一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法

摘要

本发明提供的一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法，包括：组织预处理、组织切割、寻找活动精子、组织培养、分离组织、提取、配制悬液等步骤，本发明操作步骤简单明确易操作，减少外界污染的机会，可以高效解决现有技术中对睾丸组织切割不充分和睾丸组织浪费的问题，减少精子损失，增加获得单个活动精子的机会，对患者精子研究和临床辅助生育治疗极其重要。

说明书

技术领域

本发明涉及一种精子悬液的制备方法，特别涉及一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法。

背景技术

无精症是指射出的精液离心后使用显微镜观察，连续3次以上均未发现精子，不育人群中发生率为15％。其中，生精功能受损而导致生精障碍，称为非梗阻无精子症(NOA)，其治疗非常困难。在单精子卵胞浆内注射技术(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)出现以前，NOA患者只能通过供精方式生育子代。ICSI技术使仅有数个精子的患者也能拥有自己的孩子。所以对于NOA患者精子的收集和研究，需要通过外科取精手术获取睾丸组织进而获得活动精子。

经过近年的临床实践，发现通过显微镜下取精手术，可以获得微量的精子，提出睾丸内存在局部生精灶。通过显微取精手术所获得的可能含有精子的睾丸生精小管非常少，取得样本是微量的，一般长度小于0.5cm。目前，从睾丸组织获取精子的相关技术方法有两种，机械切碎法和酶消化法。酶消化法需要消化0.5-1个小时才能溶解生精小管管壁，耗时较长而且影响精子活力，不能快速获得活体精子且不损伤活体精子，不能充分满足试管婴儿对活体精子的要求。机械切碎法常使用玻片、注射针或穿刺针等进行切割，缺少专用的切割工具，存在切割的不细致而导致生精小管片段较大，切割效果差、切割效率低，不能保证活体精子从曲细精管里充分释放出来，造成组织浪费，进而降低获得活体精子的机会，影响精子悬液的制备效果。现有的相关专利、技术比较复杂，操作步骤较多，增加了外界污染的机会，并且使得微量的睾丸组织和活体精子粘附于装置而有所损失，缺少快速高效的获取活体精子并制成活体单精子悬液的制备方法，因此需要开发一种更高效的体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法，包括以下步骤：

(1)组织预处理：

将显微手术获得的睾丸组织立即放入盛有精子洗涤培养液的培养皿中，并用精子洗涤培养液清洗睾丸组织后备用；

(2)组织切割：

在培养皿中，将数块睾丸组织集中，使用两支本发明独创的睾丸组织体外切割手术刀的刀刃相互穿插、交错，不断切割、分离睾丸组织，直到肉眼可见的块状组织全部切碎；

(3)寻找活动精子：

在倒置显微镜下，观察上述培养皿内有无精子存在以及精子是否活动，发现足够后续手术所需量的活体精子即可结束睾丸切开的手术；

(4)组织培养：

把上述培养皿里切碎的组织，用巴氏吸管加入2ml-3ml精子洗涤培养液充分吹打混匀后，转移到无菌离心管A中，离心管管盖拧紧放置在37℃培养箱中过夜培养；

(5)分离组织：

将离心管A放入高速离心机，采用瞬时离心法去除睾丸组织切割后的碎片，所述的瞬时离心法具体操作为：启动离心后，当达到200g离心力时立即按停止键，待离心机停止转动，小心取出离心管A，用巴氏吸管吸取上清液转移到37℃预温的无菌离心管B中，离心管B中盛有3ml含体积比5％的人血清白蛋白的精子洗涤培养液；

(6)提取：

使用巴氏吸管将离心管B中组织液体充分吹打混匀，再放入高速离心机，用400g-600g离心力离心5分钟；离心停止后，使用巴氏吸管至上而下缓慢轻柔地吸取上清液并丢弃，保留0.3ml底部沉淀液体；

(7)配制悬液：

在离心管B中加入0.2ml-0.3ml含体积比5％的人血清白蛋白的精子洗涤培养液，用巴氏吸管轻轻地吹打混匀，尽量避免产生气泡，得到睾丸组织活体单精子悬液，然后取出5μl悬液置于细胞计数板上，观察到存在精子，且精子的活动情况和数量满足要求，即可放置到37℃培养箱中备用。

步骤(1)中所述的睾丸组织为男性无精症患者经过外科显微手术所获得可能含有精子的睾丸生精小管，长度不超过0.5cm。

步骤(2)中所述的睾丸组织体外切割手术刀包括刀头和刀柄，所述的刀头包括刀头本体和2-5片刃式刀片，所述的刀头本体前部为圆台形，后部为圆柱形，后端设有连接孔，所述的刃式刀片相互平行，并列设置在刀头本体的前端，刀片之间间隔2-4mm，刀刃呈倾斜状；所述的刀柄包括连接头和刀柄本体，连接头设在刀柄本体的前端；刀头的连接孔嵌套并紧固在刀柄的连接头上形成一体。

步骤(3)中使用倒置显微镜在200-400倍下从上到下S形逐层或者从左到右波浪形逐排查找并观察精子。

步骤(4)转移睾丸组织过程中，使用3ml巴氏吸管吸取睾丸组织转移至离心管A中，并用精子洗涤培养液冲洗培养皿1-2次，收集冲洗液至离心管A中，保证睾丸组织全部转移到离心管A中。

所述的离心管A和离心管B分别为15ml圆锥形底离心管。

本发明的有益效果：

本发明中首先使用精子洗涤培养液清洗干净可以减少组织中混入血细胞或其他杂物，使用两把本发明独创的睾丸组织体外切割手术刀把组织切碎，提高了睾丸组织切割的能力和睾丸组织利用效率，利于活体精子从生精小管内部完全释放出来，再转移到离心管中过夜培养提高精子的存活能力和活动能力，经过两次离心操作，收集到干净的精子悬液，第一次瞬时离心法可以把组织碎片或杂质排除掉，第二次离心对精子悬液进行提取，获得的精子悬液浓度和纯度更高。本发明操作步骤简单明确易操作，减少外界污染的机会，可以高效解决现有技术中对睾丸组织切割不充分和睾丸组织浪费的问题，减少精子损失，增加获得单个活动精子的机会，对患者精子研究和临床辅助生育治疗极其重要。

附图说明

图1为本发明睾丸组织体外切割手术刀的分解结构示意图；

图2为本发明睾丸组织体外切割手术刀的整体结构示意图；

图3为背景技术中现有的机械切碎方法切割的睾丸组织显微图片；

图4为本发明方法切割的睾丸组织显微图片；

1、刀片 2、刀头本体 3、连接孔 4、连接头 5、刀柄本体。

具体实施方式

本发明提供的一种体外睾丸组织活体单精子悬液的制备方法，包括以下步骤：

(1)组织预处理：

将显微手术获得的睾丸组织立即放入盛有0.5ml-1ml的精子洗涤培养液的培养皿中，并用0.5ml-1ml精子洗涤培养液重复清洗睾丸组织2次以上，清洗掉睾丸组织上的血细胞或其他杂物后备用；所述的睾丸组织为男性无精症患者可能含有精子的睾丸生精小管，长度一般不超过0.5cm，培养皿规格为35*10mm；

(2)组织切割：

在培养皿中，将采集的数块睾丸组织集中，使用两支本发明独创的睾丸组织体外切割手术刀对睾丸组织进行切割，切割过程为将两把刀的刀刃1相互穿插、交错，不断切割、分离睾丸组织，直到肉眼可见的块状组织全部切碎；

(3)寻找活动精子：

使用倒置显微镜，在200-400倍下从上到下S形逐层或者从左到右波浪形逐排查找并观察培养皿内有无精子存在以及精子是否活动，发现足够后续手术所需量的活体精子即可结束睾丸切开的手术；

(4)组织培养：

把上述培养皿里切碎的组织，用巴氏吸管加入2ml-3ml精子洗涤培养液充分吹打混匀后，转移到37℃预温的无菌离心管A中，并用0.5ml-1ml精子洗涤培养液冲洗培养皿1-2次，收集冲洗液至离心管A中，离心管管盖拧紧放置在37℃培养箱中过夜培养；

(5)分离组织：

将离心管A放入高速离心机，采用瞬时离心法去除睾丸组织切割后的碎片，所述的瞬时离心法具体操作为：启动离心后，当达到200g离心力时立即按停止键，待离心机停止转动，小心取出离心管A，用巴氏吸管吸取上清液转移到37℃预温的无菌离心管B中，离心管B中盛有3ml含体积比5％的人血清白蛋白的精子洗涤培养液；

(6)提取：

使用巴氏吸管将离心管B中组织液体吹打8-10次充分混匀，再放入高速离心机，用400g-600g离心力离心5分钟；离心停止后，使用巴氏吸管至上而下缓慢轻柔地吸取上清液并丢弃，保留0.3ml底部沉淀液体；

(7)配制悬液：

在离心管B中加入0.2ml-0.3ml含体积比5％的人血清白蛋白的精子洗涤培养液，用巴氏吸管轻轻地吹打混匀，尽量避免产生气泡，得到睾丸组织活体单精子悬液，然后取出5μl悬液置于细胞计数板上，观察到存在精子，且精子的活动情况和数量满足要求，即可放置到37℃培养箱中备用。

请参阅图1-2所示：步骤(2)中所述的睾丸组织体外切割手术刀包括刀头和刀柄，所述的刀头包括刀头本体2和2-5片刃式刀片1，所述的刀头本体2前部为圆台形，后部为圆柱形，后端设有连接孔3，所述的刀片1相互平行，并列设置在刀头本体2的前端，刀片1之间间隔2-4mm，刀刃呈倾斜状；所述的刀柄包括连接头4和刀柄本体5，连接头4设在刀柄本体5的前端；刀头的连接孔3嵌套并紧固在刀柄的连接头4上形成一体。

所述的离心管A和离心管B分别为15ml圆锥形底离心管。

所述的精子洗涤培养液为市售成品，其成分包括氯化钠、氯化钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、二水氯化钙、碳酸氢钠、无水葡萄糖、60％DL-乳酸钠、乙二胺四乙酸四钠盐(依地酸)、硫酸庆大霉素、牛磺酸、白蛋白(人体，25％溶液)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、丙氨酰-谷氨酰胺、氢氧化钠、10％盐酸、无菌水、丙酮酸钠、水溶性酚红等。

参阅图3-4所示可以看出，经过本发明方法及睾丸组织体外切割手术刀切割的睾丸组织更加细小，并且杂质少，有利于活体精子从曲细精管里充分释放，显著提高精子的分离和提取效果。