磺胺米隆、美罗培南、甲氧西林、甲硝哒唑、美洛西林、米诺环素、莫西沙星、莫匹罗星、萘夫西林、萘夫西林、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因(Bs)、诺氟沙星、氧氟沙星、奥普托辛、奥利万星、苯唑西林、土霉素、巴龙霉素、青霉素、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、平板霉素、多粘菌素B、泼斯唑来、吡嗪酰胺、奎奴普丁/达福普丁、雷得唑来、瑞西巴库、利福布丁、利福平(Rifampicin)、利福平(Rifampin)、利福喷丁、利福昔明、罗红霉素、磺胺嘧啶银、司帕沙星、壮观霉素、壮观霉素(Bs)、螺旋霉素、链阳菌素、链霉素、舒巴坦、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺地托辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑(Sulfanilimide)、柳氮磺胺吡啶、磺胺异噁唑、磺酰胺基柯衣定、特地唑胺、替考拉宁、泰斯巴汀、特拉万星、泰利霉素、替马沙星、替莫西林、四环素、甲砜霉素、替卡西林、替卡西林/克拉维酸盐、替卡西林/克拉维酸、替加环素、替加环素(Bs)、替硝唑、TMP/SMX、妥布霉素、特地佐利、甲氧苄啶(Bs)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、醋竹桃霉素、曲伐沙星、万古霉素及其泛型或其变体。
其与微生物的相互作用影响微生物表面上的负电荷且受微生物表面上的负电荷影响的抗微生物剂可以包括：聚阳离子氨基糖苷，其在结合细胞表面时置换Mg
当微生物是真菌时，示例性的抗微生物剂包括5-氟胞嘧啶、阿巴芬净、阿巴康唑、烯丙胺类、两性霉素B、Ancobon、阿尼芬净、唑、秘鲁香脂、苯甲酸、联苯苄唑、布康唑、杀假丝菌素、卡泊芬净、环匹罗司、克霉唑、Cresemba、结晶紫、大扶康、棘白菌素类、益康唑、艾氟康唑、氟环唑、芬替康唑、菲律宾菌素、氟康唑、氟胞嘧啶(Flucytosine)、灰黄霉素(Grifulvin)V、灰黄霉素(Griseofulvin)、Gris-Peg、卤普罗近、哈霉素、咪唑类、艾沙康唑、艾沙康唑鎓、异康唑、伊曲康唑、酮康唑、疗霉舒(Lamisil)、卢立康唑、米卡芬净、咪康唑、纳他霉素、诺科飞(Noxafil)、制霉菌素、奥莫康唑、Onmel、Oravig、奥昔康唑、泊沙康唑、丙环唑、雷夫康唑、龟裂霉素、舍他康唑、斯皮仁诺(Sporanox)、硫康唑、特比萘芬、特康唑、噻唑类、硫代氨基甲酸酯抗真菌剂、噻康唑、托萘酯、三唑类、十一碳烯酸、威凡(Vfend)、伏立康唑及其泛型或其变体。
当微生物是原生动物时，示例性的抗微生物剂包括8-氨基喹啉、乙酰胂胺、针对变形虫界的药物、臭椿酮、阿莫地喹、两性霉素B、安普罗铵、抗毛滴虫剂、除疟霉素、胂噻醇、蒿醚林酸(Artelinic acid)、蒿甲醚、蒿甲醚/苯芴醇、青蒿素、蒿乙醚、青蒿氧烷、青蒿琥酯、青蒿琥酯/阿莫地喹、阿托伐醌、阿托伐醌/氯胍、阿扎硝唑、阿奇霉素、苄硝唑、溴羟喹啉、布帕伐醌、卡巴胂、卡硝唑、喹碘方、氯喹、氯丙胍、氯丙胍/氨苯砜、氯丙胍/氨苯砜/青蒿琥酯、氯喹那多、囊泡藻界抗寄生虫药(Chromalveolate antiparasitics)、金鸡纳、Cipargamin、克拉珠利、克立法胺、克清诺、球虫抑制药、Codinaeopsin、Cotrifazid、白叶藤碱、环氯胍、去氢依米丁、双苯他胂、二氢青蒿素、二氯尼特、重氮氨苯咪、双硫仑、多西环素、依洛尼塞、ELQ-300、依米丁、依托法胺、古虫界抗寄生虫药(Excavata antiparasitics)、夫马菌素、呋喃唑酮、甘铋胂、GNF6702、卤泛群、羟氯喹、咪多卡、异丙硝唑、金鸡纳树皮(Jesuit'sbark)、KAF156、苯芴醇、马度米星、甲氟喹、Megazol、葡甲胺锑酸盐、美拉胂醇、麦帕克林、甲硝哒唑、米替福新、神经降压素(Neurolenin)B、尼卡巴嗪、硝呋莫司、尼莫拉唑、硝苯胂酸、两面针碱、硝呋醛、奥里发新(Olivacine)、奥硝唑、乳清群海绵定(Oroidin)、扑疟喹、巴龙霉素、戊烷脒、五价含锑药物、泛喹酮、氧二苯脒、哌喹、伯氨喹、氯胍、项目523、普罗硝唑、乙嘧啶、咯萘啶、喹法米特、奎宁、罗硝唑、Schedula Romana、SCYX-7158、塞克硝唑、塞马莫德、葡萄糖酸锑钠、螺环吲哚酮(Spiroindolone)、磺胺多辛、磺胺多辛-乙嘧啶、磺胺林、苏拉明、他非诺喹(Tafenoquine)、替克洛占、替诺尼唑、甲溴羟喹、替硝唑、三甲曲沙、杀锥虫剂、Warburg酊剂及其泛型或其变体。
抗微生物剂可以是通过类似于本文所述药物的机制起作用的药物。本领域已知的其它抗微生物药物可以用于本文所述的方法中。
液体悬浮液
液体可以包括生长培养基，例如阳离子调节的Mueller Hinton肉汤。这种培养基可以包含本领域技术人员已知促进微生物生长和稳定性的添加剂。除不同的抗微生物剂之外，不同的测试孔可以包含已知改善关于特定抗微生物剂的AST准确度的添加剂。例如，可以将另外的氯化钠加入包含苯唑西林的测试中，并且可以将另外的钙加入包含达托霉素的测试中。
生物样品
本文所述的微生物可以衍生自生物样品。在一些实施方案中，生物样品是含有微生物(例如细菌和真菌细胞)的任何样品。生物样品可以衍生自临床样品。
示例性的生物学样品可以包括但不限于全血、血浆、血清、痰、尿、粪便、白血细胞、红血细胞、血沉棕黄层、泪液、粘液、唾液、精液、阴道液、淋巴液、羊水、脊髓或脑脊髓液、腹膜腔积液、胸腔积液、渗出液、点状物质(punctates)、上皮涂片、活组织检查、骨髓样品、来自囊肿或脓肿的流体、滑液、玻璃体液或房水、洗眼液或吸出物、支气管肺泡灌洗液、支气管灌洗液或肺灌洗液、肺吸出物、以及器官和组织(包括但不限于肝、脾、肾、肺、肠、脑、心脏、肌肉、胰腺等等)、拭子(包括但不限于伤口拭子、口腔拭子、咽喉拭子、鼻拭子、阴道拭子、尿道拭子、宫颈拭子、直肠拭子、病灶拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子等等)及其任何组合。还包括的是细菌培养物或细菌分离株、真菌培养物或真菌分离株。普通技术人员还可以了解，从任何上文示例性的生物样品获得的分离株、提取物或材料也处于本发明的范围内。
得自生物样品的微生物可以如本领域常规执行的进行培养或以其它方式进行加工。
AST方法中使用的对照
对照可以包括微生物对于其不敏感的抗微生物剂。例如，如果测定用于确定革兰氏阳性细菌的敏感性，则对照(和测试孵育)可以包括靶向革兰氏阴性细菌的一种或多种抗微生物剂，和如果测定用于确定真核微生物的敏感性，则对照(和测试孵育)可以包括一种或多种抗细菌的抗微生物剂。
在一些实施方案中，对照是在除了没有抗微生物剂或者具有微生物对于其不敏感的一种或多种抗微生物剂之外，在其它方面等同的条件下从微生物测量的阳性对照。在一些实施方案中，在除了没有营养素之外，在其它方面等同的条件下，从微生物测量对照。在一些实施方案中，在具有已知抑制微生物生长的一种或多种毒素，在其它方面等同的条件下，从微生物测量对照。
对照可以是历史对照。在一些实施方案中，在已执行对照孵育之后执行测试孵育。在一些实施方案中，对照在与包含测试孵育的筒(cartridge)不同的筒中执行。
筒
筒可以是能够容纳并允许微生物的液体悬浮液生长的容器。筒的非限制性实例可以包括培养瓶、培养皿、皮氏培养皿、生物测定皿、培养管、试管、微量离心管、瓶、微腔平板、多腔平板、微量滴定平板、微平板。筒可以包含一个腔室。筒可以包括多个腔室，每个腔室是能够将液体悬浮液保持与另一空间物理隔离的空间；腔室的一个实例是多孔平板中的腔室。筒可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、48、96、192、384、1536个或更多个腔室，以及两者之间的任何数目的腔室。筒腔室的底部可以是平坦的、圆形的或V形的。
存在于筒上的多个腔室内的抗微生物剂可以悬浮于培养基中。在一些实施方案中，抗微生物剂以抗微生物膜的形式存在。在某些实施方案中，抗微生物剂以固体形式存在。在一些实施方案中，将固体抗微生物剂冻干和/或干燥。某些实施方案提供了在引入微生物的悬浮液之前，在一个或多个筒腔室中作为抗微生物膜、以固体形式(冻干或干燥)存在的一种或多种抗微生物剂。
在用样品接种平板之前，抗微生物剂稀释系列可以是冷冻的、冻干的或新鲜制备的。在一些情况下，可以通过手动或使用自动化系统执行筒的接种。在一些实例中，如在新鲜抗微生物剂平板的情况下，自动化液体处理系统可以用于制备具有抗微生物剂稀释系列的筒。接种方法可以包括其可以是本领域已知的各种方法中的任一种。
如本文所述，筒可以用于含有各种流体组合，以便进行多重测试序列，例如检查点测定和多种不同的生长测定。在一些实施方案中，筒具有用于促进一种或多种检查点测定的一组腔室、以及用于促进一种或多种生长测定的一组腔室。例如，筒可以包括以行和列排列的腔室阵列。筒可以包括一组对照腔室和一组抗微生物剂测试腔室。对照腔室组可以包括两个腔室，并且测试腔室组可以包括沿着平板的腔室的剩余部分。在一些实施方案中，对照腔室组包括至少两个腔室，其中一个腔室是生长腔室，而另一个腔室是非生长腔室。在一些实施方案中，生长腔室包括或被接种以包括肉汤和患者样品的组合，使得患者样品中的微生物可以在孵育期过程中在肉汤内生长。在某些实施方案中，抗微生物剂不加入检查点测定腔室中。而在一些实施方案中，非生长腔室可以包括或被接种以包括不含患者样品的肉汤(即，在不存在来自患者样品的微生物的情况下的肉汤)。在一些实施方案中，抗微生物剂也未加入非生长腔室中。因此，在孵育期过程中，与微生物可以在其中生长的生长腔室相比，非生长腔室可以充当基线。
在一些实施方案中，每个筒包括“测试板”，对于每种抗微生物剂以限定的稀释系列(例如2倍稀释系列、10倍稀释系列等)跨越多重孔分布的多种抗微生物剂。另外，每个筒或测试板可以含有对照腔室，例如生长对照腔室、非生长(污染)对照腔室和盐水对照腔室。盐水对照腔室可以代表FIT对照，其大约等于接种物中微生物的初始浓度。筒可以包括多重腔室(例如96腔室筒或384腔室筒)，其具有盖子(例如可移除的盖)和唯一地定义抗生素配置的标识符(例如条形码)、以及定义平板并且可与符合HIPAA的独特患者样品相关联的独特代码。
测试腔室可以包括患者样品的各种组合中的任一种，以及可以分析关于其的敏感性的各种类型和浓度的抗微生物剂。腔室的行可以专用于特定的抗微生物剂，并且抗微生物剂的浓度可以在同一行的列之间变化。例如，筒可以具有一行含有青霉素的腔室，其中每个腔室从左到右含有渐增浓度的青霉素。
当然，其它实例也是可能的。例如，不同的腔室和腔室组可以位于沿着筒的各种位置中的任一个处。另外，不同的腔室组(例如对照腔室和测试腔室)可以包括沿着筒的更多或更少的单个腔室。另外，在一些情况下，并非所有的腔室在测试期间都被使用/占用。
自动化AST方法
本文所述的方法可以使用商购可得的设备、定制设备或其组合以自动化方式执行。使方法自动化允许执行更大数目的测定以及测定之间增加的一致性。自动化还可以增加这些方法的速度和分辨率。自动化AST方法例如在US公开2019/0212339中进行描述，其在此引入作为参考。
表面结合探针测定
表面结合测定(也称为表面结合探针测定)可以利用信号传导剂。信号传导剂一般包含能够与微生物结合的部分(例如与微生物表面结合的抗体和/或凝集素、与微生物表面非特异性结合的荷电部分和/或功能部分)，以及能够提供信号或促成信号产生的化学部分(例如酶化学发光团和镧系元素螯合物)。示例性的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶及其组合。
信号生成剂可以包括与一种或多种微生物受体缀合的一种或多种化学部分。信号生成剂包括但不限于一种或多种催化剂(包括酶、金属氧化物纳米颗粒、有机金属催化剂、设计用于信号放大的纳米颗粒(例如本申请要求其优先权且整体引入本文作为参考的美国临时申请所述的那些)、包含信号生成元件的细菌噬菌体、荧光团(包括有机荧光团，含有铕或钌(II)、铼(I)、钯(II)、铂(II)的有机金属化合物)、和/或比色染料(包括有机染色剂)。可以使用上述的组合，例如纳米颗粒、树枝状分子和/或具有酶、荧光团和/或有机金属分子的其它纳米级结构。
可以在使信号传导剂与微生物接触之前、信号传导剂最初与微生物接触的同时、或在信号传导剂已与微生物接触之后，使化学部分与信号传导剂缀合。
当将信号传导剂加入含有微生物的AST稀释物中时，信号传导剂受体(例如可以与微生物特异性或非特异性结合的部分)可以与微生物表面结合。因此，例如，在溶液中完整微生物越多，与这些细菌结合的信号传导剂的数目越大。因而，在完整细菌的数目和溶液中游离的信号传导剂的数目(如由未与完整细菌结合的那些所定义的)之间存在反向关系。注意到，如果例如微生物响应于抗微生物剂处理而裂解，则游离的信号传导剂可以与可溶性微生物组分结合。
与微生物表面结合和/或插入微生物表面内的信号传导剂的数目与微生物表面积成比例。微生物表面积与真正的抗性微生物强烈相关。特别地，在响应于MIC和亚MIC浓度的抗微生物剂而膨胀或伸长的微生物(例如形成长丝的细菌)的情况下，已知代谢和/或体积鉴定给出关于“快速”AST时间点(定义为少于6小时的那些)的假敏感性概况。为了克服这种限制，本发明将微生物表面积(而不是体积)转变为可测量的信号，例如光学信号。本文所述的方法能够在少于6小时内准确地确定微生物抗性概况。
为了使与微生物结合和/或插入微生物内的信号传导剂与游离的信号传导剂分离，执行一个或多个分离和/或竞争性结合步骤可能是必要的。此类步骤包括但不限于离心(例如以
为了促进信号传导剂结合和/或减少背景，可能进一步有利的是在添加信号传导剂之前，使微生物与它们在孵育期间悬浮于其中的液体分离。此类分离可以包括但不限于离心、过滤、电泳和/或磁性捕获。
信号传导剂可以连同微生物和/或抗微生物剂一起添加，使得它们对于整个AST孵育期都存在。这个总时期可以长达24小时，或在8小时内，或在5小时内。可替代地，可以将信号传导剂在规定的孵育期之后加入微生物和抗微生物剂中。这个时期可以长达24小时，或在8小时内，或在4小时内。
信号传导剂被设计为与微生物表面结合和/或插入微生物表面中，所述微生物表面包括壁和/或膜。设计用于结合的信号传导剂包含结合部分，其包括但不限于一种或多种抗体、凝集素、其它蛋白质、具有一个或多个荷电化学基团的小分子、具有一个或多个功能性化学基团的小分子、噬菌体、糖蛋白、肽、适体、荷电小分子、具有固定电荷的小分子、荷电聚合物、具有固定电荷的荷电聚合物、疏水性小分子、荷电肽、具有固定电荷的荷电肽、具有交替的亲水性和疏水性区域的肽和/或小分子配体，其可能是或可能不是有机金属络合物。设计用于微生物结合的分子是本领域的技术人员众所周知的。信号传导剂可以保持与微生物结合和/或可以内化，因此包括所有结合。设计用于插入的信号传导剂可以包括但不限于小疏水性分子、疏水性肽和/或具有交替的疏水性和亲水性区域的肽。设计用于微生物插入的分子是本领域的技术人员众所周知的。信号传导剂可以进一步对于一种或多种类型的微生物是特异性的。信号传导剂可以具有多重受体。这些可以增强结合和/或使得能够同时与两种或更多种微生物结合，这可以进一步作用于使细菌凝集。在添加信号传导剂之前或同时，调整溶液pH可能是有利的。这可能有益于增强微生物和信号传导剂之间的电荷-电荷相互作用。通过将溶液pH滴定至高于中性(更碱性)，可以增加微生物的阴离子电荷。因此，利用具有一种或多种固定的阳离子电荷的部分可能是有益的。
值得注意的是，信号传导剂可以与微生物特异性结合(例如与微生物物种或微生物菌株特异性结合的抗体)、或者可以与微生物非特异性结合(例如通过通用的共价或非共价键形成和本领域已知的另一种非特异性化学结合)。
可替代地，可以将能够与信号传导剂结合的化学品和/或生物化学品加入微生物在生长期间悬浮于其中的液体中，使得化学品和/或生物化学品在孵育期间掺入微生物内。这可以作用于增强信号传导剂与微生物的结合。在可替代实施方案中，信号传导剂本身可以存在于微生物在孵育期间悬浮于其中的液体中，并且可以在生长期间掺入微生物内。
信号传导剂可以包含放大器信号生成剂(放大器基团)，使得来自每个完整微生物的信号可以被放大超过与每个微生物结合的信号传导剂的数目。例如，已知酶辣根过氧化物酶(HRP)能够使信号放大>1×10
可替代地，信号传导剂可以包含本领域的技术人员已知作为膜染料的光学染料前体，其被设计为在插入疏水性区域(例如细胞膜)内时极大地增加荧光发射。用这些信号传导剂设计的测定可能需要将微生物浓缩成较小的体积，接近平面，以产生足够的信号，以便容易地进行光学测量。干扰物类可能需要使用近IR荧光团。
示例性的放大器基团包括例如国际公开号WO 2016/015027和国际申请号PCT/US16/42589中所述的那些，所述专利各自整体引入作为参考。放大器基团可以包含催化剂、荧光团、比色染料、酶、催化剂或纳米颗粒。示例性的荧光团包括国际申请号PCT/US16/42589的图1、表1中所述的那些，所述专利整体引入作为参考。放大器基团可以包含镧系元素。镧系元素包括但不限于铕、锶、铽、钐或镝。
放大器基团可以包含有机荧光团，例如配位络合物。配位络合物可以是铕配位络合物、钌配位络合物、铼配位络合物、钯配位络合物、铂配位络合物。放大器可以包含化学发光团、量子点、酶、铁配位催化剂、铕配位络合物、钌配位络合物、铼配位络合物、钯配位络合物、铂配位络合物、钐配位络合物、铽配位络合物或镝配位络合物。
在一些实施方案中，放大器基团包含其为以下的部分：
在一些实施方案中，放大器基团包含其为以下的部分：
放大器基团可以包含荧光团或比色染料。合适的荧光团和比色染料是本领域的技术人员众所周知的，并且在
合适的荧光团或比色染料的实例包括但不限于溴化乙锭、碘化丙锭、SYTOX绿、菲啶类、吖啶类、吲哚类、咪唑类、花青、TOTO、TO-PRO、SYTO、5-羧基-2,7-二氯荧光素、5-羧基荧光素(5-FAM)、5-羧基萘基荧光素、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、5-FAM(5-羧基荧光素)、5-HAT(羟基色胺)、5-ROX(羧基-X-罗丹明)、6-羧基罗丹明6G、7-氨基-4-甲基香豆素、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、7-羟基-4-甲基香豆素、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)、吖啶类、Alexa Fluors、茜素、别藻蓝蛋白(APC)、AMCA(氨基甲基香豆素)、Bodipy、羧基-X-罗丹明、儿茶酚胺、荧光素(FITC)、羟基香豆素、丽丝胺罗丹明、单溴二胺、俄勒冈绿、藻红蛋白、SYTO、硫杂二羰花青(DiSC3)、硫磺素、X-罗丹明、C或四甲基罗丹明异硫氰酸酯。
放大器基团可以包含有机金属化合物、过渡金属络合物或配位络合物。此类放大器基团的实例包括但不限于以下中描述的那些： EP 0 180 492、EP 0 321 353、EP 0 539435、EP 0 539 477、EP 0 569 496、EP139675、EP64484、US 4,283,382、US 4,565,790、US4,719,182、US 4,735,907、US 4,808,541、US 4,927,923、US 5,162,508、US 5,220,012、US5,324,825、US 5,346,996、US 5,373,093、US 5,432,101、US 5,457,185、US 5,512,493、US5,527,684、US 5,534,622、US 5,627,074、US 5,696,240、US 6,100,394、US 6,340,744、US6,524,727、US 6,717,354、US 7,067,320、US 7,364,597、US 7,393,599、US 7,456,023、US7,465,747、US 7,625,930、US 7,854,919、US 7,910,088、US 7,955,859、US 7,968,904、US8,007,926、US 8,012,609、US 8,017,254、US 8,018,145、US 8,048,659、US 8,067,100、US8,129,897、US 8,174,001、US 8,183,586、US 8,193,174、US 8,221,719、US 8,288,763、US8,362,691、US 8,383,249、US 8,492,783、US 8,632,753、US 8,663,603、US 8,722,881、US8,754,206、US 8,890,402、US 8,969,862、US 9,012,034、US 9,056,138、US 9,118,028、US9,133,205、US 9,187,690、US 9,193,746、US 9,312,496、US 9,337,432、US 9,343,685、US9,391,288和US 9,537,107，所述专利整体引入作为参考。示例性的有机金属化合物、过渡金属络合物或配位络合物还包括例如国际公开号WO 2016/015027和国际申请号PCT/US16/42589中所述的那些，所述专利各自整体引入作为参考。
在一些实施方案中，放大器基团是镧系元素配位络合物，例如镧系元素(例如Eu或Tb)和四齿配体之间的络合物或镧系元素(例如Eu或Tb)和穴状配体之间的络合物。在一些实施方案中，放大器基团是镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钌(Ru)、铑(Rh)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)或铂(Pt)的配位络合物。在一些实施方案中，放大器基团是稀土金属的配位络合物，所述稀土金属共同指由以下组成的17种元素：从原子序数为57的镧到原子序数为71的镥的一组15种元素(镧系元素)、以及由原子序数为21的钪和原子序数为39的钇组成的两种另外元素。稀土金属的具体实例包括铕、铽、镧、铈、镨、钕、钷、钐、钆、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钪和钇。在一些实施方案中，放大器基团是镧系元素(例如铕或铽)与二亚乙基三胺四乙酸或穴状配体的配位络合物。
信号传导剂的具体实例包括但不限于包含以下的部分：
Eu-穴状化合物-马来酰亚胺
Eu-穴状化合物-NHS
Eu-穴状化合物-二胺
Eu-N1-ITC(Delfia)
Eu-N1-DTA
Eu-N1-氨基
Eu-N1-碘乙酰胺基
信号传导剂可以包含发光团(供体)，其特点在于发光量子效率高和发光衰减时间长(>100 ns)。示例性的发光团是钯、铑、铂、钌、锇、稀土(特别是铕和镧)的阳离子、金属有机络合物。这些金属有机络合物的有机部分可以由例如来自卟啉类、联吡啶类、菲咯啉类或其它杂环化合物的组的配体组成。
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含抗体(例如单克隆或多克隆)、修饰的抗体(例如生物素化的单克隆抗体、生物素化的多克隆抗体、铕螯合物-抗体、辣根过氧化物酶缀合的抗体)、抗体变体(例如Fab：片段，抗原结合(单臂)；F(ab')
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结构或由结构形成，所述结构包含抗体、凝集素、天然肽、合成肽、合成和/或天然配体、合成和/或天然聚合物、合成和/或天然糖聚合物、碳水化合物结合蛋白和/或聚合物、糖蛋白结合蛋白和/或聚合物、荷电的小分子、其它蛋白质、细菌噬菌体和/或适体。
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含放大器基团，其包含镧系元素配位络合物和/或酶和链霉抗生物素蛋白和/或抗体和/或适体。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含多克隆和/或单克隆抗体。
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含修饰的抗体。示例性的修饰的抗体包括生物素化的单克隆抗体、生物素化的多克隆抗体、铕螯合物-抗体和辣根过氧化物酶缀合的抗体。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含抗体变体。示例性的抗体变体包括Fab：片段，抗原结合(单臂)；F(ab')
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含WGA-生物素或多粘菌素B-生物素。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含合成和/或天然配体和/或肽。在一些实施方案中，配体和/或肽选自双(锌-二甲基吡啶胺)、TAT肽、丝氨酸蛋白酶、导管素(cathelicidins)、阳离子糊精、阳离子环糊精、水杨酸、赖氨酸及其组合。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含合成和/或天然聚合物和/或糖聚合物。在实施方案中，天然和/或合成聚合物是直链或支链的，并且选自支链淀粉、聚(
在一些实施方案中，能够与微生物表面结合的信号传导剂包含：抗体；和铕配位络合物。在一些实施方案中，能够与微生物表面结合的信号传导剂包含接头基团L，其包含NH
在一些实施方案中，能够与微生物表面结合的信号传导剂包含铕络合物，其包含：
可替代地，信号传导剂可以是一对的部分，例如FRET/TR-FRET供体和受体或由光敏剂和检测剂组成的单线态氧对。用这些信号传导剂设计的测定可能需要从初始生长培养基中分离微生物，伴随在添加信号传导剂之前的后续重悬浮于所需的反应缓冲液内。相反，由于生成信号所必需的相对距离，用这些信号传导剂设计的测定可能不需要分离步骤。
FRET/TR-FRET供体的实例包括但不限于含镧系元素(Eu、Sm、Dy或Tb)的有机金属穴状化合物(cryptate organometallic)(CisBio)、Lance Eu-W1024(Perkin Elmer)、Lance Eu- W8044(Perkin Elmer)，以及任何有机荧光对供体。
FRET/TR-FRET受体的实例包括但不限于匹配的有机染料，例如ULight染料(Perkin Elmer)、SureLight APC(Perkin Elmer)、别藻蓝蛋白、Cy5、d2染料(CisBio)，以及任何有机荧光对受体。
单线态氧光敏剂的实例包括但不限于methuselah Green Carboxy(Ursa Bio)、Sensitizer Blue(Ursa Bio)、孟加拉红、赤藓红B、亚甲基蓝、叶绿素、AlphaBead供体(Perkin Elmer)。
单线态氧检测剂的实例包括但不限于单线态氧检测剂绿色(singlet oxygendetector green)(ThermoFisher)、反式1-(2’-甲氧基乙烯基)芘、Si-DMA(Dojindo)、AlphaBead受体(Perkin Elmer)。
掺入剂的实例包括但不限于
实施例
大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的ATCC
对于5个样品中的每一个，以及作为对照的大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌McFarland，将25 μL等分试样加入96孔平板中的(1)100 μL Mueller-Hinton肉汤(MHB；Becton Dickinson)、(2)100 μL Voges-Proskauer肉汤(VPB；Sigma)、和(3)色氨酸[或蛋白胨]肉汤(TPB；Sigma)的每个中。将平板覆盖并且在定轨振荡条件下在35℃下孵育3小时。
在3.5小时的最初生长之后，将1-萘酚(Sigma)和氢氧化钾(Sigma)加入每个VPB孔中，并且将Kovac试剂(Sigma)加入每个TPB孔中。将样品放回培养箱中，用于另外30分钟的生长期。
在另外30分钟的生长期之后，将平板从培养箱中取出，并且读取VPB孔和TPB孔的吸光度(450-650nm)。吸光度结果呈现于图5中。然后将平板以3,500 ×
路邓葡萄球菌(由TriCore Reference Laboratories提供的临床分离株)和肺炎链球菌(ATCC® 49619)的样品在含5%裂解绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上，在35℃下过夜培养。对于每个物种，挑选3-5个菌落，并且在无菌盐水中制备0.5 McFarland接种物。通过根据下表组合接种物来制备五个样品：
对于5个样品中的每一个，以及作为对照的路邓葡萄球菌和肺炎链球菌McFarland，将25 μL等分试样加入96孔平板中的(1)100 μL Mueller-Hinton肉汤(MHB；Becton Dickinson)、(2)100 μL甘露醇盐肉汤(MSB；HiMedia)、和(3)选择性链球菌肉汤(SSB；Hardy Diagnostics)的每个中。将平板覆盖并且在定轨振荡条件下在35℃下孵育4小时。
在生长完成后，根据实施例1中的程序制备样品并生成MALDI-TOF质谱。
大肠杆菌(25922)和金黄色葡萄球菌(29213)的ATCC
对于5个样品中的每一个，以及作为对照的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌McFarland，将25 μL等分试样加入96孔平板中的(1)100 μL Mueller-Hinton肉汤(MHB；Becton Dickinson)、(2)100 μL甘露醇盐肉汤(MSB；HiMedia)、和(3)MacConkey肉汤(MCK；Sigma)的每个中。将平板覆盖并且在定轨振荡条件下在35℃下孵育4小时。
在生长完成后，根据实施例1中的程序生成样品并生成MALDI-TOF质谱。
通过以不同比率组合细菌悬浮液来制备多微生物混合物。这些悬浮液用于一式三份地接种96孔平板中的100 μl培养基。培养基包括非选择性(mueller hinton肉汤，MHB)、选择性(macConkey肉汤，MAC；甘露醇盐肉汤，MSB；西曲溴铵肉汤，CB；链球菌富集肉汤，SEB；Leads琼脂平板，LP；todd hewitt肉汤，THB)、以及鉴别性培养基(溴甲酚紫肉汤，BpB，含有蔗糖，Suc或阿拉伯糖，Ara)。为了进一步增强选择性，如指示的将抗生素溶葡萄球菌素或杆菌肽加入选择性培养基中。使接种的平板在环境空气培养箱中在37℃下孵育3至5小时。然后通过离心使细胞形成沉淀，并且用去离子水洗涤两次，然后在MALDI靶上点样1 μl浓缩细胞。然后用1 μl 70%甲酸上覆革兰氏阳性选择性样品。然后用1 μl HCCA基质上覆所有样品。将靶运送到JMI实验室，并且在Bruker BioTyper
机译： 快速微生物鉴定和抗微生物剂敏感性测试的仪器和系统
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