流体捕获芯片、单细胞捕获转移系统与单细胞分析方法

摘要

本发明公开了一种流体捕获芯片、单细胞捕获转移系统与单细胞分析方法，所述流体捕获芯片包括水平设置且为平板形的流体捕获芯片本体，所述流体捕获芯片本体具有细胞悬液进样口，且所述流体捕获芯片本体的下端具有多个间隔分布的单细胞捕获结构，且多个所述单细胞捕获结构均与所述细胞悬液进样口连通，所述细胞悬液进样口用以加入含有多个单细胞的单细胞悬液，所述单细胞捕获结构用以捕获单细胞悬液中任意一个单细胞，其结构简单，如此可通过细胞悬液进样口加入单细胞细胞悬液，而单细胞悬液在流经单细胞捕获结构时由单细胞捕获结构捕获，而多个单细胞捕获结构捕获多个独立的单细胞，从而实现少量单细胞的高效捕获。

说明书

技术领域

本发明属于单细胞分析技术领域，尤其涉及一种流体捕获芯片、单细胞捕获转移系统与单细胞分析方法。

背景技术

利用微流控技术分析单细胞具有独特的优势，其微米级的管道、纳升级的体系与细胞的尺度极为接近，十分接近于细胞在体内所处的环境；此外其高通量、平行化的阵列式分析进一步提升了其可信度和效率。然而，单细胞分析技术因其技术门槛高、操作复杂，仍未得到广泛的应用。

目前对于细胞个体的研究，尤其是单细胞分析技术，主要采用光镊技术、微液滴技术、流式细胞术、介电泳技术和光致介电泳技术、水流动力学捕获技术、微坑(井)技术和单细胞打印技术等。然而这些方法或多或少具有以下问题：1)随机性大：使用微液滴技术可以很好地对单细胞进行包裹，打断细胞间的相互交流，但该方法难以突破泊松分布的瓶颈，会有大量的空液滴生成，故随机性大，难以保证大多数单元都捕获到单细胞；微坑技术利用细胞随机沉降进入捕获位点，同样面临随机性大的问题；2)操作、装置复杂：使用光镊、介电泳和光致介电泳进行高精度单细胞捕获，其不仅面临着装置复杂、加工设计难、成本高等问题，同时也需考虑到操作复杂、通量低等问题；采用流式细胞术对单细胞进行高通量分析，其设备昂贵且需要定期养护，大多数实验室和临床检测机构难以承担；3)寻址性差、分析深度不够：利用微液滴技术和流式细胞术，将微液滴包裹单细胞进行高通量分析，其微液滴经过检测位点后，难以对分析的单细胞进行跟踪，就算收集分析后的单细胞，也难以将其与分析结果一一对应；其次，因其通量极高，单个细胞检测时间极短，难以对单细胞进行深度分析；4)培养空间不足：使用微液滴技术和水流动力学捕获的方式，单细胞捕获后被限制在极小空间内，难以得到充分的氧分、营养物质，同时代谢废物易于积累，难免影响细胞正常生长；5)易交叉污染：传统的水流动力学捕获技术和微坑(井)技术，以及单细胞打印技术，细胞往往暴露在同一溶质下，细胞间有进行旁分泌细胞间交流的可能，并非完全意义上的单细胞分析；6)易发生多细胞事件：近年来有多款双微井结构微流控系统被研发面世，其甚至结合有介电泳技术进行单细胞捕获与分析，但该类方法仍因细胞个体体积差异、流体运动等原因，难以避免地发生多细胞事件。

综上可知，单细胞分析有着十分广泛的生命科学和医学应用，并具有重大意义与价值。但在该技术的发展过程中仍有诸多难题和挑战；与之同时，现有的单细胞分析技术和设备也存在诸多不足。目前市场上急缺一款可以进行高通量、可寻址、微环境可控的单细胞阵列化、平行化深度分析，同时可对临床极少量样本进行高效单细胞分析的微流控系统。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的之一在于提供一种可用以从含有少量单细胞的悬液中捕获形成单细胞阵列的流体捕获芯片。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种流体捕获芯片，包括水平设置且为平板形的流体捕获芯片本体，所述流体捕获芯片本体具有用以加入含有多个单细胞的单细胞悬液的细胞悬液进样口，且所述流体捕获芯片本体的下端具有多个间隔分布的单细胞捕获结构，且多个所述单细胞捕获结构均与所述细胞悬液进样口连通，所述单细胞捕获结构用以捕获单细胞悬液中任意一个单细胞。

上述技术方案的有益效果在于：其结构简单，如此可通过细胞悬液进样口加入单细胞悬液，而单细胞悬液在流经单细胞捕获结构时由单细胞捕获结构捕获，而多个单细胞捕获结构捕获多个独立的单细胞，从而实现单细胞悬液中分离出多个单细胞。

上述技术方案中所述流体捕获芯片本体还包括水平间隔分布的培养基进样口和样品出口，且所述培养基进样口、细胞悬液进样口和样品出口均上下贯穿所述流体捕获芯片本体，且所述细胞悬液进样口靠近所述培养基进样口，所述流体捕获芯片本体的下端刻蚀有微流通道，且所述微流通道的两端分别与培养基进样口和样品出口贯通，且所述细胞悬液进样口与所述微流通道靠近所述培养基进样口的一端连通，多个所述单细胞捕获结构均刻蚀于所述流体捕获芯片本体的下端，且所述单细胞捕获结构具有进液口和出液口，多个所述单细胞捕获结构串联在所述微流通道上，并均位于所述细胞悬液进样口和样品出口之间。

上述技术方案的有益效果在于：其结构简单，如此使得微流细胞悬液与培养基混合，并在流经单细胞捕获结构时，由单细胞捕获结构捕获到单细胞，此时单细胞处于培养基的环境中，其能在整个过程中保持活力，同时进行新陈代谢。

上述技术方案中所述微流通道设有多个，每个所述微流通道位于所述细胞悬液进样口和样品出口之间的部分通道分别串联有多个单细胞捕获结构。

上述技术方案的有益效果在于：其结构简单，如此使得单细胞捕获结构的数量更多，能分离出更多的单细胞。

上述技术方案中多个所述单细胞捕获结构在所述流体捕获芯片本体的下端呈阵列分布。

上述技术方案的有益效果在于：其更加工整美观。

上述技术方案中所述单细胞捕获结构为水平刻蚀在所述流体捕获芯片本体的下端且水平截面呈“U”形的凹槽，所述单细胞捕获结构的两端分别为其进液口和出液口，其中部回折处为弯流部，且所述进液口和弯流部之间设有喇叭形的缺口，且所述缺口的细端与所述弯流部和出液口之间区域贯通，且所述缺口用以捕获单细胞。

上述技术方案的有益效果在于：其结构简单，且捕获性能好，在捕获单细胞时需在流体捕获芯片本体的下端垫设一层载板，以将所述流体捕获芯片本体的下端密封，并使得微流通道和单细胞捕获结构在载板的围合下形成一个流体通路。

本发明的目的之二在于提供一种结构简单，且分离效果佳，可分离得到单个细胞的单细胞捕获转移系统。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种单细胞捕获转移系统，包括玻璃通孔芯片和微槽阵列芯片和如上所述的流体捕获芯片，所述流体捕获芯片、玻璃通孔芯片和微槽阵列芯片由上向下依次水平设置且相互叠合，所述玻璃通孔芯片上具有多个上下贯穿其的微孔；所述微槽阵列芯片上凹设有多个微槽，且多个所述微孔、多个所述微槽和多个所述单细胞捕获结构分别一一对应，每个所述微孔与对应的所述微槽相互对齐，所述流体捕获芯片在外力作用下可在所述玻璃通孔芯片的上端水平移动至其上的单细胞捕获结构与对应的所述微孔错位分布以捕获单个细胞，或移动相互对齐以将所捕获的单个细胞经对应的所述微孔排放至对应的所述微槽内。

上述技术方案的有益效果在于：如此可利用流体捕获芯片在与玻璃通孔芯片处于错位的状态下，由流体捕获芯片的每个单细胞捕获结构分别从流体中捕获一个单细胞，然后将流体捕获芯片和玻璃通孔芯片对齐的状态下，使得单细胞捕获结构所捕获的单细胞经对应的微孔向下转移至微槽阵列芯片对应的微槽内，最终使得微槽阵列芯片的每个微槽内只有一个细胞，从而实现获得单细胞微阵列。

上述技术方案中所述微槽阵列芯片的上表面设有疏水层。

上述技术方案的有益效果在于：如此使得微槽阵列芯片只有微槽内会有装有单细胞的流体，微槽阵列芯片上表面保持清洁。

上述技术方案中所述疏水层为超疏水膜。

上述技术方案的有益效果在于：如此使得微槽阵列芯片的上表面的清洁度更佳，不会残留液体。

本发明的目的之三在于提供一种采用如上所述单细胞捕获转移系统的单细胞分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：取流体捕获芯片和玻璃通孔芯片，并将所述流体捕获芯片错位地叠放在所述玻璃通孔芯片上；

步骤2：向所述流体捕获芯片的培养基进样口内加入培养基，然后再利用毛细管取细胞悬液并插入到所述细胞悬液进样口中，所述毛细管中的细胞悬液经随培养基在微流通道中向所述样品出口流动，并由单细胞捕获结构捕获培养基中的单细胞；

步骤3：待培养基流动至样品出口时，取微槽阵列芯片并将其叠放在所述玻璃通孔芯片的下端，且使得所述玻璃通孔芯片的每个所述微孔分别与所述微槽阵列芯片上对应的微槽对齐；

步骤4：水平滑动所述流体捕获芯片至其单细胞捕获结构分别与对应的所述微孔对齐，以将所述单细胞捕获结构所捕获的单细胞经对应的所述微孔转移至对应的所述微槽内；

步骤5：待步骤4中单细胞转移完成后将微槽阵列芯片置于培养皿中进行单细胞培养。

上述技术方案的有益效果在于：该方法简便，且能确保每个单细胞捕获结构最多只能捕获一个单细胞，如此使得每个微槽内也最多只会出现一个细胞，其可灵活的实现对单细胞的捕获。

本发明的目的之四在于提供一种采用如上所述单细胞捕获转移系统或如上所述单细胞分析方法在药物筛选中应用。

附图说明

图1为本发明实施例1所述的流体捕获芯片的俯视图；

图2为本发明实施例1所述的单细胞捕获结构的放大图；

图3为本发明实施例1所述的流体捕获芯片的竖向截面图；

图4为本发明实施例2所述单细胞微流系统中流体捕获芯片和玻璃通孔芯片对齐的状态图；

图5为本发明实施例2所述单细胞微流系统中流体捕获芯片和玻璃通孔芯片错位时的状态图；

图6为本发明实施例2中所述玻璃通孔芯片的正视图；

图7为本发明实施例2中所述微槽阵列芯片的立视图；

图8为本发明实施例2中所述细胞悬液进样口的放大图。

图中：1流体捕获芯片本体、11细胞悬液进样口、12单细胞捕获结构、13培养基进样口、14样品出口、15微流通道、121进液口、122出液口、123弯流部、124缺口、2玻璃通孔芯片、21微孔、3微槽阵列芯片、31微槽。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

如图1-图3所示，本实施例提供了一种流体捕获芯片，包括水平设置且为平板形的流体捕获芯片本体1，所述流体捕获芯片本体1具有细胞悬液进样口11，且所述流体捕获芯片本体1的下端具有多个间隔分布的单细胞捕获结构12，且多个所述单细胞捕获结构12均与所述细胞悬液进样口11连通，所述细胞悬液进样口11用以加入含有多个单细胞的单细胞悬液，所述单细胞捕获结构12用以捕获单细胞悬液中任意一个单细胞，其结构简单，如此可通过细胞悬液进样口加入单细胞悬液，而单细胞悬液在流经单细胞捕获结构时由单细胞捕获结构捕获，而多个单细胞捕获结构捕获多个独立的单细胞，从而实现单细胞悬液中分离出多个单细胞。其中，所述细胞悬液进样口的孔径较小以能满足定量毛细管插入即可。

上述技术方案中所述流体捕获芯片本体1还包括水平间隔分布的培养基进样口13和样品出口14，且所述培养基进样口13、细胞悬液进样口11和样品出口14均上下贯穿所述流体捕获芯片本体1，且所述细胞悬液进样口11靠近所述培养基进样口13，所述流体捕获芯片本体1的下端刻蚀有微流通道15，且所述微流通道15的两端分别与培养基进样口13和样品出口14贯通，且所述细胞悬液进样口11与所述微流通道15靠近所述培养基进样口13的一端连通，多个所述单细胞捕获结构12均刻蚀于所述流体捕获芯片本体1的下端，且所述单细胞捕获结构12具有进液口121和出液口122，多个所述单细胞捕获结构12串联在所述微流通道15上，并均位于所述细胞悬液进样口11和样品出口14之间，其结构简单，如此使得微流细胞悬液与培养基混合，并在流经单细胞捕获结构时，由单细胞捕获结构捕获到单细胞，此时单细胞处于培养基的环境中，其能在整个过程中保持活力，同时进行新陈代谢。

上述技术方案中所述微流通道15设有多个，每个所述微流通道15位于所述细胞悬液进样口11和样品出口14之间的部分通道分别串联有多个单细胞捕获结构12，其结构简单，如此使得单细胞捕获结构的数量更多，能分离出更多的单细胞。

上述技术方案中多个所述单细胞捕获结构12在所述流体捕获芯片本体1的下端呈阵列分布，其更加工整美观。

上述技术方案中所述单细胞捕获结构12为水平刻蚀在所述流体捕获芯片本体1的下端且水平截面呈“U”形的凹槽，所述单细胞捕获结构的两端分别为其进液口121和出液口122，其中部回折处为弯流部123，且所述进液口121和弯流部123之间设有喇叭形的缺口124，且所述缺口的细端(即开口较小的一端)与所述弯流部123和出液口122之间区域贯通，且所述缺口124用以捕获单细胞，其结构简单，且能捕获性能好，在捕获单细胞时需在流体捕获芯片本体的下端垫设一层载板，以将所述流体捕获芯片本体的下端密封，并使得微流通道和单细胞捕获结构在载板的围合下形成一个流体通路。

实施例2

如图4-图7所示，本实施例提供了一种单细胞微流系统，包括由上向下依次水平设置且相互叠合的流体捕获芯片、玻璃通孔芯片2和微槽阵列芯片3，其中，所述流体捕获芯片采用如实施例1所示，所述玻璃通孔芯片2上具有多个上下贯穿其的微孔21；所述微槽阵列芯片3上凹设有多个微槽31，且多个所述微孔21、多个所述微槽31和多个所述单细胞捕获结构12分别一一对应，每个所述微孔21与对应的所述微槽31相互对齐，所述流体捕获芯片在外力作用下可在所述玻璃通孔芯片2的上端水平移动至其上的单细胞捕获结构12与对应的所述微孔21错位分布以捕获单个细胞，或移动相互对齐以将所捕获的单个细胞经对应的所述微孔21排放至对应的所述微槽31内，如此可利用流体捕获芯片在与玻璃通孔芯片处于错位的状态下，由流体捕获芯片的每个单细胞捕获结构分别从流体中捕获一个单细胞，然后将流体捕获芯片和玻璃通孔芯片对齐的状态下，使得单细胞捕获结构所捕获的单细胞经对应的微孔向下转移至微槽阵列芯片对应的微槽内，最终使得微槽阵列芯片的每个微槽内只有一个细胞，从而实现获得多个单细胞。其中，所述玻璃通孔芯片构成所述实施例1中所述载板。

上述技术方案中所述微槽阵列芯片3的上表面设有疏水层，如此使得微槽阵列芯片只有微槽内会有装有单细胞的流体，微槽阵列芯片上表面保持清洁。

优选的，上述技术方案中所述疏水层为超疏水膜，如此使得微槽阵列芯片的上表面的清洁度更佳，不会残留液体。

其中，优选的，所述流体捕获芯片、玻璃通孔芯片2和微槽阵列芯片3尺寸一致，且均为长方形板，且进一步优选的，在三者各边对齐时，每个缺口分别与对应的微孔和微槽对齐。其中，单细胞捕获结构捕获单细胞的原理是：在流体捕获芯片与玻璃通孔芯片错位的状态下，此时微流通道和单细胞捕获结构的下端均由玻璃通孔芯片封堵，此时微流通道和单细胞捕获结构组合形成一个流体通道，而含有单细胞的流体在流动至缺口处，由于出液口处流体的作用使得缺口的细端呈负压状，此时会将单个的细胞吸引到缺口的细端，但单个细胞的尺寸大于缺口细端的尺寸导致单个细胞截停在缺口的细端，如此实现单个细胞的捕获，而在将流体捕获芯片与玻璃通孔芯片对齐的状态下，此时每个缺口与对应的微槽经对应的微孔连通，此时缺口的处的流体会带动截停的单个细胞随对应的微孔向下流动至微槽内，从而实现将截停的单个细胞转移到微槽内。

在单细胞捕获结构捕获的单细胞转移至微槽中后，由于随单细胞转移的还有微量培养基，此时转移有单细胞的微槽内还具有培养基，使得单细胞在微槽内具备良好的生长发育环境。

其中，优选的，如图8所示，所述细胞悬液进样口呈喇叭形，且其开口较大端朝上，以满足定量毛细管插入为佳。

实施例3

本实施例提供了一种采用如实施例2所述单细胞捕获转移系统的单细胞分析方法，其包括如下步骤：

步骤1：取流体捕获芯片和玻璃通孔芯片2，并将所述流体捕获芯片错位地叠放在所述玻璃通孔芯片2上；

步骤2：向所述流体捕获芯片的培养基进样口13内加入培养基，然后再利用毛细管取细胞悬液并插入到所述细胞悬液进样口11中，所述毛细管中的细胞悬液经随培养基在微流通道15中向所述样品出口14流动，并由单细胞捕获结构12捕获培养基中的单细胞；

步骤3：待培养基流动至样品出口14时，取微槽阵列芯片3并将其叠放在所述玻璃通孔芯片2的下端，且使得所述玻璃通孔芯片2的每个所述微孔21分别与所述微槽阵列芯片3上对应的微槽31对齐；

步骤4：水平滑动所述流体捕获芯片至其单细胞捕获结构12分别与对应的所述微孔21对齐，以将所述单细胞捕获结构12所捕获的单细胞经对应的所述微孔21转移至对应的所述微槽31内；

步骤5：待步骤4中单细胞转移完成后将微槽阵列芯片3置于培养皿中进行单细胞培养。该方法简便，且能确保每个单细胞捕获结构最多只能捕获一个单细胞，如此使得每个微槽内也最多只会出现一个细胞，其可灵活的实现对单细胞的捕获。

其中，所述步骤2中在加入培养基之前，为了避免微流通道内具有气泡可先从培养基进样口中加入乙腈，待乙腈填充满微流通道后，从培养基进样口通入PBS缓冲液将微流通道中乙腈冲洗干净，然后再加入培养基，其中，优选的，所述流体捕获芯片的上端位于出样口处可连通一根引流管，如此可利用引流管将出样口排出的物料导流出去，避免物料污染流体捕获芯片的上端。

实施例4

本实施例提供一种采用如实施例2所述单细胞捕获转移系统或如实施例3所述单细胞分析方法在药物筛选中应用，尤其是在高通量或低通量药物筛选中的应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。