用于微卫星不稳定性检测的引物组合物、试剂盒及应用

摘要

本申请属于生物技术的领域，具体地说，本发明涉及用于微卫星不稳定性检测的引物组合物、试剂盒及应用。本申请提供了用于微卫星不稳定性检测的引物组合物，包括：第一引物组合、第二引物组合、第三引物组合、第四引物组合、第五引物组合和第六引物组合；引物组合依次为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12。本申请公开的用于微卫星不稳定性检测的引物组合物、试剂盒及应用，与免疫组化法和HRM法相比结果准确可靠，具有高敏感性、高特异性。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说，本发明涉及用于微卫星不稳定性检测的引物组合物、试剂盒及应用。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，在我国发病率和病死率呈上升趋势。微卫星不稳定性(MSI)是结直肠癌发病的重要原因，在预测肠癌患者预后及化疗反应方面也有重要作用，同时对Lynch综合征的诊断具有重要意义。微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)在多种恶性肿瘤中广泛存在，在结直肠癌、肺癌、肝癌、食管癌、淋巴瘤、泌尿系肿瘤、生殖系统肿瘤、儿童胚胎性肿瘤等肿瘤中已报道存在MSI。

近年来，微卫星不稳定性(MSI)的相关临床和基础方面研究取得较好的进展，对MSI与CRC的关系取得深入认识。2017年，美国国家癌症综合治疗联盟(NCCN)在《直肠癌临床实践指南》(2017.V2)指出：1)所有结直肠癌病史者均应行常规的MMR或MSI检查，以鉴定林奇综合症。2)MSI-H直肠癌Ⅱ期患者的预后较好且不能从5-FU辅助治疗获益。另外，2017年FDA批准新药Keytruda用于所有具有高度微卫星不稳定性(MSI-H)或者错配修复缺陷(dMMR)实体瘤患者的治疗。因此，临床上对MSI的检测需求日益增加。

目前，检测微卫星不稳定性的方法包括MMR蛋白免疫组化法、片段分析法、高效液相色谱技术、HRM法等。本专利中的检测方法是以荧光PCR为基础结合毛细管电泳的片段分析法来检测微卫星不稳定性，这是目前公认的金标准方法，采用本专利方法做的临床标本结果与免疫组化法和HRM法的比较，一致性较高。

发明内容

本申请提供了一种针对微卫星不稳定性状态的引物组、试剂盒及检测方法。为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

本申请第一方面提供了一种用于微卫星不稳定性检测的引物组合物，包括：

第一引物组合、第二引物组合、第三引物组合、第四引物组合、第五引物组合和第六引物组合；

第一引物组合包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

第二引物组合包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

第三引物组合包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；

第四引物组合包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；

第五引物组合包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；

第六引物组合包括SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。

具体的，

所述SEQ ID NO.1的碱基序列GAGTTGGCCCTAGACTTAGA；

所述SEQ ID NO.2的碱基序列TCCAAAGAGACAGCAGTTGG。

所述SEQ ID NO.3的碱基序列TGCAGCAGTCAGAGCCCTTA；

所述SEQ ID NO.4的碱基序列GCTTCTTCAGTATATGTCAATGAAAACA。

所述SEQ ID NO.5的碱基序列TGAATAAGCCACTGCCTGGT；

所述SEQ ID NO.6的碱基序列CCGCATTCACACTTTCTGGT。

所述SEQ ID NO.7的碱基序列TCCTGACTCCAAAAACTCTTCTCTT；

所述SEQ ID NO.8的碱基序列GCATTCCAACCTGGGTGACAGAGTG。

所述SEQ ID NO.9的碱基序列GATGTTTCTCCTGCCACCTG；

所述SEQ ID NO.10的碱基序列TCAACAGCAGAGACCTTGTCA。

所述SEQ ID NO.11的碱基序列CCAGCGTGGGAGACAGAGCAAGACT；所述SEQ ID NO.12的碱基序列TGCTAACATTCTAAGGCTAT。

另一些实施例中，所述SEQ ID NO.1、所述SEQ ID NO.3、所述SEQ ID NO.5、所述SEQ ID NO.7、所述SEQ ID NO.9和所述SEQ ID NO.11的5’端修饰有荧光基团。

另一些实施例中，所述荧光基团选自HEX、FAM或TMR中的一种。

另一些实施例中，所述SEQ ID NO.1的5’端修饰有HEX。所述SEQ ID NO.3的5’端修饰有FAM。所述SEQ ID NO.5的5’端修饰有FAM。所述SEQ ID NO.7的5’端修饰有TMR。所述SEQID NO.9的5’端修饰有HEX。所述SEQ ID NO.11的5’端修饰有TMR。

本申请第二方面提供了用于微卫星不稳定性检测的试剂盒，包括所述引物组合物，和PCR反应体系。

另一些实施例中，所述PCR反应体系包括：Buffer、dNTP、PCR扩增酶和无酶水。

另一些实施例中，所述试剂盒包括：

2-2.5μL的10×Buffer、2-2.5μL的dNTP、1-1.25μL的SEQ ID NO.1、1-1.25μL的SEQID NO.2、0.2-0.25μL的PCR扩增酶、无酶水加至20-25μL；

或，2-2.5μL的10×Buffer、2-2.5μL的dNTP、1-1.25μL的SEQ ID NO.3、1-1.25μL的SEQ ID NO.4、0.2-0.25μL的PCR扩增酶、无酶水加至20-25μL；

或，2-2.5μL的10×Buffer、2-2.5μL的dNTP、1-1.25μL的SEQ ID NO.5、1-1.25μL的SEQ ID NO.6、0.2-0.25μL的PCR扩增酶、无酶水加至20-25μL；

或，2-2.5μL的10×Buffer、2-2.5μL的dNTP、1-1.25μL的SEQ ID NO.7、1-1.25μL的SEQ ID NO.8、0.2-0.25μL的PCR扩增酶、无酶水加至20-25μL；

或，2-2.5μL的10×Buffer、2-2.5μL的dNTP、1-1.25μL的SEQ ID NO.9、1-1.25μL的SEQ ID NO.10、0.2-0.25μL的PCR扩增酶、无酶水加至20-25μL；

或，2-2.5μL的10×Buffer、2-2.5μL的dNTP、1-1.25μL的SEQ ID NO.11、1-1.25μL的SEQ ID NO.12、0.2-0.25μL的PCR扩增酶、无酶水加至20-25μL。

具体的，本申请的试剂盒使用过程中，将样本加入PCR反应体系中进行PCR反应，将得到的产物毛细管电泳，根据片段分析结果判断微卫星不稳定性状态。

具体的，所述样本为DNA模板，所述DNA模板来源于肿瘤组织石蜡切片或正常组织的石蜡切片或外周血。

具体的，将DNA模板加入PCR反应体系中，包括：

0.5-5μL的DNA模板、2-2.5μL的10×Buffer、2-2.5μL的dNTP、1-1.25μL的SEQ IDNO.1、1-1.25μL的SEQ ID NO.2、0.2-0.25μL的Taq酶、无酶水加至20-25μL；

或，0.5-5μL的DNA模板、2-2.5μL的10×Buffer、2-2.5μL的dNTP、1-1.25μL的SEQID NO.3、1-1.25μL的SEQ ID NO.4、0.2-0.25μL的Taq酶、无酶水加至20-25μL；

或，0.5-5μL的DNA模板、2-2.5μL的10×Buffer、2-2.5μL的dNTP、1-1.25μL的SEQID NO.5、1-1.25μL的SEQ ID NO.6、0.2-0.25μL的Taq酶、无酶水加至20-25μL；

或，0.5-5μL的DNA模板、2-2.5μL的10×Buffer、2-2.5μL的dNTP、1-1.25μL的SEQID NO.7、1-1.25μL的SEQ ID NO.8、0.2-0.25μL的Taq酶、无酶水加至20-25μL；

或，0.5-5μL的DNA模板、2-2.5μL的10×Buffer、2-2.5μL的dNTP、1-1.25μL的SEQID NO.9、1-1.25μL的SEQ ID NO.10、0.2-0.25μL的Taq酶、无酶水加至20-25μL；

或，0.5-5μL的DNA模板、2-2.5μL的10×Buffer、2-2.5μL的dNTP、1-1.25μL的SEQID NO.11、1-1.25μL的SEQ ID NO.12、0.2-0.25μL的Taq酶、无酶水加至20-25μL。

另一些实施例中，所述PCR反应体系的PCR扩增程序为：

第一阶段、95℃预变性5min；

第二阶段、94℃变性30s、61℃退火1min和70℃延伸1min，30个循环；

第三阶段、60℃延伸30min，4℃保持。

本申请第三方面提供了所述的引物组合物或所述试剂盒在检测肿瘤组织或正常组织或外周血的微卫星不稳定DNA中的应用。

具体的，所述应用包括对肿瘤组织或正常组织或外周血的DNA进行荧光PCR，产物毛细管电泳，根据片段分析法结果判断微卫星不稳定性状态。

具体的，所述应用包括：

将待测正常组织或外周血DNA样本、第一引物组合、Buffer、dNTP、PCR扩增酶和无酶水混合进行PCR，得到扩增产物；然后对扩增产物进行片段分析，得到待测正常组织的峰图；

将待测肿瘤组织DNA样本、第一引物组合、Buffer、dNTP、Taq酶和无酶水混合进行PCR，得到扩增产物；然后对扩增产物进行片段分析，得到待测肿瘤组织的峰图；

按照上述方法，获得第二引物组合、第三引物组合、第四引物组合、第五引物组合和第六引物组合的对应的待测正常组织和待测肿瘤组织的峰图；

比较肿瘤组织和正常对照的峰图，若肿瘤组织的显示出两个及以上的五指峰，而正常组织的峰图仅显示出一个五指峰，则表示该引物组合检测的位点为不稳定；反之，则表示该引物组合检测的位点为稳定。综合判断六组引物组合检测的位点的不稳定性状态，若两个或以上为不稳定，则该标本为MSI-H；若一个位点为不稳定，则该例标本为MSI-L；若所有位点均为稳定，则该标本为MSS。

经过临床标本验证，与免疫组化法和HRM法相比，本申请提供的用于微卫星不稳定性检测的引物组合物、试剂盒可稳定地、高灵敏地、高特异性地、准确地检测出微卫星不稳定性；本申请提供的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12引物无干扰峰，结果判读直观准确且易于判读。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本申请实施例提供的MSI-H结直肠癌患者肿瘤组织的峰图与正常组织的峰图，其中，A为第一引物组合扩增的第一检测位点，B为第二引物组合扩增的第二检测位点，C为第三引物组合扩增的第三检测位点，D为第四引物组合扩增的第四检测位点，E为第五引物组合扩增的第五检测位点，F为第六引物组合扩增的第六检测位点；

图2为本申请实施例提供的MSS结直肠癌患者肿瘤组织的峰图与正常组织的峰图，其中，A为第一引物组合扩增的第一检测位点，B为第二引物组合扩增的第二检测位点，C为第三引物组合扩增的第三检测位点，D为第四引物组合扩增的第四检测位点，E为第五引物组合扩增的第五检测位点，F为第六引物组合扩增的第六检测位点；

图3为本申请实施例提供的免疫组化法检测MSI-H肿瘤组织的dMMR结果图；其中，A为MLH1蛋白，B为MLH6蛋白，C为MSH2蛋白，D为PMS2蛋白；

图4为本申请实施例提供的免疫组化法检测MSS肿瘤组织的pMMR结果图；其中，A为MLH1蛋白，B为MLH6蛋白，C为MSH2蛋白，D为PMS2蛋白；

图5为本申请实施例提供的MSI-H结直肠癌患者肿瘤组织的HRM结果与正常组织的HRM结果；其中，A为第一检测位点的峰图，B为第二检测位点的峰图，C为第三检测位点的峰图，D为第四检测位点的峰图，E为第五检测位点的峰图，F为第六检测位点的峰图；

图6为本申请实施例提供的MSS结直肠癌患者肿瘤组织的HRM结果与正常组织的HRM结果；其中，A为第一检测位点的峰图，B为第二检测位点的峰图，C为第三检测位点的峰图，D为第四检测位点的峰图，E为第五检测位点的峰图，F为第六检测位点的峰图；

图7为本申请对比例提供的引物组合物G、引物组合物H和引物组合物I检测结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的峰图；

图8为本申请对比例提供的引物组合物J、引物组合物K和引物组合物L检测结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的峰图。

具体实施方式

下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

其中，以下实施例所用原料均为市售或自制；

下述实施例的结直肠癌患者肿瘤组织来源：中山大学附属第六医院手术切除肿瘤标本制备的石蜡切片。

结直肠癌患者的正常组织来源：中山大学附属第六医院手术切除癌旁远端正常组织制备的石蜡切片。

实施例1

本申请实施例提供了采用SEQ ID NO.1～12的检测试验，包括：

1、分别用第一引物组合SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；第二引物组合SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；第三引物组合SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；第四引物组合SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；第五引物组合SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；第六引物组合SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12的六对引物，配制如下六种反应体系：

表1

2、本申请实施例采用的样本来源及基因组DNA提取：所有结直肠癌患者肿瘤样本及其正常样本均来自中山大学附属第六医院病理科，收集组织，使用美基石蜡样本提取试剂盒对基因组DNA进行提取，得到对应的DNA模板。肿瘤和正常对照的DNA模板浓度分别调整至50-100ng/ul。

3、在步骤1的六种反应体系中分别加入1μl的肿瘤组织DNA模板、和1μl的正常组织DNA模板。使用普通PCR仪进行扩增，程序如下：

第一阶段、95℃预变性5min；

第二阶段、94℃变性30s、61℃退火1min和70℃延伸1min，30个循环；

第三阶段、60℃延伸30min，4℃保持。

4、将步骤3的肿瘤组织DNA模板、正常组织DNA模板的第一引物组合、第二引物组合和第三引物组合的PCR产物各取1μL，分别加入装有8.8μL甲酰胺(Hi-Di TM Formamide)和0.2μL GeneScan500LIZ size standard的96孔板孔内。再将肿瘤组织DNA模板、正常组织DNA模板的第四引物组合、第五引物组合和第六引物组合的PCR产物各取1μL，分别加入装有8.8μL甲酰胺(Hi-Di TM Formamide)和0.2μL GeneScan500LIZ size standard的96孔板孔内，混匀后95℃变性4min，立即放冰上4min，使用ABI 3500Dx仪器进行片段分析检测，分别得到采用第一引物组合、第二引物组合、第三引物组合、第四引物组合、第五引物组合和第六引物组合PCR的肿瘤组织、正常组织的产物峰图。

5、比较肿瘤组织和正常组织的峰图，若肿瘤组织的显示出两个及以上的五指峰，而正常组织的峰图仅显示出一个五指峰，则表示该引物组合检测的位点为不稳定；反之，则表示该引物组合检测的位点为稳定。综合判断六组引物组合检测的位点的不稳定性状态，若两个或以上为不稳定，则该标本为MSI-H；若一个位点为不稳定，则该例标本为MSI-L；若所有位点均为稳定，则该标本为MSS。本申请实施例的结果如图1和图2所示。

图1为本申请实施例提供的MSI-H结直肠癌患者肿瘤组织的峰图与正常组织的峰图，其中，A为第一引物组合扩增的第一检测位点，B为第二引物组合扩增的第二检测位点，C为第三引物组合扩增的第三检测位点，D为第四引物组合扩增的第四检测位点，E为第五引物组合扩增的第五检测位点，F为第六引物组合扩增的第六检测位点；从图1可知，与正常对照相比，MSI-H肿瘤组织六个引物组合产物均显示出两个或以上五指峰，为微卫星不稳定型。

图2为本申请实施例提供的MSS结直肠癌患者肿瘤组织的峰图与正常组织的峰图，其中，A为第一引物组合扩增的第一检测位点，B为第二引物组合扩增的第二检测位点，C为第三引物组合扩增的第三检测位点，D为第四引物组合扩增的第四检测位点，E为第五引物组合扩增的第五检测位点，F为第六引物组合扩增的第六检测位点；从图2可知，与正常对照相比，MSS肿瘤组织六个引物组合产物均只显示出一个五指峰，为微卫星稳定型。

实施例2

本申请实施例提供了采用SEQ ID NO.1～12引物组合物与现有免疫组化法的检测试验，包括：

1、取302对组织样本(即结直肠癌患者肿瘤组织及其对应正常组织，编号1-302)，所用的结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织石蜡样本均来自于中山大学附属第六医院病理科。免疫组化法与本申请实施例采用相同的肿瘤组织蜡块。免疫组化法参照本领域常规操作步骤，此处不具体赘述。

2、按照本申请实施例1中所述方法分别提取基因组DNA。步骤如实施例1，分别用第一引物组合SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；第二引物组合SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；第三引物组合SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；第四引物组合SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；第五引物组合SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；第六引物组合SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12的六对引物配成的体系，分别对302对组织样本一一进行检测。

3、对上述302对组织样本均进行了两种方法的检测，免疫组化法检测MLH1、MLH6、MSH2和PMS2蛋白的表达情况，dMMR即为片段法的MSI-H，dMMR为肿瘤组织的MLH1、MLH6、MSH2或PMS2蛋白任意一个不表达。pMMR即为片段法的MSS，pMMR为肿瘤组织的MLH1、MLH6、MSH2和PMS2蛋白均表达。本申请实施例提供的免疫组化法结果如图3～4所示，其中，图3为本申请实施例MSI-H肿瘤标本的免疫组化法检测为dMMR的结果图，图3和图4中A为MLH1蛋白、B为MLH6蛋白、C为MSH2蛋白、D为PMS2蛋白。

从图3可知，MLH1蛋白不表达，MLH6蛋白表达，MSH2蛋白表达，PMS2蛋白不表达；图4为本申请实施例MSS肿瘤标本的免疫组化法检测为pMMR的结果图，4个蛋白均表达。统计两种方法一致率，本申请提供的试剂盒与免疫组化结果一致率为96.03％，结果比对如表2所示。

表2本申请的引物组合物与免疫组化法的检测结果比较

由表2结果可知：302对标本中，本申请方法灵敏度为93.33％，特异性为97.8％，与免疫组化结果一致率为96.03％。不一致率与文献报道接近，本申请的SEQ ID NO.1～12引物组合物能满足临床需求。

实施例3

本申请实施例提供了采用SEQ ID NO.1～12引物组合物与现有HRM法的检测试验，包括：

1、取104对待测组织样本(即结直肠癌患者肿瘤组织及其对应正常组织，编号1-104)，所用的结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织石蜡样本均来自于中山大学附属第六医院病理科。HRM法(高分辨熔解曲线分析法)参照本领域常规操作步骤，此处不赘述。

其中，图5为本申请实施例提供的MSI-H结直肠癌患者肿瘤样本的HRM结果与正常组织的HRM结果；其中，A为第一检测位点，B为第二检测位点，C为第三检测位点，D为第四检测位点，E为第五检测位点，F为第六检测位点。

图6为本申请实施例提供的MSS结直肠癌患者肿瘤样本的HRM结果与正常组织的HRM结果；其中，A为第一检测位点，B为第二检测位点，C为第三检测位点，D为第四检测位点，E为第五检测位点，F为第六检测位点。

2、对待测组织样本均进行了两种方法的检测，本申请实施例提供了采用SEQ IDNO.1～12引物组合物与HRM法结果一致率为100％，结果比对如表3所示。

表3本申请的引物组合物与HRM法的检测结果比较

对比例1

本申请提供了采用不同引物组合检测微卫星不稳定性试验，包括：

按实施例1的方法取实施例1的结直肠癌患者肿瘤组织及正常组织。分别采用表4的引物组合物G、引物组合物H、引物组合物I、引物组合物J、引物组合物K和引物组合物L检测肿瘤组织及正常组织的微卫星不稳定性。

第一引物组合扩增的第一检测位点，第二引物组合扩增的第二检测位点，第三引物组合扩增的第三检测位点，第四引物组合扩增的第四检测位点，第五引物组合扩增的第五检测位点，第六引物组合扩增的第六检测位点。

取第一检测位点的另一位置的引物组合物G，引物组合物G包括上游引物SEQ IDNO.13和下游引物SEQ ID NO.14。

取第二检测位点的另一位置的引物组合物H，引物组合物H包括上游引物SEQ IDNO.15和下游引物SEQ ID NO.16。

取第三检测位点的另一位置的引物组合物I，引物组合物I包括上游引物SEQ IDNO.17和下游引物SEQ ID NO.18。

取第四检测位点的另一位置的引物组合物J，引物组合物J包括上游引物SEQ IDNO.19和下游引物SEQ ID NO.20。

取第五检测位点的另一位置的引物组合物K，引物组合物K包括上游引物SEQ IDNO.21和下游引物SEQ ID NO.22。

取第六检测位点的另一位置的引物组合物L，引物组合物L包括上游引物SEQ IDNO.23和下游引物SEQ ID NO.24。

图7和图8为采用上述引物组合物，按实施例1的方法进行实验所得的结果。实验证明，同一检测位点不同位置的引物，即引物组合物G、引物组合物H、引物组合物I、引物组合物J、引物组合物K和引物组合物L均为非特异性引物，会对结果判读造成干扰。

表4采用以下6对引物的检测峰图比较

表4引物测试结果显示，非特异性引物会对结果判读造成干扰。可见，只有本申请提供的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12引物无干扰峰，结果判读直观准确且易于判读。

本申请公开了一种检测微卫星不稳定性状态的引物组、试剂盒及检测方法，其是分别以肿瘤组织和正常组织或外周血的DNA作为模板，采用如SEQ ID NO.1～NO:12所示碱基序列的引物对进行PCR反应，产物进行片段分析以检测微卫星不稳定性状态。本申请提供的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12经过临床标本验证，与免疫组化法和HRM法相比，结果准确可靠，具有高敏感性、高特异性。

以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

序列表

<110> 中山大学附属第六医院

<120> 用于微卫星不稳定性检测的引物组合物、试剂盒及应用

<130> MP21006921

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagttggccc tagacttaga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccaaagaga cagcagttgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcagcagtc agagccctta 20

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcttcttcag tatatgtcaa tgaaaaca 28

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgaataagcc actgcctggt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgcattcac actttctggt 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcctgactcc aaaaactctt ctctt 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcattccaac ctgggtgaca gagtg 25

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatgtttctc ctgccacctg 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaacagcag agaccttgtc a 21

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccagcgtggg agacagagca agact 25

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgctaacatt ctaaggctat 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cctccaagaa tgtaagtggg a 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggctctaaaa tgctctgttc tca 23

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tattgcagca gtcagagccc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcactctggc ctagggaaca 20

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tggcacagtt ctatttttat attta 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cactttctgg tcactcgcgt ttaca 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tcctgactcc aaaaactctt ctctt 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcattccaac ctgggtgaca gagtg 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

caacgtctgt gagatccagg aaacc 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tactagcaat gaccaataag caagt 25

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gatcgagacc atcctggcta 20

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ttcttaaggg tggatcaaat ttc 23