一种提高酰基辅酶A表达量的方法及其在发酵生产螺旋霉素过程中的应用

摘要

本发明属于生物医药领域，涉及一种提高酰基辅酶A合成相关基因转录水平和酰基辅酶A含量来增加螺旋霉素产量的方法。方法包括：(1)将菌种冷冻保藏管接种在种子培养基中；(2)将种子培养液转接至发酵培养基中，发酵培养，并在菌体发酵培养0h‑120h向培养液中加入酰基辅酶A合成前体；(3)加入酰基辅酶A合成前体后菌体至少培养24h；(4)收集步骤(3)获得菌体，进行酰基辅酶A合成基因转录水平和酰基辅酶A含量分析。本发明还包括这些方法在用放线菌生产大环内酯类次级代谢物过程中的应用。本发明的方法操作简易、成本低廉，能够大幅增加酰基辅酶A的合成量，使得螺旋霉素工业高产株的产量进一步提高。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种提高酰基辅酶A合成相关基因转录水平和酰基辅酶A含量从而提高螺旋霉素产量的方法。

背景技术

螺旋霉素(Spiramycin)是一种由生二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)或螺旋链霉菌(Streptomyces spiramyceticus)产生的16元大环内酯类抗生素，其化学结构主要由一个16元内酯环以及其上所连接的两个氨基糖福洛氨糖(Forosamine)、碳霉氨糖(Mycaminose)和一个中性糖碳霉糖(Mycarose)组成

螺旋霉素的产生过程中，16元环的生成通常被认为是主要的限制性因素。聚酮合酶Ⅰ (PKS)体系可催化基本酰基单元及延长单为聚合成内酯。前体物质短链脂肪酸可在酶的催化作用下转化成内酯环生成所需的基本酰基辅酶A单元，通常认为酰基辅酶A的生成是产生螺旋霉素大环的重要前体

图2为乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A的合成路径图。乙酰辅酶A由丙酮酸经丙酮酸脱氢酶(PDH)代谢生成，或乙酸在酰基辅酶A合成酶(ACS)的作用下生产，以及脂肪酸代谢生成。丙二酰辅酶A由丙二酸经过丙二酰辅酶A合成酶(MCS)和乙酰辅酶A经过乙酰辅酶A羧化酶(ACC)代谢生成。乙基丙二酰辅酶A由乙酰辅酶A代谢生成巴豆酰辅酶A或者巴豆酸经过酰基辅酶A合成酶(ACS)生成巴豆酰辅酶A，巴豆酰辅酶 A再经过巴豆酰辅酶A还原酶(CCR)生成乙基丙二酰辅酶A。甲基丙二酰辅酶A由琥珀酸经琥珀酸连接酶生产琥珀酰酰基辅酶A，再由琥珀酰辅酶A经过甲基丙二酰辅酶A变位酶(MCM) 代谢生成甲基丙二酰辅酶A；或者由支链氨基酸代谢及丙酸、丁酸代谢生成甲基丙二酰辅酶A 半醛，接着进一步生成代谢生成甲基丙二酰辅酶A；或由丙酸、乙基丙二酰辅酶A代谢生成丙酰辅酶A，再经过丙酰辅酶A羧化酶(PCC)作用生成甲基丙二酰辅酶A。

目前已有大量的研究来提高螺旋霉素产量，如菌种诱变及基因工程改造，代谢流调控，发酵工艺优化及培养基优化等。Ford等

以上研究均提高螺旋霉素的产量，但并未具体说明如何添加前体或改变菌株代谢以影响胞内酰基辅酶A的水平。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种提高细胞中的酰基辅酶A含量的方法。

本发明的要解决的第二个技术问题是使用上述提高酰基辅酶A合成相关基因转录水平的方法提高螺旋霉素的产量。

酰基辅酶A是由初级代谢产生，可用于次级代谢产物生成，是连接初级代谢与次级代谢的重要枢纽，酰基辅酶A等前体物质不足会限制螺旋霉素的生产。本发明在实践中发现，在发酵过程中添加酰基辅酶A合成前体物质能够提高螺旋霉素的产量，推测在螺旋霉素发酵时起始培养基中的营养物质不足，无法代谢生成充足的酰基辅酶A合成所需的相关前体物质，导致螺旋霉素产量较低；或者在螺旋霉素发酵起始营养物质充足，但随着发酵时间增加，在发酵前期菌体生长将酰基辅酶A合成的前体等物质被逐渐消耗，导致在发酵中后期螺旋霉素生产时所需的有机酸等前体物质无法满足酰基辅酶A合成。本发明通过在生二素链霉菌发酵产螺旋霉素过程中采取添加酰基辅酶A合成前体来针对性地增加胞内酰基辅酶A的量，进一步使得螺旋霉素工业生产菌株的产量提高。本发明在上述基础上完成。

一方面，本发明提供了一种提高细胞中酰基辅酶A合成相关基因转录水平的方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)将菌种冷冻保藏管中保藏的合成酰基辅酶A或者能够合成螺旋霉素的菌种接种在种子培养基中,27.0±2℃培养24-50h；

(2)按照2％-6％的接种量将种子培养液转接至发酵培养基中，26.0±2℃发酵培养132h-156h，并在细胞发酵培养0h-120h向培养液中加入酰基辅酶A合成前体；

(3)加入酰基辅酶A合成前体后菌体至少培养24h；

(4)收集步骤(3)获得菌体，进行酰基辅酶A合成基因转录水平检测和酰基辅酶A含量分析。

本发明还包括收集发酵液测定螺旋霉素效价的步骤。较好的，收集步骤(2)中发酵48h-156h的菌体发酵液检测螺旋霉素效价。

上述方法不仅能够提高酰基辅酶A合成相关基因转录水平，还能够提高细胞中酰基辅酶A的含量。

所述的酰基辅酶A合成相关基因选自：丙酮酸脱氢酶基因、基辅酶A合成酶基因、丙二酰辅酶A合成酶基因、巴豆酰辅酶A还原酶基因、琥珀酰辅酶A连接酶基因、甲基丙二酰辅酶A变位酶基因中的一种或者几种。

所述的提高细胞中酰基辅酶A合成相关基因转录水平包括提高酰基辅酶A合成相关基因的转录水平。

所述的菌体包括但不限于体外培养的各种表达酰基辅酶A合成相关基因的菌体，尤其涉及表达酰基辅酶A的菌种，以及产生螺旋霉素的菌种。所述的种子培养基是指适于所述的菌体生长的培养介质，包括固体或者液体状态的培养基等，通常种子培养基可供孢子发芽、菌体生长和大量繁殖。

所述的发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物的培养基介质，既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能大量生产螺旋霉素。

较好的，所述的方法还包括检测酰基辅酶A合成相关基因转录水平包括提高酰基辅酶A 合成相关基因的转录水平。

较好的，所述的检测酰基辅酶A合成相关基因转录水平的步骤是使用聚合酶链反应技术，例如RT-PCR或者普通PCR检测所述的检测酰基辅酶A合成相关基因的转录水平。

较好的，所述的酰基辅酶A合成前体物质包括但不限于：丙二酸、巴豆酸、乙酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、丁酸、丙酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。

较好的，加入酰基辅酶A前体物质的时间为菌体发酵培养0-120小时。更好的，加入酰基辅酶A合成前体物质的时间为菌体发酵培养0-60小时。例如，加入酰基辅酶A合成前体物质的时间在菌体发酵培养开始后的6、12、18、24、36、48、60、72、96、108小时。

另一方面，本发明还提供了一种提高酰基辅酶A含量的方法，包括使用上述方法提高细胞中酰基辅酶A合成相关基因的转录水平，然后提取所生成的酰基辅酶A。

在本发明的一个优选实施例中，使用三氯乙酸法提取酰基辅酶A，然后使用质谱仪鉴定酰基辅酶A并检测其含量。

较好的，所述的酰基辅酶A包括但不限于乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶 A、乙基丙二酰辅酶A等。

较好的，对合成酰基辅酶A的细菌使用上述方法，以提高酰基辅酶A的胞内积累量。

较好的，所述的表达酰基辅酶A的细菌包括但不限于生二素链霉菌、螺旋霉素链霉素、吸水链霉菌、红霉糖多孢菌。

再一方面，本发明还提供了上述方法的应用，即使用上述方法培养合成酰基辅酶A的细菌，提高酰基辅酶A的产量。

较好的，所述的合成酰基辅酶A的细菌同时能够产生螺旋霉素。

较好的，可以使用上述方法大规模培养合成酰基辅酶A和螺旋霉素的菌种，以提高螺旋霉素的产量。

本发明还提供了一种生产螺旋霉素的方法，在发酵合成螺旋霉素的菌种的培养基介质中加入酰基辅酶A合成相关的前体物质，所述的螺旋霉素是螺旋霉素I，其结构如下所示：

螺旋霉素是16元环大环内酯类抗生素，由生二素链霉菌发酵产生，在医药行业具有广泛的应用。螺旋霉素的产生过程中，16元环的生成通常被认为是主要的限制性因素。聚酮合酶(PKS)体系催化以乙酰辅酶A为起始单元，丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、甲氧基丙二酰-酰基载体蛋白为延伸单元聚合成内酯环。

本发明的实验结果表明，通过在发酵起始和发酵过程中向螺旋霉素工业生产株发酵培养基中添加与酰基辅酶A合成相关的前体物质来增加酰基辅酶A的供应来提高螺旋霉素的产量。在发酵初始和中段(例如，0h和48h)添加丙二酸、巴豆酸、乙酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、丁酸、丙酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等酰基辅酶A生成前体物质，其中添加效果较好的为：0h添加丙二酸使螺旋霉素效价提高31.5％；0h添加巴豆酸使螺旋霉素效价提高了21.4％；48h添加丙酮酸使螺旋霉素提高31.7％；发酵48h添加琥珀酸使效价提高28.8％。对前体物质添加后螺旋霉素效价增长较多的条件进行相关的酰基辅酶A测定，发现增加前体后使相关的酰基辅酶A含量增加。进一步使用RT-PCR对前体添加后相关酰基辅酶A合成的基因转录水平测定，发现前体添加后相关的酰基辅酶A合成的基因相对表达量上升，说明添加酰基辅酶A合成相关的有机酸前体可以增加酰基辅酶A的合成，进一步使得螺旋霉素的产量增加。

较好的，所述的菌种选自下列菌种之一：生二素链霉菌、螺旋霉素链霉素、吸水链霉菌、红霉糖多孢菌等。

较好的，生产螺旋霉素的方法包括以下步骤：

S1，在适合的培养介质中培养合成螺旋霉素的菌种，使其进入对数生长期；

S2，在发酵培养基中加入酰基辅酶A合成前体物质；

S3，收集发酵液；

S4，离心并分离获得螺旋霉素发酵上清液。

较好的，所述的方法还包括活化种子菌种的步骤。

其中，适合的培养介质是指适于培养合成螺旋霉素的菌种的培养基介质，例如培养基。又如培养生二素链霉菌、螺旋霉素链霉素、吸水链霉菌、红霉糖多孢菌等菌种的培养基。

活化种子菌种的步骤是指从装有合成螺旋霉素菌种的保种容器中取菌液接入到含有种子培养基的容器中，温度27.0±2℃下培养24-50小时。

较好的，含有种子培养基的容器是指烧瓶或者三角烧瓶。

较好的，所述的培养是三角烧瓶培养，转速为200-280rpm。

在本发明的一个优选实施例中，种子培养基的配方为(单位：g/L)：糊精25-65，黄豆饼粉5-15，玉米浆5-20，碳酸钙2-8，pH6.6-6.8。发酵培养基的配方为(单位：g/L)：糊精30-80，葡萄糖10-14，酵母粉1.5-3.5，硫酸铵1-3，磷酸二氢钾2-6，氯化钠2-4，硫酸锌0.5-1.5，硫酸镁0.5-1.5，氯化钴0.2-0.4，玉米浆15-25，碳酸钙10-18，豆油10-30，pH6.6-6.8。

在本发明的一个优选实施例中，所述的收集菌体的方法是：取发酵液，高速离心去沉淀，取上清液用流动相进行稀释，经0.22μm的滤膜过滤。

较好的，获得螺旋霉素后，使用色谱柱通过外标法检测螺旋霉素。

在本发明的一个优选实施例中，色谱柱及测试条件为：使用ZORBAX SB-C8色谱柱，流动相为9.3g/L高氯酸钠磷酸盐缓冲液：乙腈＝7:3；流速1mL/min，柱温30℃，检测波长232nm，进样量20μL。

本发明提供了一种提高酰基辅酶A合成相关基因转录水平、酰基辅酶A胞内积累量的方法，以及这些方法在发酵产螺旋霉素过程中的应用。本发明的方法不仅能够显著提高酰基辅酶A合成相关基因转录水平、酰基辅酶A胞内积累量,而且能够大幅提高螺旋霉素的产量。本发明的方法可以应用在用放线菌生产大环内酯类次级代谢物过程中,操作简易、成本低廉，能够大幅增加酰基辅酶A的表达量和螺旋霉素的产量。

附图说明

图1是螺旋霉素I合成路径图。

图2是乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A的合成路径图。

图3是添加前体物质相关酰基辅酶A测定。A：发酵48h添加丙酮酸；B：发酵0h添加丙二酸；C：发酵0h添加巴豆酸；D：发酵48h添加琥珀酸。

图4是RT-PCR对添加前体物质后相关酰基辅酶A合成途径基因转录水平测定。A：发酵48h添加丙酮酸；B：发酵0h添加丙二酸；C：发酵0h添加巴豆酸；D：发酵48h添加琥珀酸。

图5丙酮酸、乙酸对螺旋霉素发酵的影响。A：发酵起始添加不同浓度的丙酮酸、乙酸。 B：发酵48h添加0.1g/L的丙酮酸、1g/L的乙酸。(点划线位置代表CK效价20802U/mL)。

图6是丙二酸对螺旋霉素发酵的影响。A：发酵起始添加不同浓度的丙二酸。B：发酵48h添加0.025g/L的丙二酸。(点划线位置代表CK效价20137U/mL)。

图7是巴豆酸对螺旋霉素发酵的影响。A：发酵起始添加不同浓度的巴豆酸。B：发酵48h添加0.1g/L的巴豆酸。(点划线位置代表CK效价21497U/mL)。

图8是琥珀酸、丙酸、丁酸、缬氨酸对螺旋霉素发酵的影响。A：发酵起始添加不同浓度的丙琥珀酸、丙酸、丁酸、缬氨酸。B：发酵48h添加0.1g/L的琥珀酸、0.1g/L的丙酸、 0.1g/L的丁酸、2.4g/L的缬氨酸。(点划线位置代表CK效价19975U/mL)。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步的说明。

1.材料与方法

1.1材料和试剂

生二素链霉菌源自ATCC(Streptomyces ambofaciens CCTCC AA 2017001)，由本实验室保藏。糊精、玉米浆、黄豆饼粉、碳酸钙、酵母粉、豆油等为市售原材料。氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌，丙酮酸、乙酸、丙二酸、巴豆酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、缬氨酸等试剂均为国产分析纯，乙腈，甲醇为色谱级，购自国药。RT-PCR试剂盒购自TaKaRa 公司。乙酰辅酶A，丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、戊二酰辅酶A标品均购自于sigma Aldrich 公司，乙基丙二酰辅酶A购自于Cayman Chmical。

1.2培养基组分

种子培养基(g/L)：糊精25-65，黄豆饼粉5-15，玉米浆5-20，碳酸钙2-8，pH6.6-6.8。

发酵培养基(g/L)：糊精30-80，葡萄糖10-14，酵母粉1.5-3.5，硫酸铵1-3，磷酸二氢钾2-6，氯化钠2-4，硫酸锌0.5-1.5，硫酸镁0.5-1.5，氯化钴0.2-0.4，玉米浆15-25，碳酸钙10-18，豆油10-30，pH6.6-6.8。

1.3仪器和设备

高效液相色谱仪Agilent Technologies 1260Infinity(安捷伦科技有限公司)；摇床 SPH-3222(上海世平实验设备有限公司)；小型高速冷冻离心机Centrifuge5415-R(Eppendorf 公司)；实时荧光定量PCR仪CFX96(Bio-Rad公司)；Q-Exactive Plus MS/MS质谱仪(赛默飞世尔科技公司)；氮气吹干仪(上海那艾精密仪器有限公司)。

1.4实验方法

1.4.1培养方法

种子培养

从保种的甘油管中吸取1mL的菌液接入到含有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，转速200-280r/min、温度27.0±2℃下培养24-50h。

摇瓶发酵培养

以2％-12％的接种量将种子转入装有25mL发酵培养基的250mL三角烧瓶中，转速200-280r/min、温度26.0±2℃下发酵132-156h。

1.4.2分析方法

1.4.2.1菌体干重(DCW)测定

取10mL发酵液，1000rpm离心10min，弃上清，菌体用去离子水洗涤三次，在105℃烘箱内烘干，称重

1.4.2.2高效液相色谱(HPLC)法测定螺旋霉素效价与杂质含量

样品的处理：取发酵液1mL，12000r/min离心10min，取上清液用流动相进行稀释，经0.22μm的滤膜过滤后进样。

色谱柱及测试条件：ZORBAX SB-C8色谱柱(安捷伦科技有限公司)，250mm×4.6mm，5μm，流动相为9.3g/L高氯酸钠磷酸盐缓冲液：乙腈＝7：3；流速1mL/min，柱温30℃，检测波长232nm，进样量20μL，外标法测定螺旋霉素Ⅰ效价。

1.4.2.3RT-PCR对转录组数据验证

RNA提取、反转录及荧光定量PCR反应：取0.1g菌体用液氮研磨至粉末状，使用RNA提取试剂盒(Tiangen Biotech)对样本进行RNA抽提和基因组去除；然后使用反转录试剂盒(TaKaRa)按照37℃反应15min，85℃加热5s终止反应的流程进行反转录得到cDNA，-20℃保存cDNA。使用荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa)对样本表达量进行检测，反应按照95℃预变性1min；95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环的程序进行反应。本实验以2

1.4.2.4酰基辅酶A的提取与测定

三氯乙酸法(TCA)对酰基辅酶A的提取

色谱柱：Hypersil Gold C18色谱柱(赛默飞世尔科技有限公司)，3μm，100mm×2.1mm。测试条件

实施例1添加后酰基辅酶A合成前体后相关酰基辅酶A含量和基因转录水平测定

1.1添加酰基辅酶A合成前体后相关酰基辅酶A测定

为了研究上述前体物质对胞内酰基辅酶A合成量的影响，实验分别选取添加丙酮酸、丙二酸、巴豆酸、琥珀酸四种物质后对胞内代谢物进行酰基辅酶A分析。取发酵过程中螺旋霉素快速合成期(72h)和发酵后期(120h)样本进行酰基辅酶A提取分析，分析结果如图3所示。

如图3A所示，在螺旋霉素发酵48h添加丙酮酸，乙酰辅酶A的含量在72h相比其对照增加3.9倍；而在120h乙酰辅酶A的含量比其对照增加2.9倍。说明添加丙酮酸可以使乙酰辅酶A的含量特异性增加。如图3B所示，发酵0h添加丙二酸，丙二酰辅酶A的含量在发酵 72h相比其对照增加7倍；在120h丙二酰辅酶A含量比对照增加13.9倍，说明在培养基中添加丙二酸可以特异性提高丙二酰辅酶A含量。如图3C所示，发酵0h添加巴豆酸，乙基丙二酰辅酶A的含量在发酵72h相比于对照提高4.9倍，在发酵120h乙基丙二酰辅酶A的含量相比其对照增加1.6倍，因此说明添加巴豆酸可以特异性提高乙基丙二酰辅酶A的含量。如图3D所示，在发酵48h添加琥珀酸，甲基丙二酰辅酶A的含量在72h相比其对照提升12.3 倍，在120h甲基丙二酰辅酶A含量比对照增加14倍，因此添加琥珀酸可以特异性提升甲基丙二酰辅酶A的含量。

1.2 RT-PCR分析添加前体特对相关基因转录水平的影响

分别选取添加丙酮酸、丙二酸、巴豆酸、琥珀酸四种物质添加条件下样本进行酰基辅酶 A合成路径的基因转录水平进行分析。选取螺旋霉素发酵72h和120h的样本进行RNA提取，对丙酮酸脱氢酶基因(pdh)、基辅酶A合成酶基因(acsA)、丙二酰辅酶A合成酶基因(mcs)、巴豆酰辅酶A还原酶基因(ccr)、琥珀酰辅酶A连接酶基因(sucC)、甲基丙二酰辅酶A变位酶基因(mcmA)转录水平进行测定，结果如图4所示。

如图4A所示，在发酵48h添加丙酮酸后，pdh基因转录水平在72h和120h分别是对照的2.1倍和1.8倍，因此添加丙酮酸后可以促进pdh基因的转录水平增加。并且由图4A和图3A可知，pdh基因相对转录水平随发酵时间变化趋势与乙酰辅酶A相对含量随时间变化趋势一致，说明pdh基因的转录水平高低与乙酰辅酶A生成量具有相关性，。

如图4B所示，在发酵0h添加丙二酸后，mcs基因转录水平在72h和120h的分别是对照的2.5倍和3.4倍，因此添加丙二酸可以促进mcs基因转录水平增加。由图4B和图3B对比可知，mcs基因相对转录水平随时间变化趋势与丙二酰辅酶A相对含量随时间变化趋势一致，说明mcs基因的转录水平高低与丙二酰辅酶A生成的量具有相关性。

如图4C所示，在发酵0h添加巴豆酸后，acsA基因转录水平在72h和120h的分别是对照的5.5倍和1.1倍，ccr基因的转录水平分别是对照的4.7倍和0.7倍，因此添加巴豆酸可以增加acsA基因和ccr基因转录水平。并且由图4C和图3C可知，acsA基因和ccr基因相对转录水平随时间变化趋势与乙基丙二酰辅酶A相对含量随发酵时间增加变化趋势一致，说明acsA基因和ccr基因的表达水平高低与乙基丙二酰辅酶A生成的量具有相关性。

如图4D所示，在发酵48h添加琥珀酸后，sucC基因转录水平在72h和120h分别是对照的1.8倍和2.1倍，mcmA基因转录水平分别是对照的1.3倍和2.4倍，因此添加琥珀酸可以增加sucC基因和mcmA基因的转录水平。由图4D和图3D可知，sucC基因和mcmA基因相对转录水平随时间变化趋势与乙基丙二酰辅酶A相对含量随发酵时间增加变化趋势一致，说明sucC和mcmA基因的转录水平高低与甲基丙二酰辅酶A生成的量具有相关性，

实施例2添加不同酰基辅酶A合成前体对螺旋霉素发酵的影响

在螺旋霉素发酵起始和发酵过程中进行有机酸添加来提高胞内酰基辅酶A的含量增加螺旋霉素的生产。在发酵48h左右，菌体生长进入稳定期开始合成螺旋霉素，实验选择在发酵 0h或者发酵过程36-120h进行前体添加，以期促进螺旋霉素的发酵生产。

2.1添加乙酰辅酶A合成前体物质丙酮酸、乙酸对螺旋霉素生成的影响

乙酰辅酶A由丙酮酸、乙酸代谢、脂肪酸代谢生成，因此发酵起始分别向螺旋霉素发酵初始培养基中添加丙酮酸和乙酸来增加胞内乙酰辅酶A的量。在螺旋霉素发酵起始培养基中添加0.05g/L-0.2g/L丙酮酸，0.2g/L-1g/L的乙酸。由图5A可知丙酮酸的最适添加浓度为 0.1g/L的、乙酸的最适添加浓度为1g/L，其中丙酮酸添加使效价达到24627U/mL，比对照效价(20802U/mL)提高了18.3％，乙酸添加效价达到25480U/mL，相比对照增加了22.4％。选择乙酸、丙酮酸的最适添加浓度进行发酵过程添加，如图5B所示，在发酵过程48h添加0.1g/L 丙酮酸效价达到27340U/mL，比对照增加了31.4％，添加乙酸对螺旋霉素生产无明显影响。因此在发酵起始添加乙酸和丙酮酸、发酵过程添加丙酮酸均有利于螺旋霉素合成，其中发酵过程添加丙酮酸效果最好。

2.2添加丙二酰辅酶A前体合成物质丙二酸对螺旋霉素生产的影响

丙二酰辅酶A由丙二酸或乙酰辅酶A代谢生成，而乙酰辅酶A又由丙酮酸和乙酸代谢生成，因此考虑添加丙二酸、丙酮酸、乙酸的量来增丙二酰辅酶A的量，乙酸和丙酮酸的添加对螺旋霉素的影响如图5所示。在螺旋霉素发酵起始培养基中添加0.01g/L-0.1g/L丙二酸，结果如图6A所示，丙二酸的最适添加浓度为0.025g/L，在此浓度下螺旋霉素的效价达到26483U/mL，比对照效价(20137U/mL)提高了31.5％。选择对0.025g/L的丙二酸进行发酵过程中48h添加，结果如图6B所示，48h添加丙二酸螺旋霉素的效价达到25125U/mL，比对照产量提升23.6％。因此在发酵起始添加丙二酸，发酵过程添加丙二酸可使螺旋霉素产量提升。

2.3添加乙基丙二酰辅酶A合成前体巴豆酸对螺旋霉素生产的影响

乙基丙二酰辅酶A由巴豆酰辅酶A代谢生成，而巴豆酰辅酶A是巴豆酸在酰基辅酶A生成。因此向培养基中添加巴豆酸来提升胞内乙基丙二酰辅酶A的含量。在螺旋霉素发酵起始培养基上添加0.05g/L-0.5g/L的巴豆酸，结果如图7A所示，添加0.1g/L的巴豆酸最有效，螺旋霉素效价达到26097U/mL，与对照效价(21497U/mL)相比提高了21.4％。在发酵48h添加0.1g/L的巴豆酸，螺旋霉素效价达到24992U/mL与对照相比提高16.2％。因此在发酵初始和发酵过程中添加巴豆酸对螺旋霉素效价增长都有效，其中发酵初始添加巴豆酸效果最好。

2.4添加甲基丙二酰辅酶A合成前体物质琥珀酸、丙酸、丁酸、缬氨酸对螺旋霉素生产的影响

甲基丙二酰辅酶A由琥珀酰辅酶A、丙酰辅酶A等代谢产生。琥珀酰辅酶A由琥珀酸代谢生成；丙酰辅酶A由丙酸代谢生成；甲基丙二酰辅酶A由缬氨酸、丁酸代谢生成。因此向培养基中添加琥珀酸、丙酸、丁酸、缬氨酸来增加甲基丙二酰辅酶A的量。在发酵起始培养基中添加0.05g/L-0.5g/L的琥珀酸、0.1g/L-0.4g/L丙酸、0.05g/L-0.2g/L丁酸、 1.2g/L-4.8g/L缬氨酸。添加结果由图8A所示，琥珀酸的最适添加量为0.1g/L，此时螺旋霉素效价达到24768U/mL，比对照效价(19975U/mL)提高了23.9％；丙酸的最适添加量为0.1g/L，螺旋霉素效价达到23103U/mL，比对照增加了15.6％，丁酸的最适添加量为0.1g/L的丁酸，螺旋霉素的效价达到24336U/mL，比对照增加了21.2％；缬氨酸的最适添加量为2.4g/L，螺旋霉素的效价达到23037U/mL比对照增加了15.3％。选择最适添加浓度的琥珀酸、丙酸、丁酸、缬氨酸进行发酵过程添加，结果如图8B所示，在发酵48h添加琥珀酸螺旋霉素效价达到 25728U/mL；比对照增加了28.8％；添加丙酸使螺旋霉素效价达到25123U/mL，比对照增加了25.7％、添加丁酸使螺旋霉素效价达到24937U/mL，比对照增加了24.8％，添加缬氨酸使螺旋霉素效价达到缬氨酸效价达到25468U/mL，比对照增加了27.5％。因此在发酵初始和发酵过程添加琥珀酸、丙酸、丁酸、缬氨酸对螺旋霉素效价增长都有效，其中发酵过程添加琥珀酸效果最好。

由上述实施例结果可见，通过在发酵起始和发酵过程向螺旋霉素工业生产株发酵培养基中添加与酰基辅酶A合成相关的前体物质来增加酰基辅酶A的供应来提高螺旋霉素的产量。在发酵0h和48h添加丙二酸、巴豆酸、乙酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、丁酸、丙酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等酰基辅酶A生成前体物质对螺旋霉素产量提高皆有促进作用。其中添加效果较好的为：0h添加丙二酸使螺旋霉效价提高31.5％；0h添加巴豆酸使螺旋霉素效价提高了21.4％；48h添加丙酮酸使螺旋霉素提高31.4％；发酵48h添加琥珀酸使效价提高28.8％。分别选取添加丙酮酸、丙二酸、巴豆酸、琥珀酸四种物质添加条件进行相关的酰基辅酶A测定，发现增加酰基辅酶A合成前体后使相关的酰基辅酶A含量特异性增加。进一步使用RT-PCR 测定以上四种前体添加后相关酰基辅酶A合身的基因相对转录水平，发现添加后相关的酰基辅酶A合成的基因相对转录水平上升，说明添加酰基辅酶A合成相关的前体物质可以增加酰基辅酶A的合成，进一步使得螺旋霉素的产量增加。

上述相关说明以及对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些内容做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其它实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述相关说明以及对实施例的描述，本领域的技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

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