一类含有利拉鲁肽衍生物的新型口服递送组合物及其应用

摘要

本发明涉及一类口服递送组合物，包括利拉鲁肽衍生多肽和N‑(8‑(2‑羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐；利拉鲁肽衍生多肽和N‑(8‑(2‑羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐的质量比为1:10‑120；本专利通过改变利拉鲁肽原脂肪链长度并创造性的在脂肪链末端引入羧基，与不带羧基末端的脂肪链相比，带有羧基末端的脂肪酸具有良好的口服生物利用效率，能够减少病人多次皮下给药的痛苦，具有实用性，给糖尿病治疗领域带来新的突破。

说明书

技术领域

本发明涉及一类含有利拉鲁肽衍生物的新型口服递送组合物及其应用，具体包含利拉鲁肽衍生物和N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐的组合物及其用途，包括其在糖尿病治疗领域的应用，属于口服递送组合物领域。

背景技术

糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病。目前，全球约有3亿糖尿病患者，预计到2025年将增加至5亿。临床上采用胰岛素强化治疗的方法来延缓糖尿病进程，但是注射胰岛素会有低血糖的风险。治疗效果受到剂量、注射部位、注射途径等因素的影响，且个体差异较大，使用胰岛素稍有不慎，就会出现严重的低血糖副作用。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂是2型糖尿病的新疗法，因其以葡萄糖依赖性地方式刺激胰岛素分泌的独特机制，同时具备体重减轻作用和心血管获益等优势，得到越来越多的关注。

但是天然GLP-1作为抗糖尿病和抗肥胖疗法的临床适用性受到其短暂的半衰期(1-2min)限制。自2005年美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准艾塞那肽(Exenatide)上市以来，陆续有多种GLP-1受体激动剂上市，这些产品主要致力于采取不同的策略克服内源性GLP-1被快速清除的缺陷，延长半衰期。其中由NovoNordisk公司研发的利拉鲁肽(liraglutide)于2009年获得欧盟批准，2010年获得美国FDA批准上市。利拉鲁肽是在内源性GLP-1的基础上，34位Lys用Arg替代，并在26位Lys上缀合16碳脂肪酸侧链。脂肪酸侧链可以与血清白蛋白发生非共价键作用，使得利拉鲁肽经皮下注射进入循环后，仅有1％-2％的化合物以游离多肽形式存在。故利拉鲁肽降糖持续期比较短，仅能够在一天内持续激活GLP-1受体，导致给药频次和皮下给药方式的不便，患者依从性较差。

诺和诺德公司将索马鲁肽与名为SNAC(sodium N-(8-[2-hydroxybenzoyl]amino)caprylate)的小分子吸收增强剂混合构成了口服索马鲁肽(semaglutide，

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一类含有利拉鲁肽衍生物的新型口服递送组合物及其应用，以解决现有技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

在第一方面，本发明涉及一类新型的组合物，包括利拉鲁肽衍生多肽和N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐，利拉鲁肽衍生多肽和N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐的质量比为1:10-120。

其中，N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐为通式(1)所示的化合物：

利拉鲁肽衍生多肽为通式(2)或通式(3)所示的化合物：

n

或

n

进一步的，作为本发明的优选方案，

N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐为通式(1)所示的化合物：

利拉鲁肽衍生多肽为通式(2)或通式(3)所示的化合物：

n

或

n

进一步的，作为本发明的优选方案，利拉鲁肽衍生多肽为下述化合物中任意一种：

进一步的，作为本发明的优选方案，利拉鲁肽衍生多肽也可以为下述化合物中任意一种：

在第二方面，本发明提供了一种药物组合物，其中所述的组合物为固体、液体或半固体的形式，且包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。

在第三方面，本发明还提供了上述化合物的制备方法，其中利拉鲁肽衍生多肽采用固相合成和液相合成策略高效快速地合成得到上述目标化合物。

在第四方面，本发明还提供了上述组合物在制备治疗或预防糖尿病的药物中的应用。

本发明制备得到的新型口服递送组合物可以增加利拉鲁肽的口服生物利用率的用途。

本发明在利拉鲁肽分子的基础上，变换第26位Lys和第34位Arg侧链中脂肪连长度，同时在脂肪连末端引入羧基，设计合成了一类利拉鲁肽衍生物；并将所得利拉鲁肽衍生物与N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐构建组合物联合使用，N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐与利拉鲁肽衍生物的结合能够让利拉鲁肽在胃部被部分吸收，同时可以缓冲胃中的酸性环境，以抵抗胃部肽酶的降解，当N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐与利拉鲁肽衍生物之间的非共价键暴露于血液后很容易断裂，从而释放利拉鲁肽衍生物进入循环，以达到改善口服生物利用度的效果。

本发明通过改变利拉鲁肽原脂肪链长度并创造性的在脂肪链末端引入羧基，意外的发现，与不带羧基末端的脂肪链相比，带有羧基末端的脂肪酸具有良好的口服生物利用效率，能够减少病人多次皮下给药的痛苦，具有实用性，是II型糖尿病治疗领域中极具发展前景的药物。

由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：

本专利通过改变利拉鲁肽原脂肪链长度并创造性的在脂肪链末端引入羧基，与不带羧基末端的脂肪链相比，带有羧基末端的脂肪酸具有良好的口服生物利用效率，能够减少病人多次皮下给药的痛苦，具有实用性，给糖尿病治疗领域带来新的突破。

附图说明

图1是组合物对正常ICR小鼠口服糖耐量的影响；(a)代表血浆葡萄糖水平随时间的变化；(b)显示血糖水平的AUC

图2是单层转运分析中组合物对Caco-2细胞的影响，***为p≤0.001。

具体实施方式

本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解释。

实施例1：

1、化学修饰的赖氨酸的合成

1.1、称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取9.05g Fmoc-Lys(Alloc)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.65mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入10mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，之后用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂，检测替代度为0.605mmol/g。

1.2、称取替代度为0.605mmol/g的Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂10.0g(6.0mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂30分钟后，加入30mL二氯甲烷，再加入8.8mL苯基硅烷，反应3分钟，再加入1.86g Pd(PPh

1.3、称取Fmoc-Glu-OtBu 12.72g(30mmol)，PyBOP 13.05g(30mmol)，HOBt 4.88g(36mmol)，用30mL DMF溶解，冰水浴下加入10.80mL DIEA(60mmol)活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点，反应结束，脱除Fmoc，DMF洗涤6次。

1.4、称取十六烷二酸单甲酯9.44g(30mmol)，用30mL DMF溶解，冰水浴下加入4.75mL DIC(30mmol)活化3分钟，加入反应柱反应2小时，反应结束后用甲醇收缩，真空干燥过夜，称重得到侧链修饰的Lys中间体树脂9.40g。

1.5、将得到的9.40g侧链修饰的Lys中间体树脂转移到圆底烧瓶中，加入145mL预先配制好的裂解液(以体积比计，TFE:DCM＝20:80)，室温搅拌2小时后过滤，收集滤液；树脂再用10mL的DCM洗涤2次，合并滤液，滤液减压蒸干，并真空干燥，得到6.10g白色固体化合物。

1.6、将所得白色固体化合物利用HPLC进行纯化，纯化条件为：采用以十八烷基键合硅胶为固定相，流动相：A相：1‰TFA水；B相：色谱纯乙腈，梯度：B％：66％-86％，50-70min。采用质谱检测所得白色固体化合物，其Ms,m/z 849.8(M+H)+,得所得化合物为具有式I-1所示结构的化合物，其纯度为98.5％，质量为2.56g。式I-1作为26位氨基酸进行后续肽链合成。

2、多肽肽链的合成及纯化

2.1、树脂的溶胀

称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代度0.4mmol/g)，经DCM 7mL溶胀30min，抽滤去DCM，再用NMP 10mL溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。

2.2、Fmoc保护基的脱除

将溶胀好的树脂放入反应器中，加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液7mL，反应1min，结束后滤去溶液；再加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液7mL，反应4min，结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。

2.3、Fmoc-Gly-Rink amide-MBHA Resin的合成

将Fmoc-Gly-OH(8.0mg,0.04mmol)，HBTU(15.1mg,0.04mmol)，HOBt(5.4mg,0.04mmol)和DIPEA(13.9μL,0.08mmol)溶于NMP 10mL中，再将此溶液加入步骤2.1得到的树脂中，反应7min，结束后滤去反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。

2.4、偶合效率的检测

取少量树脂颗粒DMF洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝溶液，常温振摇3分钟，树脂显蓝色即为阳性，透明为阴性，若为阴性才可进入下一个偶合循环。

2.5、肽链的延长

按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤(2.1-2.3)依次连接上相应的氨基酸(第26位为I-1)，依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有多肽链的树脂。

2.6、树脂上多肽的裂解

将上述得到的连有多肽链的树脂放入反应瓶中，加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h；反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液；将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品，最终得到化合物的粗品62.8mg，收率为95.2％。

2.7、多肽的纯化

使用制备液相色谱进行纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％三氟醋酸/水(V/V)，流动相B：0.1％三氟醋酸/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B40％～80％，30min；80％～85％，10min；85％～95％，10min；95％～40％，10min；流速为5mL/min，检测波长为214nm；收集溶液，减压蒸馏去除乙腈，冻干即得纯品。理论相对分子质量为3795.2。ESI-MS m/z:Calcd[M+3H]

3、利拉鲁肽衍生物与N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐组合物的制备

将化学修饰的利拉鲁肽衍生物(式4的化合物)与N-[8-(2-羟基苯甲酰基)-氨基]辛酸钠(SNAC)以质量比1:10共同混合，借助两者间弱的非共价药物制备复合体。

实施例2：

1、化学修饰的赖氨酸的合成

1.1、称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取9.05g Fmoc-Lys(Alloc)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.65mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入10mL无水甲醇封闭1小时；用DMF洗涤3次，DCM洗3次，之后用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂，检测替代度为0.605mmol/g。

1.2、称取替代度为0.605mmol/g的Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂10.0g(6.0mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂30分钟后，加入30mL二氯甲烷，再加入8.8mL苯基硅烷，反应3分钟，再加入1.86g Pd(PPh

1.3、称取Fmoc-Glu-OtBu 12.72g(30mmol)，PyBOP 13.05g(30mmol)，HOBt 4.88g(36mmol)，用30mL DMF溶解，冰水浴下加入10.80mL DIEA(60mmol)活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点；反应结束，脱除Fmoc，DMF洗涤6次。

1.4、称取十八烷二酸单甲酯10.26g(30mmol)，用30mL DMF溶解，冰水浴下加入4.75mL DIC(30mmol)活化3分钟，加入反应柱反应2小时，反应结束后用甲醇收缩，真空干燥过夜，称重得到侧链修饰的Lys中间体树脂8.11g。

1.5、将得到的8.11g侧链修饰的Lys中间体树脂转移到圆底烧瓶中，加入145mL预先配制好的裂解液(以体积比计，TFE:DCM＝20:80)，室温搅拌2小时后过滤，收集滤液；树脂再用10mL的DCM洗涤2次，合并滤液；滤液减压蒸干，并真空干燥，得到5.30g白色固体化合物。

1.6、将所得白色固体化合物利用HPLC进行纯化，纯化条件为：采用以十八烷基键合硅胶为固定相，流动相：A相：1‰TFA水；B相：色谱纯乙腈，梯度：B％：66％-86％，50-70min。采用质谱检测所得白色固体化合物，其Ms,m/z 877.5(M+H)+,得所得化合物为具有式I-2所示结构的化合物，其纯度为96.5％，质量为2.43g。式I-2作为26位氨基酸进行后续肽链合成。

2、多肽肽链的合成及纯化

2.1、树脂的溶胀

称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代度0.4mmol/g)，经DCM 7mL溶胀30min，抽滤去DCM，再用NMP 10mL溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。

2.2、Fmoc保护基的脱除

将溶胀好的树脂放入反应器中，加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液7mL，反应1min，结束后滤去溶液；再加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液7mL，反应4min，结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净；得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。

2.3、Fmoc-Gly-Rink amide-MBHA Resin的合成

将Fmoc-Gly-OH(8.0mg,0.04mmol)，HBTU(15.1mg,0.04mmol)，HOBt(5.4mg,0.04mmol)和DIPEA(13.9μL,0.08mmol)溶于NMP 10mL中，再将此溶液加入步骤2.1得到的树脂中，反应7min，结束后滤去反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。

2.4、偶合效率的检测

取少量树脂颗粒DMF洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝溶液，常温振摇3分钟，树脂显蓝色即为阳性，透明为阴性；若为阴性才可进入下一个偶合循环。

2.5、肽链的延长

按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤(2.1-2.3)依次连接上相应的氨基酸(第26位为I-2)，依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有多肽链的树脂。

2.6、树脂上多肽的裂解

将上述得到的连有多肽链的树脂放入反应瓶中，加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h；反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液；将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品；最终得到化合物的粗品62.8mg，收率为95.2％。

2.7、多肽的纯化

使用制备液相色谱进行纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％三氟醋酸/水(V/V)，流动相B：0.1％三氟醋酸/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B40％～80％，30min；80％～85％，10min；85％～95％，10min；95％～40％，10min；流速为5ml/min，检测波长为214nm；收集溶液，减压蒸馏去除乙腈，冻干即得纯品。理论相对分子质量为3823.2。ESI-MS m/z:Calcd[M+3H]

3、化学修饰的利拉鲁肽衍生物与N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐组合物的制备

将化学修饰的利拉鲁肽衍生物(式(5)的化合物)与N-[8-(2-羟基苯甲酰基)-氨基]辛酸钠(SNAC)以质量比1:30共同混合，借助两者间弱的非共价药物制备复合体。

实施例3：

1、化学修饰的赖氨酸的合成

1.1、称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取9.05g Fmoc-Lys(Alloc)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.65mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入10mL无水甲醇封闭1小时；用DMF洗涤3次，DCM洗3次，之后用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂，检测替代度为0.605mmol/g。

1.2、称取替代度为0.605mmol/g的Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂10.0g(6.0mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂30分钟后，加入30mL二氯甲烷，再加入8.8mL苯基硅烷，反应3分钟，再加入1.86g Pd(PPh

1.3、称取Fmoc-Glu-OtBu 12.72g(30mmol)，PyBOP 13.05g(30mmol)，HOBt 4.88g(36mmol)，用30mL DMF溶解，冰水浴下加入10.80mL DIEA(60mmol)活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点；反应结束，脱除Fmoc，DMF洗涤6次。

1.4、称取二十烷二酸单甲酯9.44g(30mmol)，用30mL DMF溶解，冰水浴下加入4.75mL DIC(30mmol)活化3分钟，加入反应柱反应2小时，反应结束后用甲醇收缩，真空干燥过夜，称重得到侧链修饰的Lys中间体树脂8.71g。

1.5、将得到的8.71g侧链修饰的Lys中间体树脂转移到圆底烧瓶中，加入145mL预先配制好的裂解液(以体积比计，TFE:DCM＝20:80)，室温搅拌2小时后过滤，收集滤液；树脂再用10mL的DCM洗涤2次，合并滤液；滤液减压蒸干，并真空干燥，得到6.10g白色固体化合物。

1.6、将所得白色固体化合物利用HPLC进行纯化，纯化条件为：采用以十八烷基键合硅胶为固定相，流动相：A相：1‰TFA水；B相：色谱纯乙腈，梯度：B％：66％—86％，50-70min。采用质谱检测所得白色固体化合物，其Ms,m/z 891.5(M+H)+,得所得化合物为具有式I-3所示结构的化合物，其纯度为97.5％，质量为2.06g。式I-3作为26位氨基酸进行后续肽链合成。

2、多肽肽链的合成及纯化

2.1、树脂的溶胀

称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代度0.4mmol/g)，经DCM 7mL溶胀30min，抽滤去DCM，再用NMP 10mL溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。

2.2、Fmoc保护基的脱除

将溶胀好的树脂放入反应器中，加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液7mL，反应1min，结束后滤去溶液；再加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液7mL，反应4min，结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净，得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。

2.3、Fmoc-Gly-Rink amide-MBHA Resin的合成

将Fmoc-Gly-OH(8.0mg,0.04mmol)，HBTU(15.1mg,0.04mmol)，HOBt(5.4mg,0.04mmol)和DIPEA(13.9μL,0.08mmol)溶于NMP 10mL中，再将此溶液加入步骤2.1得到的树脂中，反应7min，结束后滤去反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。

2.4、偶合效率的检测

取少量树脂颗粒DMF洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝溶液，常温振摇3分钟，树脂显蓝色即为阳性，透明为阴性；若为阴性才可进入下一个偶合循环。

2.5、肽链的延长

按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤(2.1-2.3)依次连接上相应的氨基酸(第26位为I-3)，依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有多肽链的树脂。

2.6、树脂上多肽的裂解

将上述得到的连有多肽链的树脂放入反应瓶中，加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液；将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品；最终得到化合物的粗品62.8mg，收率为95.2％。

2.7、多肽的纯化

使用制备液相色谱进行纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％三氟醋酸/水(V/V)，流动相B：0.1％三氟醋酸/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B40％～80％，30min；80％～85％，10min；85％～95％，10min；95％～40％，10min；流速为5ml/min，检测波长为214nm；收集溶液，减压蒸馏去除乙腈，冻干即得纯品；理论相对分子质量为3795.2。ESI-MS 3851.2m/z:Calcd[M+3H]

3、利拉鲁肽衍生物与N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐组合物的制备

将化学修饰的利拉鲁肽衍生物(式(6)的化合物)与N-[8-(2-羟基苯甲酰基)-氨基]辛酸钠(SNAC)以质量比1：50共同混合，借助两者间弱的非共价药物制备复合体。

实施例4

1、化学修饰的赖氨酸的合成

1.1.1、称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取9.05g Fmoc-Lys(Alloc)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.65mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入10mL无水甲醇封闭1小时；用DMF洗涤3次，DCM洗3次，之后用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂，检测替代度为0.605mmol/g。

1.1.2、称取替代度为0.605mmol/g的Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂10.0g(6.0mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂30分钟后，加入30mL二氯甲烷，再加入8.8mL苯基硅烷，反应3分钟，再加入1.86g Pd(PPh

1.1.3、称取Fmoc-Glu-OtBu 12.72g(30mmol)，PyBOP 13.05g(30mmol)，HOBt4.88g(36mmol)，用30mL DMF溶解，冰水浴下加入10.80mL DIEA(60mmol)活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点；反应结束，脱除Fmoc，DMF洗涤6次。

1.1.4、称取十六烷酸单甲酯8.10g(30mmol)，用30mL DMF溶解，冰水浴下加入4.75mL DIC(30mmol)活化3分钟，加入反应柱反应2小时；反应结束后用甲醇收缩，真空干燥过夜；称重得到侧链修饰的Lys中间体树脂9.40g。

1.1.5、将得到的9.40g侧链修饰的Lys中间体树脂转移到圆底烧瓶中，加入145mL预先配制好的裂解液(以体积比计，TFE:DCM＝20:80)，室温搅拌2小时后过滤，收集滤液；树脂再用10mL的DCM洗涤2次，合并滤液；滤液减压蒸干，并真空干燥，得到5.30g白色固体化合物。

1.1.6、将所得白色固体化合物利用HPLC进行纯化，纯化条件为：采用以十八烷基键合硅胶为固定相，流动相：A相：1‰TFA水；B相：色谱纯乙腈，梯度：B％：66％-86％，50-70min；采用质谱检测所得白色固体化合物，其Ms,m/z 791.5(M+H)+,得所得化合物为具有式I-4所示结构的化合物，其纯度为96.5％，质量为1.83g；式I-4作为26位氨基酸进行后续肽链合成；后用于实施例5、6的合成。

1.2.1、称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂5g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取9.05g Fmoc-Lys(Alloc)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.65mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入10mL无水甲醇封闭1小时；用DMF洗涤3次，DCM洗3次，之后用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂，检测替代度为0.605mmol/g。

1.2.2、称取替代度为0.605mmol/g的Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂5.0g(3.0mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Lys(Alloc)-2CTC树脂30分钟后，加入30mL二氯甲烷，再加入8.8mL苯基硅烷，反应3分钟，再加入0.93g Pd(PPh

1.2.3、称取丁二酸单甲酯1.98g(15mmol)，PyBOP 6.52g(15mmol)，HOBt 2.44g(18mmol)，用30mL DMF溶解，冰水浴下加入5.40mL DIEA(30mmol)活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点，反应结束，脱除Fmoc，DMF洗涤6次；称重得到侧链修饰的Lys中间体树脂1.69g。

1.3.1、将得到的1.69g侧链修饰的Lys中间体树脂转移到圆底烧瓶中，加入145mL预先配制好的裂解液(以体积比计，TFE:DCM＝0:80)，室温搅拌2小时后过滤，收集滤液；树脂再用10mL的DCM洗涤2次，合并滤液；滤液减压蒸干，并真空干燥，得到0.87g白色固体化合物。

1.3.2、将所得白色固体化合物利用HPLC进行纯化，纯化条件为：采用以十八烷基键合硅胶为固定相，流动相：A相：1‰TFA水；B相：色谱纯乙腈，梯度：B％：66％—86％，50-70min。采用质谱检测所得白色固体化合物，其Ms,m/z 468.2(M+H)+,得所得化合物为具有式I-5所示结构的化合物，其纯度为98.5％，质量为0.45g；式I-5作为34位氨基酸进行后续肽链合成。

2、多肽肽链的合成及纯化

2.1、树脂的溶胀

称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代度0.4mmol/g)，经DCM 7mL溶胀30min，抽滤去DCM，再用NMP 10mL溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。

2.2、Fmoc保护基的脱除

将溶胀好的树脂放入反应器中，加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液7mL，反应1min，结束后滤去溶液；再加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液7mL，反应4min，结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净，得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。

2.3、Fmoc-Gly-Rink amide-MBHA Resin的合成

将Fmoc-Gly-OH(8.0mg,0.04mmol)，HBTU(15.1mg,0.04mmol)，HOBt(5.4mg,0.04mmol)和DIPEA(13.9μL,0.08mmol)溶于NMP 10mL中，再将此溶液加入步骤2.1得到的树脂中，反应7min，结束后滤去反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。

2.4、偶合效率的检测

取少量树脂颗粒DMF洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝溶液，常温振摇3分钟，树脂显蓝色即为阳性，透明为阴性；若为阴性才可进入下一个偶合循环。

2.5、肽链的延长

按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤(2.1-2.3)依次连接上相应的氨基酸(其中第26位为I-4，第34位为I-5)，依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有多肽链的树脂。

2.6、树脂上多肽的裂解

将上述得到的连有多肽链的树脂放入反应瓶中，加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h；反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液；将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品；最终得到化合物的粗品62.8mg，收率为95.2％。

2.7、多肽的纯化

使用制备液相色谱进行纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％三氟醋酸/水(V/V)，流动相B：0.1％三氟醋酸/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B40％～80％，30min；80％～85％，10min；85％～95％，10min；95％～40％，10min；流速为5ml/min，检测波长为214nm；收集溶液，减压蒸馏去除乙腈，冻干即得纯品；理论相对分子质量为3853.2。ESI-MS m/z:Calcd[M+3H]

3、化学修饰的利拉鲁肽衍生物与N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐组合物的制备

将化学修饰的利拉鲁肽衍生物(式(7)的化合物)与N-[8-(2-羟基苯甲酰基)-氨基]辛酸钠(SNAC)以质量比1：80共同混合，借助两者间弱的非共价药物制备复合体。

实施例5

1、化学修饰的赖氨酸的合成

1.1、称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂5g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取9.05g Fmoc-Lys(Alloc)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.65mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入10mL无水甲醇封闭1小时；用DMF洗涤3次，DCM洗3次，之后用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂，检测替代度为0.605mmol/g。

1.2、称取替代度为0.605mmol/g的Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂5.0g(3.0mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Lys(Alloc)-2CTC树脂30分钟后，加入30mL二氯甲烷，再加入8.8mL苯基硅烷，反应3分钟，再加入0.93g Pd(PPh

1.3、称取己二酸单甲酯1.20g(15mmol)，PyBOP 6.52g(15mmol)，HOBt 2.44g(18mmol)，用30mL DMF溶解，冰水浴下加入5.40mL DIEA(30mmol)活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点；反应结束，脱除Fmoc，DMF洗涤6次；称重得到侧链修饰的Lys中间体树脂1.56g。

1.4、将得到的1.56g侧链修饰的Lys中间体树脂转移到圆底烧瓶中，加入145mL预先配制好的裂解液(以体积比计，TFE:DCM＝20:80)，室温搅拌2小时后过滤，收集滤液；树脂再用10mL的DCM洗涤2次，合并滤液。滤液减压蒸干，并真空干燥，得到0.66g白色固体化合物。

1.5、将所得白色固体化合物利用HPLC进行纯化，纯化条件为：采用以十八烷基键合硅胶为固定相，流动相：A相：1‰TFA水；B相：色谱纯乙腈，梯度：B％：66％—86％，50-70min。采用质谱检测所得白色固体化合物，其Ms,m/z 496.2(M+H)+,得所得化合物为具有式I-6所示结构的化合物，其纯度为97.5％，质量为0.33g；式I-6作为34位氨基酸进行后续肽链合成。

2、多肽肽链的合成及纯化

2.1、树脂的溶胀

称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代度0.4mmol/g)，经DCM 7mL溶胀30min，抽滤去DCM，再用NMP 10mL溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。

2.2、Fmoc保护基的脱除

将溶胀好的树脂放入反应器中，加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液7mL，反应1min，结束后滤去溶液；再加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液7mL，反应4min，结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净；得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。

2.3、Fmoc-Gly-Rink amide-MBHA Resin的合成

将Fmoc-Gly-OH(8.0mg,0.04mmol)，HBTU(15.1mg,0.04mmol)，HOBt(5.4mg,0.04mmol)和DIPEA(13.9μL,0.08mmol)溶于NMP 10mL中，再将此溶液加入步骤2.1得到的树脂中，反应7min，结束后滤去反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。

2.4、偶合效率的检测

取少量树脂颗粒DMF洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝溶液，常温振摇3分钟，树脂显蓝色即为阳性，透明为阴性；若为阴性才可进入下一个偶合循环。

2.5、肽链的延长

按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤(2.1-2.3)依次连接上相应的氨基酸(其中第26位为I-4，第34位为I-6)，依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有多肽链的树脂。

2.6、树脂上多肽的裂解

将上述得到的连有多肽链的树脂放入反应瓶中，加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液；将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品；最终得到化合物的粗品62.8mg，收率为95.2％。

2.7、多肽的纯化

使用制备液相色谱进行纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％三氟醋酸/水(V/V)，流动相B：0.1％三氟醋酸/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B40％～80％，30min；80％～85％，10min；85％～95％，10min；95％～40％，10min；流速为5ml/min，检测波长为214nm；收集溶液，减压蒸馏去除乙腈，冻干即得纯品；理论相对分子质量为3881.2。ESI-MS m/z:Calcd[M+3H]

3、化学修饰的利拉鲁肽衍生物与N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐组合物的制备

将化学修饰的利拉鲁肽衍生物(式(8)的化合物)与N-[8-(2-羟基苯甲酰基)-氨基]辛酸钠(SNAC)以质量比1：100共同混合，借助两者间弱的非共价药物制备复合体。

实施例6

1、化学修饰的赖氨酸的合成

1.1、称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂5g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取9.05g Fmoc-Lys(Alloc)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.65mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入10mL无水甲醇封闭1小时；用DMF洗涤3次，DCM洗3次，之后用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂，检测替代度为0.605mmol/g。

1.2、称取替代度为0.605mmol/g的Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂5.0g(3.0mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Lys(Alloc)-2CTC树脂30分钟后，加入30mL二氯甲烷，再加入8.8mL苯基硅烷，反应3分钟，再加入0.93g Pd(PPh

1.3、称取辛二酸单甲酯2.32g(15mmol)，PyBOP 6.52g(15mmol)，HOBt 2.44g(18mmol)，用30mL DMF溶解，冰水浴下加入5.40mL DIEA(30mmol)活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点；反应结束，脱除Fmoc，DMF洗涤6次；称重得到侧链修饰的Lys中间体树脂1.31g。

1.4、将得到的1.31g侧链修饰的Lys中间体树脂转移到圆底烧瓶中，加入145mL预先配制好的裂解液(以体积比计，TFE:DCM＝20:80)，室温搅拌2小时后过滤，收集滤液；树脂再用10mL的DCM洗涤2次，合并滤液。滤液减压蒸干，并真空干燥，得到0.93g白色固体化合物。

1.5、将所得白色固体化合物利用HPLC进行纯化，纯化条件为：采用以十八烷基键合硅胶为固定相，流动相：A相：1‰TFA水；B相：色谱纯乙腈，梯度：B％：66％—86％，50-70min；采用质谱检测所得白色固体化合物，其Ms,m/z 424.2(M+H)+,得所得化合物为具有式I-7所示结构的化合物，其纯度为98.5％，质量为0.53g。式I-7作为34位氨基酸进行后续肽链合成。

2、多肽肽链的合成及纯化

2.1、树脂的溶胀

称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代度0.4mmol/g)，经DCM 7mL溶胀30min，抽滤去DCM，再用NMP 10mL溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。

2.2、Fmoc保护基的脱除

将溶胀好的树脂放入反应器中，加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液7mL，反应1min，结束后滤去溶液；再加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液7mL，反应4min，结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。

2.3、Fmoc-Gly-Rink amide-MBHA Resin的合成

将Fmoc-Gly-OH(8.0mg,0.04mmol)，HBTU(15.1mg,0.04mmol)，HOBt(5.4mg,0.04mmol)和DIPEA(13.9μL,0.08mmol)溶于NMP 10mL中，再将此溶液加入步骤2.1得到的树脂中，反应7min，结束后滤去反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。

2.4、偶合效率的检测

取少量树脂颗粒DMF洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝溶液，常温振摇3分钟，树脂显蓝色即为阳性，透明为阴性；若为阴性才可进入下一个偶合循环。

2.5、肽链的延长

按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤(2.1-2.3)依次连接上相应的氨基酸(其中第26位为I-4，第34位为I-7)，依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有多肽链的树脂。

2.6、树脂上多肽的裂解

将上述得到的连有多肽链的树脂放入反应瓶中，加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h；反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液；将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品；最终得到化合物的粗品62.8mg，收率为95.2％。

2.7、多肽的纯化

使用制备液相色谱进行纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％三氟醋酸/水(V/V)，流动相B：0.1％三氟醋酸/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B40％～80％，30min；80％～85％，10min；85％～95％，10min；95％～40％，10min；流速为5ml/min，检测波长为214nm；收集溶液，减压蒸馏去除乙腈，冻干即得纯品；理论相对分子质量为3909.2。ESI-MS m/z:Calcd[M+3H]

3、化学修饰的利拉鲁肽衍生物与N-(8-(2-羟基苯甲酰)氨基)辛酸盐组合物的制备

将化学修饰的利拉鲁肽衍生物(式(9)的化合物)与N-[8-(2-羟基苯甲酰基)-氨基]辛酸钠(SNAC)以质量比1：120共同混合，借助两者间弱的非共价药物制备复合体。

实施例7：本发明制备得到的口服递送组合物的药理实验方法以及结果：

1、GLP-1类似物的受体激动活性实验

HEK293细胞共转染编码GLP-1R的cDNA，细胞系表达并利用Western Blot检测已构建的HEK293细胞中GLP-1R的蛋白水平，以考察是否建立了稳定高表达的GLP-R-HEK293细胞株；受体激动活性实验中，首先，将细胞种于96孔板中，2h后，化合物用DMSO溶解，使用含有0.1％牛血清蛋白的培养基稀释至不同倍数，加入共转染的GLP-1R-HEK293细胞中；孵育20min后，使用Cisbo公司的ELISA试剂盒检测相应的cAMP值，非线性回归后计算化合物的EC

表1口服递送组合物的EC

如表1所示，所有化合物对GLP-1R的激动活性都得到保留，与利拉鲁肽相比有明显提高。其中实施例1制备得到的口服递送组合物对GLP-1R的激动活性与内源性GLP-1相近，较利拉鲁肽提高了10倍左右。

2、正常小时口服葡萄糖耐量实验

口服葡萄糖耐量试验(OGTT)主要用于测定机体对葡萄糖的负荷能力，以反映机体的血糖调节水平和胰岛功能；该实验采用正常ICR小鼠进行OGTT，以筛选具有潜在的体内降糖活性的优选化合物。

仪器：血糖测定仪(三诺生物传感有限公司，长沙)，血糖试纸(三诺生物传感有限公司，长沙)，弯头剪，小鼠灌胃针，1mL医用注射器，AUY120型电子精密分析天平(日本岛津)。

材料：18-22g的清洁级雄性ICR小鼠(扬州大学比较医学中心)，基础饲料(南京市青龙山动物繁殖中心)，葡萄糖(上海凌峰化学试剂有限公司)。

动物饲养环境：18-22g的清洁级雄性ICR小鼠进行随机分笼，给予充足的食物和饮水，同时以12h日/夜循环的光照条件进行饲养，动物房室内温度保持在23-25℃，室内相对湿度保持为70±10％，维持室内良好的通风条件；除特别说明外，灌胃溶媒均采用0.5％的羧甲基纤维素水溶液，以给药剂量将待测化合物配制成一定浓度的溶液。

实验方法：18-22g的清洁级雄性ICR小鼠适应性喂养一周后，随机分组，分为正常对照组，利拉鲁肽腹腔给药组，利拉鲁肽口服给药组，待测化合物给药组(实施例1-6制备得到的口服递送组合物)，每组6只；实验前小鼠禁食不禁水12小时后称重，尾尖采血测定空腹血糖水平，正常对照组灌胃给予溶媒，腹腔、口服给药组均按照体重给予相应浓度的待测药物，给药30min后测定各组血糖水平，并分别立即腹腔注射3g/kg葡萄糖水溶液，测定给予葡萄糖后15，30，45，60及120min的血糖水平；收集实验结果，采用GraphPad 7.0以时间为横坐标，血糖值为纵坐标绘制折线图，并计算各组血糖曲线下面积AUC。

如图1所示，灌胃给予葡萄糖15min后，各组小鼠的血糖水平均明显升高，并于30min达到血糖水平峰值，利拉鲁肽腹腔给药对照组的小鼠血糖水平相比于空白组和利拉鲁肽口服给药组具有显著性差异。

3、跨越Caco-2细胞单层转运实验

该实验的目的是测定不同组合物对Caco-2单层中的GLP-1肽的经上皮吸收的渗透增强作用。

细胞培养：人结肠腺癌Caco-2细胞株ATCC#HTB-37，购自ATCC(American TypeCulture Collection，Rockville，MD，USA)，从液氮中取出冻存第29代的Caco-2细胞，以DMEM-20培养2代，DMEM-15培养3代，待细胞生长速度正常后转换用DMEM-10培养；复苏好的细胞以DMEM-10培养，第一天换液后隔天换液，每4～5天传代(细胞汇合率约80％)，传代比例为1：5。

Caco-2细胞单层的建立：细胞汇合率达到80％后，用0.25％胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养瓶瓶壁上消化下来，用DMEM-10终止消化并将细胞悬液稀释到2.5×10

Caco-2细胞单层完整性的考察：Caco-2细胞在Transwell小室中培养21天，且经检测形成单层模型造好后(TEER>200Ω/cm

荧光黄渗透实验：实验开始前在基顶侧和基地侧分别使用预热的HBSS清洗2次，将基顶侧换成400ul添加荧光黄100ug/ml的溶液；在37℃，5％CO

实验时测定Papp值为2.6×10

表明实施例1制备得到的口服递送组合物和实施例4制备得到的口服递送组合物可以显著增加相应衍生肽的跨细胞转运和表观渗透系数，同时对电阻值无显著影响，这说明跨膜转运的增加不是通过细胞旁途径实现，而是通过增加了目标衍生肽的跨细胞吸收。

4、大鼠药物代谢动力学实验

SD大鼠，实验前适应性喂养2d，给药前禁食12h，不禁水，给药后2h内禁水，全程禁食。按46mg·kg剂量灌胃(ig)或尾静脉注射(iv)目标组合物，给药后0，5，10，20，30，45，60min和1.5，2，3，5，8，10，12h自尾静脉取血(给药后2h内，每0.5h腹腔注射补充与取血量等同的生理盐水，2h后允许自由饮水)，分离血浆，密封后置于-80℃冰箱保存，备用。

样品制备：取血浆样品或血浆稀释样品100μL，加入内标溶液5μL(1 000ng·mL

标准溶液的配制：精密称取丹参素对照品适量，加1.5％磷酸水溶液配成0.860mg·mL

随后配置内标溶液，并通过UPLC-MS-MS计算不同给药途径下不同组别的药动学参数，结果如下表所示：

表2不同给药方式下实施例1制备得到口服递送组合物的药代动力学参数

实验表明通过构建口服递送组合物，可显著提高利拉鲁肽衍生多肽的生物利用度，为进一步开发口服的GLP-1受体激动药物提供理论依据。

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。