用于治疗酒精使用障碍的试剂

摘要

本发明涉及PPARα激动剂化合物用于预防、减轻、改善和/或治疗酒精使用障碍的用途。

说明书

技术领域

本发明被包含在医学和药学领域，并且涉及PPARα(过氧化物酶体增殖物激活受体α)激动剂化合物与至少一种CB1受体(大麻素受体)拮抗剂和/或与PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)激动剂联合用于预防、减轻、改善和/或治疗酒精使用障碍的用途。

背景技术

社会上流行饮酒。根据有关西班牙酒精和其他药物的最新调查(Encuesta SobreAlcohol y Otras Drogas

发病率和死亡率的主要原因之一是，市场上很少有可用的药品能够帮助抵抗这种毁灭性的慢性疾病。多种信号传导系统与酒精使用有关，包括多巴胺、血清素、去甲肾上腺素、谷氨酸、阿片类肽、痛敏肽或促肾上腺皮质激素释放因子[Koob GF.2014.Handb ClinNeurol.125:33-54]。慢性酗酒导致这些神经递质系统失衡，已经试图用现今可用的疗法对其进行纠正。实际上，鸦片拮抗剂纳曲酮(naltrexone)和纳美芬(nalmefene)或NMDA谷氨酸受体拮抗剂阿坎酸(acamprosate)就是这种情况。但是，目前批准的药品仅针对响应于这些药物的患者亚群，并且它们仅涵盖所有患者中受酒精使用障碍影响的一部分。缺乏满足AUD患者治疗需求的替代疗法。

在受酒精影响的多种信号传导系统中，已证明与内源大麻素有关的脂质(花生四烯酸、2-AG、酰基乙醇酰胺和其他花生四烯酸衍生物)参与酒精成瘾周期的不同步骤，包括中毒、酒精寻求行为、戒断后复饮。他们还参与与酒精成瘾相关的焦虑和情绪障碍、酒精引起的神经炎症或酒精相关肝病(Serrano等人.Neuropsychopharmacology.43,pages 1840-1850(2018))此外，遗传学研究已经鉴定出编码参与内源大麻素信号传导的蛋白质的基因中与酒精使用障碍相关联的遗传变体。这一发现证实了该信号传导系统在引发和维持酒精使用中的重要作用。

基于这些发现，多种药物化学程序已经生产出与内源大麻素系统有关的特定药物，这些药物已被用于酒精使用障碍的临床前模型中。它们包括：

a)大麻素CB1受体激动剂和拮抗剂，

b)大麻素CB2受体激动剂和拮抗剂，

c)过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)激动剂，

d)过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂，

e)脂肪酰胺水解酶(FAAH，主要的内源大麻素降解酶之一)抑制剂，或

f)内源大麻素重摄取抑制剂(例如AM404)。

但是，迄今为止，尚未对使用联合治疗的策略进行测试，这可能是由于以下事实：使用两种独立的化学实体产生的可能的不希望的副作用可能大于使用单种药物产生的可能的不希望的副作用。

附图说明

图1.OLHHA短期施用后大鼠中酒精自我施用的剂量依赖性抑制作用。结果以自我施用响应占对照组的百分比相对于Log[OLHHA剂量，mg/kg]表示。借助非线性回归计算EC50值。A.PPARγ激动剂环格列酮(ciglitazone)、B.内源PPARα配体油酰乙醇胺、C.合成的PPARγ激动剂WY14643、D.大麻素CB1受体拮抗剂/反向激动剂利莫那班的作用。

图2.A.Wistar大鼠中1mg/kg的NF 10-360对使用双瓶偏好实验(two-bottlechoice paradigm)的作用。B.Wistar大鼠中1mg/kg的NF 10-360对酒精自我施用的作用。数据表示为平均值±SEM。与溶媒对比，*P<0.05。

图3.A.图3A和3B显示了成年雄性Wistar大鼠中PPARα激动剂和CB1受体拮抗剂OLHHA对乙醇自我施用的作用(图3A和3B)。图3C至3F显示了每天施用5mg/kg OLHHA在施用2、8和24小时后的作用。注射2小时后，OLHHA减少了饮酒，F(1.14)＝39.5，P<0.0001(图3C)。施用OLHHA 8小时后，也观察到了该作用，F(1.14)＝23.9，P<0.001(图3D)，24小时后该作用几乎消失，F(1.14)＝4.7，P＝0.047(图3E)。整个OLHHA治疗期间，总酒精摄入显著减少，在任何情况下，F(1.14)＝5.1，P<0.05(图3F)。最后，图3G显示了在Long-Evans大鼠中OLHHA对鸦片氧可酮的自我施用的作用。使用非线性回归测量EC50值。数据表示为平均值±SEM。与溶媒对比，*P<0.05。

图4.msP大鼠或20％水中血浆葡萄糖(A)、甘油三酯(B)、胆固醇(C)、尿酸(D)、尿素(E)和肌酸酐(F)水平，所述大鼠每天用5mg/kg溶媒或OLHHA处理。相同动物中转氨酶活性(小图G和小图H)以及细胞因子IL-6(I)和TNF-α(J)的血浆浓度。小图K到小图O，为OLHHA处理后肝脏中主要产脂肪酶[乙酰辅酶A羧化酶(ACACa，小图K)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD-1，小图L)和脂肪酸合酶(Fasn，小图M)]、细胞色素C氧化酶4(N)和核受体PPARα(O)的mRNA表达。数据表示平均值±SEM。与溶媒对比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

发明内容

如示例所示，本发明的作者证明了结合两种药理学特征的药物具有累加/协同药理作用，从而减少了酒精摄入。

本发明的化合物的医学用途

因此，本发明的第一方面涉及一种包含至少一种PPARα激动剂和至少一种CB1受体拮抗剂的组合制剂，下文中称为本发明的第一组合制剂，所述组合制剂用于预防、减轻、改善和/或治疗酒精使用障碍。

在本发明中，酒精使用障碍包括使用的影响以及滥用的影响。

术语“组合制剂”或在本文中也称为“并置(juxtaposition)”意指组合制剂的组分不必作为掺合物(例如作为真实的组合物)存在，即其组合、单独或按时间顺序应用是可以的。因此，表述“并置的”意味着由于组分的物理分离而不一定是真正的组合。

在本发明该方面的优选实施方式中，本发明的第一组合制剂包含至少一种PPARα激动剂和至少一种CB1受体拮抗剂(优选作为仅有的活性成分)，尽管所述制剂可以另外包含药理学可接受的赋形剂和溶媒。

在本发明该方面的另一种优选实施方式中，本发明的第一组合制剂的PPARα激动剂选自由以下组成的清单：氯贝特(clofibrate)、吉非罗齐(gemfibrozil)、非诺贝特(fenofibrate)、elafibranor、普拉睾酮(prasterone)、环丙贝特(ciprofibrate)、油酰乙醇胺、CP 775146、GW 7647、WY 14643、或其任何盐(优选其任何药学上可接受的盐)、或药学上可接受的酯、互变异构体、多晶型物或水合物、或异构体、前药、溶剂化物或类似物，或其任何组合。

在本发明该方面的另一种优选实施方式中，本发明的第一组合制剂的CB1受体拮抗剂选自拮抗剂AVE-1625、CP-945598、SLV319、V24343 AM 251、AM 4113、AM 6545、CP945598盐酸盐、MJ 15、NIDA41020、PF 514273、(±)-SLV 319、丙帕他莫(propacetamol)、四氢次大麻酚(tetrahydrocannabivarin)或选自AM 281、加压素、LY 320135、SR 141716A、TC-C 14G的反向激动剂、或其任何盐(优选其任何药学上可接受的盐)、药学上可接受的酯、互变异构体、多晶型物、或水合物、或异构体、前药、衍生物、溶剂化物、或类似物，或其任何组合。

尽管两种药物的组合使用可以提供累加/协同作用，但使用两种独立的化学实体产生的可能的不希望的副作用可能大于使用具有双重特征的单种药物产生的可能的不希望的副作用。双重配体(即作用于两种不同药理学靶标的单个分子)的鉴定和使用可提供安全性和功效方面的优势。

因此，本发明第一方面的更优选的实施方式涉及同时表现PPARα激动剂活性和CB1受体拮抗剂活性的化合物，下文中称为本发明的第一化合物，所述化合物用于预防、减轻、改善和/或治疗酒精使用障碍。更优选地，该化合物是式(I)的化合物，或其任何盐(优选其任何药学上可接受的盐)、或药学上可接受的酯、互变异构体、多晶型物、或水合物、或异构体、前药、溶剂化物、或类似物，或其任何组合：

式(I)N-[1-(3,4-二羟基苯基)丙-2-基]油酰胺(OLHHA)

式(III)中包括其他同时表现PPARα激动剂活性和CB1受体拮抗剂活性的化合物

其中

X和Y可以独立地相同或不同，并且选自H、卤素和甲基；

n为1至4的整数；

R

R

R

R

其中：

R

R

或其任何盐(优选其任何药学上可接受的盐)、或药学上可接受的酯、互变异构体、多晶型物、或水合物、或异构体、前药、溶剂化物、或类似物，或其任何组合。

此外并且与先前描述的无关地，本发明的作者证明了同时激活PPARα和PPARγ受体在减少酒精寻求行为上会产生累加/协同作用。

因此，本发明的第二方面涉及一种包含至少一种PPARα激动剂和至少一种PPARγ激动剂的组合制剂，下文中称为本发明的第二组合制剂，所述组合制剂用于预防、减轻、改善和/或治疗酒精使用障碍。

在本发明该方面的优选实施方式中，本发明的第二组合制剂包含优选至少一种PPARα激动剂和至少一种PPARγ激动剂(作为仅有的活性成分)，尽管所述制剂可以另外包含药理学可接受的赋形剂和溶媒。

在本发明该方面的另一种优选实施方式中，本发明的第二组合制剂的PPARα激动剂选自由以下组成的清单：氯贝特、吉非罗齐、非诺贝特、elafibranor、普拉睾酮、环丙贝特、油酰乙醇胺、CP 775146、GW 7647、WY 14643，或其任何盐(优选其任何药学上可接受的盐)、或药学上可接受的酯、互变异构体、多晶型物、或水合物、或异构体、前药、溶剂化物、或类似物，或其任何组合。

在本发明该方面的另一种优选实施方式中，本发明第二组合制剂的PPARγ激动剂选自由以下清单组成的组：(2S)-2-(4-氯苯氧基)-3-苯基丙酸、(2S)-2-(联苯-4-基氧基)-3-苯基丙酸、(2S)-2-乙氧基-3-{4-[2-(10H-苯噁嗪-10-基)乙氧基]苯基}丙酸、(S)-3-(4-(2-咔唑-9-基乙氧基)-苯基)-2-乙氧基-丙酸、2-氯-5-硝基-N-苯基苯甲酰胺、2-{5-[3-(7-丙基-3-三氟甲基苯并[D]异噁唑-6-基氧基)丙氧基]吲哚-1-基}乙酸、3-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙酸、3-[5-(2-硝基戊-1-烯-1-基)呋喃-2-基]苯甲酸、3-氟-N-[1-(4-氟苯基)-3-(2-噻吩基)-1H-吡唑-5-基]苯磺酰胺、巴柳氮(balsalazide)、格列吡嗪(glipizide)、美沙拉嗪(mesalazine)、米格列奈(mitiglinide)、那格列奈(nateglinide)、瑞格列奈(repaglinide)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、T131、替米沙坦、baroxolone、噻唑烷酮、15-脱氧δ12,14-前列腺素J2、S26948、nTZDpa、LG 100754、GW 1929盐酸盐、edaglitazone、环格列酮(ciglitazone)、伊诺他酮(inolitazone)、SR 2595、GW1929，或其任何盐(优选其任何药学上可接受的盐)、或药学上可接受的酯、互变异构体、多晶型物、或水合物、或异构体、前药、溶剂化物、或类似物，或其任何组合。

尽管两种药物的组合使用可以提供累加/协同作用，但使用两种独立的化学实体产生的可能的不希望的副作用可能大于使用具有双重特征的单种药物产生的可能的不希望的副作用。双重配体(即作用于两种不同药理学靶标的单个分子)的鉴定和使用可提供安全性和功效方面的优势。

因此，本发明第二方面的更优选的实施方式涉及同时表现PPARα激动剂活性和PPARγ激动剂活性的化合物，下文中称为本发明的第二化合物，所述化合物用于预防、减轻、改善和/或治疗酒精使用障碍。更优选地，本发明的第二化合物选自由以下组成的清单：indeglitazar、索格列扎(sodelglitazar)、阿格列扎(aleglitazar)、非诺贝特(fenofibrate)、依非拉诺(elafibranor)、吲哚美辛(indomethacin)、reglixane、苯扎贝特(bezafibrate)、布洛芬(ibuprofen)、二十碳五烯酸、吡格列酮(pioglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)、曲格列酮(troglitazone)、莫格列扎(muraglitazar)、BMS 687453、WY-14643(匹立尼酸)、LT175，或其任何盐(优选其任何药学上可接受的盐)、或药学上可接受的酯、互变异构体、多晶型物、或水合物、或异构体、前药、溶剂化物、或类似物，或其任何组合。

甚至更优选地，本发明的第二化合物是式(II)的化合物，或其任何盐(优选其任何药学上可接受的盐)、或药学上可接受的酯、互变异构体、多晶型物、或水合物、或异构体、前药、溶剂化物、或类似物，或其任何组合：

式(II)的化合物的名称是3-((4-苄基-2-氧代噁唑烷-3-基)甲基)-N-(4-(戊基氨基甲酰基)苯基)苯甲酰胺(NF 10-360)

式(V)中包括同时表现出PPARα激动剂活性和PPARγ激动剂活性的其他化合物：

其中：

-X是仲酰胺基，可以位于两个不同的位置X

-R是选自1到9(R

应当注意，对于X

R'是选自1到4(R'

在该方面的更优选的实施方式中，该化合物将通过组合R-Ph-X-Ph-R'形成，其中：

-对于X

-对于X

-对于X

-对于X

如所指出的，本发明的任何化合物可以取决于多个键的存在而包括异构体，所述异构体取决于手性中心的存在而包括旋光异构体或对映异构体。单独的异构体、对映异构体或非对映异构体及其混合物均在本发明的范围内，即，术语异构体还指异构体的任何混合物，所述异构体例如非对映异构体、外消旋异构体等，包括其旋光活性异构体或其不同比例的混合物。可以借助常规技术分离单独的对映异构体或非对映异构体及其混合物。

本发明的任何化合物的前药也属于本发明的范围。如本文所用，术语“前药”包括本发明化合物的任何衍生物，例如式(I)的那些化合物的衍生物，其中非限制性实例包括：酯(包括金属盐的羧酸酯、氨基酸酯、磷酸酯、磺酸酯等)、氨基甲酸酯(carbamate)、酰胺等，当施用至个体时，所述衍生物可以在所述个体中直接或间接转化为本发明的所述化合物。有利地，所述衍生物是当将其施用至个体时增加本发明化合物的生物利用度或增强本发明化合物在生物区室中的释放的化合物。所述衍生物的性质不是关键的，只要它可以被施用至个体并在个体的生物区室中提供本发明的化合物即可。所述前药的制备可以通过本领域技术人员已知的常规方法进行。

如本文所用，术语“类似物”包括药学上可接受的化合物(即可以用于制备药品或食品组合物的本发明化合物的类似物)，以及非非药学上可接受的衍生物，因为这些衍生物可用于制备药学上可接受的衍生物。

本发明的化合物可以是游离化合物或溶剂化物的结晶形式。在此意义上，如本文所用，术语“溶剂化物”包括药学上可接受的溶剂化物(即可以用于制备药品的本发明化合物的溶剂化物)、以及可用于制备药学上可接受的溶剂化物或盐的非药学上可接受的溶剂化物。药学上可接受的溶剂化物的性质不是关键的，只要它是药学上可接受的即可。在特别的实施方式中，溶剂化物是水合物。溶剂化物可以通过本领域技术人员已知的常规溶剂化方法获得。

对于其在疗法中的应用，本发明的化合物、其盐、前药或溶剂化物将优选为药学上可接受的形式或基本纯的形式，即，它们将具有药学上可接受的纯度水平，排除了常规药物添加剂(例如稀释剂和载体)，并且不包括在正常剂量水平下被认为有毒的物质。活性成分的纯度水平优选大于50％，更优选大于70％，再更优选大于90％。在优选的实施方式中，它们是大于95％的本发明的化合物或其盐、溶剂化物或前药。

本发明的药物组合物和药物形式

本发明的第三方面涉及药物组合物用于预防、减轻、改善和/或治疗酒精使用障碍的用途，所述药物组合物包含至少一种本发明的组合制剂或化合物，或其互变异构体、药学上可接受的盐、类似物或前药，优选连同药学上可接受载体或溶媒，和/或一种或多种赋形剂，下文中称为本发明的药物组合物。

可用于所述组合物中的药学上可接受的佐剂和溶媒是本领域技术人员已知并通常用于制备治疗组合物的佐剂和赋形剂。

在本说明书中使用的意义上，表述“治疗有效量”是指能够发挥由其药理学性质决定的治疗作用并经计算产生所需的效果的药剂或化合物的量，该量通常由化合物的典型特征等决定，包括患者的年龄和状况、失调或障碍的严重程度以及施用途径和频率。

本发明中描述的化合物、其盐、前药和/或溶剂化物以及包含它们的药物组合物可以与其他附加药物或活性成分一起使用以提供联合疗法。所述附加药物可以是相同药物组合物的一部分，或者可以以分开的组合物的形式提供，从而相对于包含本发明化合物、其盐、前药或其溶剂化物的药物组合物的施用，同时或非同时施用。

因此，在优选的实施方式中，药物组合物进一步包含另一种活性成分。

如本文所用，术语“活性成分”、“药物活性成分”、“活性物质”或“药物活性物质”是指潜在地提供不同药理学活性或对诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病的另一不同效果的，或影响人类或其他动物身体的结构或功能的任何组分。该术语包括促进药物制备中的化学变化并以提供特定活性或效果的预期修饰形式存在于药物中的那些组分。

在另一个优选的实施方式中，本发明的药物组合物优选包含作为仅有的活性成分的PPARα激动剂和CB1受体拮抗剂或PPAR 1激动剂和PPARγ激动剂，或贯穿全说明书描述的具有双重活性的任何化合物，尽管所述药物组合物可以另外包含药学上可接受的赋形剂和/或溶媒。因此，本发明的药物组合物优选包含本发明的任何制剂或化合物。

本发明的另一方面涉及包含任何本发明的制剂或化合物的药物形式，下文中称为本发明的药物形式。

在本文中，“药物形式”被理解为意指含有或不含有添加剂的一种或多种活性成分的混合物，所述混合物呈现出适合其施用、储存、施用和生物利用度的物理特性。

在本发明的另一种优选实施方式中，本发明的组合物和药物形式适合于以固体或液体形式口服施用。口服施用的可能形式是片剂、胶囊剂、糖浆剂或溶液剂，并且可以包含制药领域已知的常规赋形剂，例如粘结剂(例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮)、填充剂(例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸)、崩解剂(例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素)或药学上可接受的表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠。其他药物形式可以是胶体系统，其中包括聚合物纳米乳剂、纳米胶囊和纳米颗粒。

口服施用的组合物可以通过常规的医学制药方法，例如混合和分散来制备。可以按照制药工业中已知的方法将片剂包衣。

组合物和药物形式可以使用合适的剂量适于肠胃外施用，例如本发明产品的无菌溶液、悬浮液或冻干物。可以使用合适的赋形剂，例如pH缓冲剂或表面活性剂。

使用常规方法，例如不同国家的药典和其他参考文献中描述的那些方法，可以制备上述制剂。

如本文所用，术语“药品”是指用于预防、诊断、减轻、治疗或治愈人类和动物疾病的任何物质。

本发明的化合物、组合物或药物形式的施用可以通过任何合适的方法进行，例如静脉内输注和口服、局部或肠胃外途径。口服施用是优选的，因为对于患者来说是方便的并且要治疗的疾病具有慢性性质。

本发明化合物的施用量将取决于所选化合物的相对功效、要治疗的疾病的严重程度以及患者的体重。然而，本发明的化合物将每天施用一次或多次，例如每天1、2、3或4次，总剂量为0.1mg/kg/天至1000mg/kg/天。重要的是要考虑到，根据患者的年龄和病情以及施用途径的更改，可能有必要引入剂量变化。

本发明的化合物和组合物可以与其他药品一起用于联合疗法。其他药物可以是相同组合物或另一不同组合物的一部分，以便在相同时间或不同时间施用所述其他药物。

本发明的另一方面涉及食品组合物(例如营养品组合物或医疗性食品型组合物或功能性食品型组合物)，下文中称为本发明的食品组合物，所述食品组合物包含有效量的至少一种本发明的化合物以预防、减轻和/或治疗哺乳动物(包括人类)的酒精使用障碍。

优选的食品组合物选自由以下组成的清单：饮料、奶、酸奶、奶酪、发酵乳、调味乳饮料、豆浆、预煮谷物、面包、糕点、黄油、人造黄油、酱汁、油炸用油、蔬菜油、玉米油、橄榄油、豆油、棕榈油、葵花籽油、棉籽油、调味品、色拉调料、果汁、糖浆、甜点、胶汁(glaze)和填料、软冷冻产品、糖果、口香糖和中间食品。本发明的食品组合物可以是营养补剂或膳食补剂。在另一种优选的实施方式中，营养补剂或膳食补剂包含含有本发明化合物的无菌组合物，该组合物优选具有耐胃酸包衣，为延迟释放组合物。在另一种优选的实施方式中，包含本发明的化合物和/或营养补剂或膳食补剂的食品组合物包含与本发明的化合物一起施用的合适的“载体”，例如稀释剂、佐剂、赋形剂或溶媒。合适的赋形剂包括但不限于淀粉、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、硫酸钙、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。这样的营养补剂可用于对抗肝脏问题，并有助于维持哺乳动物(优选人类)的健康或健康生活方式。

如本文所理解的，术语“治疗”是指在对象(优选哺乳动物，更优选人)中对抗由于所关注的病理状况或疾病而引起的影响，包括：

(i)抑制病理状况或疾病，即停止其发展；

(ii)减轻病理状况或疾病，即引起病理状况或疾病或其症状的消退；

(iii)稳定病理状况或疾病。

如本文所理解的，术语“预防”由以下组成：预防疾病的发作，即防止对象(优选哺乳动物，更优选人)中病理状况或疾病的发生，特别是当所述对象对该病理状况易感时。

在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”及其变型形式并不意图排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。对于本领域技术人员而言，本发明的其他目的、优点和特征将部分地由说明书中推导出来，并且部分地由将本发明付诸于实践而推导出来。下列实施例和附图以举例说明的方式提供，并不意图限制本发明。

本发明的实施例

材料和方法

动物

为了进行酒精自我施用研究，将实验开始时体重为375g至425g的48只成年雄性Wistar大鼠(每组8只)(Harlan，巴塞罗那，西班牙)分别在12小时明/暗周期(12:00p.m.时关掉)下在恒温(23±1℃)房间中饲养。笼子中可以随意地获取标准食品和自来水。在开始酒精自我施用方案之前，使动物适应饲养设施2周。对于氧可酮自我施用，在整个研究中使用雄性Long-Evans大鼠(275-325g)(Charles-River Laboratories，罗利，N.C.)。到达后，将它们分别在颠倒的12小时明暗周期(下午7:00开启)下在动物设施中饲养，可自由获取食物和水。在研究开始之前，使它们适应新环境至少7天。对于在双瓶偏好实验中的酒精消耗量，使用在实验开始时体重为250g的雄性Wistar大鼠，或偏好酒精的遗传选择MarchigianSardinian(msP)雄性大鼠。

所有使用动物的实验方法均依照关于保护用于科学目的的动物的EuropeanDirective 2010/63/EU和西班牙法规(RD 53/2013和RD 178/2004)进行。所有方案均已获得马德里康普顿斯大学伦理委员会(Wistar大鼠酒精研究)或卡梅里诺大学伦理委员会(msP大鼠)批准。氧可酮研究已被美国国家药物滥用研究所(US National Institute onDrug Abuse；NIDA)批准，并与美国国家研究委员会实验动物护理和使用指南相一致。为了达到目前的研究目标，采取了特别的措施以最大程度地减少动物的痛苦和数量。

药物

如Fresno等人,2015(J Med Chem.58(16):6639-52)中所述，由马德里中央科学研究所的QuémicaMédica研究所(Instituto de Química Médica,Consejo Superior deInvestigaciones Científicas)合成NF 10-360。如Almeida等人,2010.ChemMedChem.5(10):1781-7所述，合成N-[1-(3,4-二羟基苯基)丙-2-基]油酰胺(OLHHA)。盐酸氧可酮、蔗糖和2-羟丙基-β-环糊精获得自Sigma/RBI(圣路易斯，MO，美国)。氧可酮溶于生理盐水溶液中。2-羟丙基-β-环糊精以25％2-羟丙基-β-环糊精溶于蒸馏水中。复苏药物(环格列酮、WY14643、油酰乙醇胺(OEA)和利莫那班(rimonabant))获得自Tocris-Bioscience(BiogenCientífica，马德里，西班牙)。每天(注射之前)通过将药物溶解在溶媒溶液(1％Tween 80的0.9％盐水溶液)中来制备新鲜溶液。所有药品均以2ml/kg的体积注射。根据研究小组的先前出版物选择OLHHA和NF 10-360的剂量[24,Fresno等人,2015.J Med Chem.2758(16):6639-52。

酒精自我施用模型

如先前所述(Cippitelli等人,2005.Eur J Neurosci.21(8):2243-51)，在封闭于隔音笼子中并配备排气扇的房间(Letica，型号LE 850，Panlab，巴塞罗那，西班牙))里，对动物进行了酒精自我施用方面的训练。该室配备有两个可伸缩杠杆，每个杠杆位于水盘的每一侧。

活动杠杆侧在实验期(session)之间平均分布，以防止出现位置偏好。按下0.1ml溶液活动杠杆，该溶液会呈递给动物，然后等待2.5秒，而按下非活动杠杆则没有结果。所有操作性酒精实验期每天持续30分钟，每周5天(星期一至星期五)。响应量和沉浸展示由计算机软件自动记录。每天在酒精自我施用之前对动物称重。使用Alen等人,2009(NicotineTob Res.11(11):1304-11)中描述的常规糖精褪色方法(Samson等人,1999)的改进方法进行训练。在训练的前三天，动物接受了在长柄勺中的0.2％糖精溶液，以帮助获知杠杆压力水平。此后，以固定比率1按以下顺序使用：三个实验期使用0.16％糖精和2％酒精，三个实验期使用0.12％糖精和4％酒精，四个实验期使用0.08％糖精和6％酒精，四个实验期使用0.04％糖精和8％酒精，0.02％糖精加10％酒精，最后剩余实验期使用10％酒精。第一次研究相对相似，随后至少有6周的时间可接触到酒精(10％w/v)。环格列酮(0.01mg/kg、1.5mg/kg和20mg/kg)，OEA(0.1mg/kg、1.5mg/kg和20mg/kg)，WY 14643(0.1mg/kg、5mg/kg、20mg/kg和40mg/kg)，利莫那班(0.03mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg)，OLHHA(0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg和5mg/kg)和NF 10-360(1mg/kg)。在自我施用实验期之前30分钟注射药品。接着将动物放置24小时，然后每天放置30分钟。重新开始EtOH自我施用实验期并进行监测。

双瓶偏好模型中的酒精消耗

如先前所述[Stopponi等人,2011.Biol Psychiatry.69(7):642]，在双瓶偏好测试中评估了自愿摄取酒精的情况。训练Wistar大鼠或因酒精偏好(msP)而被选择的大鼠每天24小时饮用水、10％酒精(v/v)(Wistar)或20％酒精(msP)，直到达到稳定的酒精摄入基线。此时，将大鼠分为不同的组(n＝9至10只/组)，该不同的组将分别用溶媒、NF 10-360(0或1mg/kg)或OLHHA(5mg/kg)进行治疗。对于msP大鼠，使用OLHHA连续治疗14天，并且在明/暗周期的暗期开始前每天施用一次药物或溶媒。施用OLHHA后每天2、8和24小时记录摄入量。每天监测酒精、水和食物的摄入量。在第14天，在最后一次施用OLHHA2小时后处死动物。

氧可酮自我施用

如先前所述[You等人,2017.Neuropharmacology.126:190-199]，进行氧可酮自我施用研究。将静脉内(i.v.)导管(Braintree Scientific,Inc.，布伦特里，MA，美国)植入氧可酮自我施用实验中使用的大鼠中。首先用补加有水合氯醛(140mg/kg，腹膜内)的戊巴比妥(30mg/kg，腹膜内)麻醉每只大鼠，然后在颈部中线右侧作小切口以暴露颈外静脉。导管的一端在导管的一侧到达右心房。然后用丝线将导管固定在静脉上，然后通过皮下途径将另一端送入颈部的后部，使其靠近颅骨的后部伸出，并用模拟套管(以及在实验期间还有输注线)与弯曲的24号不锈钢套管(Plastics One Inc.，罗阿诺克，VA，美国)连接。用四个不锈钢螺钉和螺栓将导管和引导套管固定在颅骨上。然后缝合切口。手术后，每天用庆大霉素-肝素-盐水溶液(0.1mg/ml庆大霉素和30IU/ml肝素，美国俄亥俄州克利夫兰ICNBiochemicals)清洗导管，作为抵抗导管阻塞和感染的预防措施。在开始行为训练之前，使动物恢复至少5天。

氧可酮自我施用是在带有两个响应杆和15W室内照明灯的操作室(美国佛蒙特州佐治亚Med Associates Inc.)中进行的。将两个杠杆放置在该室地板上方6.4厘米处；一个是活动，而另一个是非活动的。它们比活动的黎明(active daybreak)高出12厘米(Xi和Gardner,2007)。从手术中完全恢复后，训练大鼠自我施用氧可酮。为此，在每个训练日，其被运送到测试室，并通过聚乙烯管连接(通过卷簧钢带进行保护)，并连接至具有微处理器控制的旋转液体通道的注射泵，然后放置在室内。每个训练实验期均以对该室的响应的展示和室内照明灯点亮开始，在每次训练实验期结束时保持。每天对每只大鼠进行3小时实验期的训练，以固定比率1(FR-1)强化方案进行人主动寻求氧可酮输注。活动杠杆上的响应导致由轻音(light tone)组成的信号的激活，并在4.6s内注入了0.08ml氧可酮溶液。该时间也是等待时间段，在该等待时间段内，针对动物的响应保持轻音。在整个训练和测试过程中记录了每只动物的响应。

血浆和肝脏采样

最后一次给药2小时后处死大鼠。将处理的动物和用OLHHA处理的动物用戊巴比妥钠(50mg kg-1，腹腔注射)麻醉，并采集血液和肝脏样品。将血液离心(2100g，8分钟，4℃)，并保存血浆以备后续分析。将肝脏样品在液态N

血浆代谢物和细胞因子测量

测量了在血浆中的以下代谢物、代谢激素和细胞因子：代谢物葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、尿酸、尿素、肌酸酐、天冬氨酸转氨酶(GOT)、丙氨酸转氨酶(GPT)、白介素6、肿瘤坏死因子α(TNF-a)。根据制造商的说明，在自动Hitachi737分析仪(日本东京Hitachi)中对它们进行了分析。使用商业大鼠酶联免疫吸附测定试剂盒(英国剑桥Abcam)测量瘦素、IL-6和TNF-α的水平。

RNA分离和RT qPCR分析

如先前对OLHHA的研究[Decara等人,2015.Dis Model Mech.8(10):1213-25]所述，使用实时定量聚合酶链反应(RT qPCR)来测量与手部生脂肪脂肪酸(hand lipogenicfatty acid)的氧化有关的酶和蛋白质的mRNA水平的相对定量。根据制造商的说明(美国马里兰州巴尔的摩Gibco BRL Life Technologies)，使用

数据分析

GraphPad Prism v5.04(美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad Software)。数据用平均值±SEM表示。使用内置的非线性回归方程式计算酒精、可卡因或氧可酮自我施用抑制的EC50值。补加酒精并通过重复测量(因素：治疗和治疗)来分析变异性的作用(ANOVA)。借助双因素ANOVA(因素：治疗(溶媒/OLHHA)和饮料(辛醇/水)可接近性)对循环表达产生的血浆代谢参数、细胞因子和肝脏mRNA进行分析，并进行多次事后比较测试(Bonferroni)。小于0.05的p值被认为具有统计学意义。

结果

1.酒精自我施用中PPARα、PPARγ和CB1受体的参考配体的作用(图1)

为了对PPARα、PPARγ和CB1受体的参考激动剂以及大麻素受体的拮抗剂在酒精自我施用的功效的概况进行比较，计算环格列酮(PPARγ激动剂参考物)、OEA(PPARα受体的内源配体)、WY14643(PPARα配体受体的参考标准)和利莫那班(SR141716A，参考大麻素受体拮抗剂/反向激动剂，也已编号)的EC50和最大抑制作用。在这些化合物中，利莫那班达到最大的抑制作用，其次是OEA、环格列酮和WY14643。选择性关注的PPARα和PPARα受体激动剂似乎在酒精自我施用的抑制作用方面受到限制，在20mg/kg时达到最大剂量作用。这些化合物作用的EC50值(IC50)为：环格列酮(图1A)：EC50＝5.9(IC＝2.7至15.7)；OEA(图1B)：EC50＝6.5(IC＝3.2至13.2)；WY14643(图1C)：EC50＝23.6(IC＝11.3至60.9)；利莫那班(图1D)：EC50＝0.5(IC＝0.5至1.1)。

2双重PPARα/γ激动剂NF 10-360对酒精摄入和酒精自我施用的作用(图2)

使用剂量为1mg/kg的化合物NF 10-360来分析该化合物对自愿酒精摄入(图2A)和自我施用(图2B)的影响。数据表明该化合物减少了酒精摄入，F(1.84)＝4.33，P<0.05。该化合物还减少了酒精的自我施用研究，其中NF 10-360降低了对10％乙醇溶液的操作响应，t＝3.26，df＝10，配对数＝11，P<0.01。

3PPARα/CB

研究了PPARα激动剂CB1受体拮抗剂OLHHA对成年雄性Wistar大鼠乙醇自我施用的作用(图3A和3B)。对于最大剂量5mg/kg，响应率剂量依赖性降低(图3B)。EC50＝0.2mg/kg(IC＝0.08至0.4)。在施用24小时后进行分析时，这种作用不会影响酒精的自我施用(图3B)。

4PPARα/CB1受体的双重配体OLHHA对偏好酒精的msP大鼠自愿酒精摄入的作用(图3C至3F)

在该研究中，报告了OLHHA对双瓶偏好实验的影响，并研究了在施用2、8和24小时后每天给药5mg/kg的作用(图3C至3F)。OLHHA在注射2小时后减少了酒精摄入，F(1.14)＝39.5，P<0.0001，(图3C)。在施用OLHHA8小时后观察到该作用，F(1.14)＝23.9，P<0.001，(图3D)，并且该作用在24小时后几乎消失，F(1.14)＝4.7，P＝0.047，(图3E)，提示OLHHA的药理作用有时间限制。该观察结果是根据在施用24小时后测试这种行为时，OLHHA对酒精自我施用没有作用而得出的(图4)。整个OLHHA治疗期间记录的总酒精摄入显著降低，在任何情况下，F(1.14)＝5.1，P<0.05(图3F)，这表明在乙醇持续可获得的情况下，每天进行OLHHA治疗后，酒精摄入量会长期减少。

5PPARα/CB1受体的双重配体OLHHA对氧可酮自我施用的作用(图3G)

由于已知大麻素CB1受体的施用对阿片类物质自我施用具有抑制作用，因此测试了OLHHA是否能够减少Long-Evans大鼠对氧可酮的自我施用。OLHHA减少了氧可酮的自我施用，其最大抑制作用达到了对该阿片类物质的对照反应的45％。计算出的EC50为11.3mg/kg(IC＝5.1至25.1)。该数据提示，OLHHA在减少氧化上的潜力比对于酒精所观察到的低至少50％。应当指出，已经证明了PPARα激动作用影响阿片类物质在CB1受体拮抗作用的多巴胺能回路中的作用。

6重复施用PPARα/CB1受体的双重配体OLHHA对饮酒的msP大鼠的血浆和肝脏代谢参数的作用(图4)

由于酒精的使用可能对肝脏代谢产生有害影响，并且据报道OLHHA在瘦素缺乏的肥胖大鼠的肝脏中产生并改善了脂质代谢，测试了OLHHA的使用是否可能对肝脏代谢产生影响，最终改善或削弱了乙醇毒性(见图4)。获得的结果表明，如先前在瘦素缺乏的肥胖大鼠中所述，用OLHHA治疗降低了循环性甘油三酯(F(1.28)＝25.6，P<0.001)(图4B)、胆固醇(F(1.28)＝25.4，P<0.001)(图4C)和尿酸(F(1.28)＝17.4，P<0.01)(图4D)，略微降低暴露于酒精的大鼠的葡萄糖水平(图4A)(F(1.28)＝5.6，P<0.02)。OLHHA不会引起毒性(对转氨酶(图4G和4H)或肌酸酐(图4F)没有影响)或炎症(对IL-6的血浆浓度(图4I)和TNF的血浆浓度(图J)都没有影响)。此外，如针对大多数PPAR激动剂和CB1拮抗剂所述，OLHHA抑制了产脂肪酶例如Fasn(F(1.28)＝25.5，P<0.001)(图4M)和SCD1(F(1.28)＝13.1,P<0.01)(图L)的mRNA的表达，并增加了细胞色素c氧化酶4(F(1.28)＝10.3，P<0.01)(图4N)和PPAR受体(F(1.28)＝23.6，P<0.001)(图4O)的表达，提示促进氧化代谢。