一种没食子儿茶素没食子酸酯的制备方法

摘要

本发明公开了一种没食子儿茶素没食子酸酯的制备方法，该制备方法以EGCG为原料，按照合适比例加入一定浓度的酸液进行溶解，逐渐加热搅拌反应一定时间后冷却至室温。加入相同浓度的碱液调节pH至近中性，得到反应后溶液；将反应后溶液逐渐加入到已处理好的装有PS‑DVB微球的层析柱内，然后用醇溶液进行洗脱，直至无明显GCG流出为止；按照每0.5个柱体积流出量接收洗脱液，薄层检测并选取含有目标成分的洗脱液。浓缩除醇后放置析晶，即得没食子儿茶素没食子酸酯，从而为制备高纯度的GCG提供了一种更为高效的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种没食子儿茶素没食子酸酯的制备方法，属于医药化工领域。

背景技术

没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是茶叶中的主要儿茶素之一，作为天然抗氧化剂和自由基清除剂，具有明显的抗衰老、抗突变、防癌抗癌、预防心血管疾病、防辐射等多种生物学活性，广泛运用于食品加工、医药保健和日用化工领域。然而，由于其不稳定的特性，容易受到环境因素的影响，如在空气中极易氧化，碱中极易分解，在高温条件下稳定性差等。

没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）是EGCG的一种同分异构体，其在天然绿茶之中存在量非常少，很难直接从绿茶中直接得到纯度很高的GCG，进而限制了其应用研究的进展。目前对于GCG的研究还是很少，除发明专利申请号为2016111980801的专利中有提供一种制备方法之外，其他绝大部分文献研究关注点均集中在其异构体EGCG之上。

申请号为2016111980801的中国发明专利提供了一种高纯度GCG的制备方法，包括如下步骤：(1)以EGCG为原料，加入溶剂反得反应液A；(2)将反应液A浓缩处理至水溶液，加入乙酸乙酯进行萃取，得溶液B；(3)取溶液B，逐渐加入到装有大孔吸附树脂的层析柱内，进行梯度洗脱，选取含有目标成分的洗脱液，浓缩至无醇味，得浓缩液C；(4)取浓缩液C，加入正丁醇进行萃取，合并正丁醇溶液，浓缩至浸膏，加入水溶解至清，放冷析晶，过滤烘干，即得高纯度的GCG粉末。本发明通过以EGCG为原料，经过高温条件下的反应转化发生构型变化后，通过溶剂萃取以及大孔吸附树脂柱层析技术，制备得到高纯度的GCG。

该发明专利虽然公开了一种可行的制备没食子儿茶素没食子酸酯的方法，但是从其实施例中我们不难发现，该方法所需要的反应条件为持续性高温反应，反应持续时间多在5天左右，工序周期长、成本高昂，而且给实际操作以及应用造成了很大不便。另外，在后续纯化过程中有反复使用到乙酸乙酯、正丁醇等有机试剂，对于环境以及产品质量均带来不好地影响；再者，选择大孔吸附树脂柱层析技术需要经过至少四个梯度的不同溶液的洗脱处理，操作步骤繁杂，而且还需要用到大量酸碱以及醇溶液对于树脂柱进行再生处理，造成严重的环保压力。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了一种新型的没食子儿茶素没食子酸酯的制备方法。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案，包括如下步骤：

S1：将EGCG原料加入酸液进行溶解，加热搅拌反应后冷却至室温，得到反应液：

S2：加入碱液调节反应液pH值至近中性，再将其加入到已处理好的装有PS-DVB微球的层析柱内，然后用醇溶液进行洗脱，直至无明显GCG流出为止；

S3：按照每0.5个柱体积流出量接收洗脱液，薄层检测并选取含有目标成分的洗脱液；

S4：浓缩除醇后放置析晶，即得没食子儿茶素没食子酸酯。

优选地，前述酸液为盐酸、醋酸或磷酸，浓度为0.001-0.1mol/L。

更优选地，前述步骤S2中，所述碱液为氢氧化钠溶液，浓度为0.001-0.1mol/L，调节反应液的pH值为6.5~7.5。

再优选地，前述酸液与EGCG原料的重量体积比为2-50。

进一步优选地，前述步骤S1中，反应时的加热温度为60-100℃，反应时间为4-16小时。

更进一步优选地，前述PS-DVB微球是由高交联度聚苯乙烯/二乙烯苯颗粒为基质组成的反相色谱填料，微球粒径为20-200μm(微米)，装柱体积与EGCG原料重量体积比为5-50。

再进一步优选地，前述醇溶液为甲醇或乙醇与水的混合溶液，醇浓度为5%-30%。

且，需要说明的是，本发明的发明者在研究EGCG性质的过程中，无意中发现在一定酸浓度以及温度作用下，EGCG可以以某种特定的形式向GCG构型进行转化，而且该转化形式不可逆转，从而为制备高纯度的GCG提供了一种更为高效的途径。

本发明的有益之处在于：

（1）本发明的一种没食子儿茶素没食子酸酯的制备方法操作安全简便，反应温度适中，工序周期明显缩短，所涉及的方法可以以等效方式进行放大，工艺简捷，操作方便，完全能够满足于工业化生产要求；

（2）本发明不使用乙酸乙酯、正丁醇等有机毒性试剂，大大降低了在制备的过程中的危险系数；

（3）本发明选择新型反相色谱填料PS-DVB微球，分离纯化效果显著，处理方式简单，也不需要使用大量酸碱以及醇溶液进行再生处理，减少了环保压力；

（4）本发明所使用的酸液浓度低，避免了酸溶液浓度过高引起反应机制的改变，从而造成反应的失败或者反应转化效率低；

（5）本发明通过结晶技术获得最终产品，可以进一步地提高目标成分的质量，如颜色、纯度、残留溶剂。

附图说明

图1是实施例1样品核磁共振氢谱图；

图2是实施例1样品核磁共振碳谱图；

图3是实施例1样品质谱图；

图4是市购的没食子儿茶素没食子酸酯标准品的对照氢谱图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但这些实施例不用来限制本发明的范围。

实施例1：

取EGCG粉末50g为原料，加入2500ml的0.001mol/L盐酸溶液进行溶解，逐渐加热至100℃后搅拌反应16个小时，停止加热并冷却至室温，加入0.001 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至近中性，得到反应后溶液；将反应后溶液逐渐加入到已处理好的装有PS-DVB微球的层析柱内（微球粒径范围为100-200um，装柱体积为2500ml），然后用5%乙醇溶液进行洗脱，直至无明显GCG流出为止，按照每0.5个柱体积流出量接收洗脱液，薄层检测并选取含有目标成分的洗脱液，浓缩除醇后放置析晶，即得白色粉末16.2g。

经鉴别，本实施例得到的白色粉末确定为GCG（没食子儿茶素没食子酸酯），具体的鉴别方法下面将进行详细说明。另外，经HPLC（高效液相色谱法）检测，其纯度为94.9%。

实施例2：

取EGCG粉末50g为原料，加入100ml的0.1mol/L醋酸溶液进行溶解，逐渐加热至60℃后搅拌反应4个小时，停止加热并冷却至室温，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至近中性，得到反应后溶液；将反应后溶液逐渐加入到已处理好的装有PS-DVB微球的层析柱内（微球粒径范围为20-40um，装柱体积为250ml），然后用5%甲醇溶液进行洗脱，直至无明显GCG流出为止，按照每0.5个柱体积流出量接收洗脱液，薄层检测并选取含有目标成分的洗脱液，浓缩除醇后放置析晶，即得没食子儿茶素没食子酸酯白色粉末24.1g，经HPLC检测，其纯度为96.0%。

实施例3：

取EGCG粉末50g为原料，加入500ml的0.01mol/L磷酸溶液进行溶解，逐渐加热至80℃后搅拌反应10个小时，停止加热并冷却至室温，加入0.01mol/L氢氧化钠溶液调节pH至近中性，得到反应后溶液；将反应后溶液逐渐加入到已处理好的装有PS-DVB微球的层析柱内（微球粒径范围为60-100um，装柱体积为500ml），然后用30%乙醇溶液进行洗脱，直至无明显GCG流出为止，按照每0.5个柱体积流出量接收洗脱液，薄层检测并选取含有目标成分的洗脱液，浓缩除醇后放置析晶，即得没食子儿茶素没食子酸酯白色粉末15.9g，经HPLC检测，其纯度为95.8%。

实施例4：

取EGCG粉末50g为原料，加入500ml的0.05mol/L盐酸溶液进行溶解，逐渐加热至100℃后搅拌反应6个小时，停止加热并冷却至室温，加入0.05mol/L氢氧化钠溶液调节pH至近中性，得到反应后溶液；将反应后溶液逐渐加入到已处理好的装有PS-DVB微球的层析柱内（微球粒径范围为20-50um，装柱体积为250ml），然后用20%乙醇溶液进行洗脱，直至无明显GCG流出为止，按照每0.5个柱体积流出量接收洗脱液，薄层检测并选取含有目标成分的洗脱液，浓缩除醇后放置析晶，即得没食子儿茶素没食子酸酯白色粉末21.3g，经HPLC检测，其纯度为94.4%。

纯度和结构确证检测

（1）纯度测试：

采用岛津LC-20AT型号高效液相色谱仪以及安捷伦TC-C18填料色谱柱，在波长278nm条件下测试各实施例中获得的GCG样品纯度，纯度检测结果见以上各实施例。

（2）结构确证测试：

没食子儿茶素没食子酸酯的结构式为：

测试样品为本发明中实施例1中所制得的样品，采用BRUKER AV-500型核磁共振仪在DMSO-d6溶液中的测试氢谱与碳谱，采用Waters Q-TOF MicroTM质谱仪测试质荷比，测试结果经解析确定样品为GCG，测试图谱见附图1-3。

氢谱图与没食子儿茶素没食子酸酯对照氢谱图对比一致（对照品氢谱图见附图4）。实施例1的样品纯度为94.9%，而对照品的纯度为99.96%，因而，在图1中1ppm附近出现了一些杂质峰，这在图4中是不存在的，故做说明。

从碳谱图来看，酯基碳碳谱化学为一般在160-185ppm之间，C=O与不饱和基团相连，化学位移向高场位移，碳谱中δ165.3115为 C

综上，EGCG在一定酸浓度以及温度作用下，可以以特定的形式向GCG构型进行转化，而且该转化形式不可逆转，从而为制备高纯度的GCG提供了一种更为高效的途径。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。