一种非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及免疫检测技术领域，公开了一种非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72及其制备方法和应用。本发明所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过对非洲猪瘟病毒天然衣壳蛋白P72的蛋白结构进行分析，采用特殊位点氨基酸突变的方式设计P72蛋白序列，可以使P72蛋白无需依靠辅助蛋白B602L即可形成三聚体结构，与天然P72蛋白具有相似的蛋白结构、免疫原性，免疫机制与天然蛋白也更相近，可应用于制备检测非洲猪瘟病毒的产品、制备非洲猪瘟抗体或制备非洲猪瘟疫苗中。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72及其制备方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性及高度致死性传染病，死亡率接近100%，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物疫病，在我国被列为一类动物疫病。目前针对非洲猪瘟，尚没有有效的预防和治疗措施，疫情爆发后进行快速的诊断、隔离扑杀是主要的防控手段。2018年8月在我国首次爆发非洲猪瘟，导致上千万头猪被扑杀，给我国养猪业造成巨大经济损失。针对非洲猪瘟疫情，急需快速、准确的检测方法和有效的预防疫苗。

非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是一种有囊膜的双链DNA病毒。在电镜下呈正六边形，正20面体结构，直径约200nm，由5层同心圆结构组成，由内到外依次为类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。非洲猪瘟病毒可编码200多种蛋白质，其中P72蛋白是非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白，也是组成病毒20面体衣壳的主要成分，P72蛋白占病毒颗粒总重33%左右，在天然的非洲猪瘟病毒颗粒中，P72蛋白以稳定的三聚体形式组成正二十面体衣壳。P72蛋白具有保守的抗原性和稳定的免疫原性，常用于血清学诊断和免疫制剂开发。

清华大学医学院向烨研究团队等人在Cell Research上在线发表了题为Structure of the African swine fever virus major capsid protein P72的文章，在研究P2蛋白初期，向烨研究组发现单独重组表达P72蛋白不能得到有正确折叠构象的P72蛋白。只有当P72和B602L在HEK293F细胞中共同表达时，才能正确折叠和组装P72。构象正确的P72蛋白对非洲猪瘟病毒的快速诊断和重组亚单位疫苗的开发至关重要，但是通过重组表达的方法，在大肠杆菌、酵母和昆虫-杆状病毒等表达系统中很难得到全长稳定三聚体结构的P72蛋白，必须借助B602L才可以正确组装。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72及其制备方法，使得所述P72蛋白无需辅助蛋白B602L即可正确组装，与天然P72蛋白（与B602L共表达的P72蛋白）具有相似的蛋白结构、免疫原性，免疫机制与天然蛋白也更相近；

本发明的另外一个目的在于提供上述P72蛋白在制备检测非洲猪瘟病毒的产品、在制备非洲猪瘟抗体或在制备非洲猪瘟疫苗中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72，序列如SEQ ID NO: 1所示。

针对野生型P72蛋白无法通过单独重组表达获得正确折叠构象的问题，本发明通过对其进行L86P、N196P、I216P、K220P、L343P、F337P、N449P、 S477P、H482P、Q509P、H545P、H565P、Y566P、I618P的14个位点突变，获得了能够无需依靠辅助蛋白B602L即可正确组装形成三聚体构型的重组P72蛋白。

作为优选，重组非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72含有标签，标签能使衣壳蛋白P72更容易分离与纯化。标签可以选择常用的蛋白标签，可以添加在P72蛋白的N端或者C端。在本发明具体实施方式中，标签选择Twin-Strep标签（序列如SEQ ID NO: 2所示），该标签能够高效、特异结合链霉亲和素，经过一步纯化，蛋白纯度即可达90%以上；并且Twin-Strep标签较小，对重组衣壳蛋白P72结构影响很小。更为具体地，Twin-Strep标签融合在P72蛋白的N端。同时，本发明还提供了所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72的编码基因。在本发明具体实施方式中，本发明提供了含有Twin-Strep标签的编码基因，序列如SEQ ID NO: 3所示。

本发明利用电镜表征非洲猪瘟衣壳蛋白P72蛋白结构，通过结构发现蛋白形成稳定的三聚体。同时，本发明所述P72蛋白和天然P72蛋白利用间接ELISA检测灵敏性和特异性，结果显示本发明所述P72蛋白与天然P72蛋白（与B602L共表达的P72蛋白）具有相似的蛋白结构、免疫原性，免疫机制与天然蛋白也更相近，具有较高灵敏度和特异性。与市售的商品化非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒对134份猪血清进行ELISA检测，结果显示检测结果与商品化检测试剂盒的检测结果符合度达92%。

基于以上优异的技术效果，本发明提出了所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72在制备检测非洲猪瘟病毒的产品、在制备非洲猪瘟抗体或在制备非洲猪瘟疫苗中的应用。所述非洲猪瘟抗体包括单抗或多抗。

其中，所述检测非洲猪瘟病毒的产品为用于检测非洲猪瘟病毒或其抗体的试剂盒，或用于检测非洲猪瘟病毒或其抗体的试纸卡。所述非洲猪瘟病毒既可以是整个病毒也可以是部分病毒抗原。

本发明提供了所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72的蛋白序列，本领域技术人员可以依据现有的技术手段去人工合成；作为优选，本发明通过微生物菌株进行重组表达制备获得非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72。

更优选地，通过酿酒酵母进行重组表达制备获得非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72。具体地，利用CRISPR-Cas9技术，将带有同源重组臂的本发明所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72的编码基因表达盒，通过酿酒酵母同源重组机制的方式插入到酿酒酵母基因组中，然后培养酿酒酵母获得其表达的非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72。为了获得更多的蛋白，优选将表达盒插入到酿酒酵母基因组中的多拷贝位点，例如Ty2逆转录转座子。

由以上技术方案可知，本发明通过对非洲猪瘟病毒天然衣壳蛋白P72的蛋白结构进行分析，采用特殊位点氨基酸突变的方式设计P72蛋白序列，可以使P72蛋白无需依靠辅助蛋白B602L即可形成三聚体结构，与天然P72蛋白具有相似的蛋白结构、免疫原性，免疫机制与天然蛋白也更相近，可应用于制备检测非洲猪瘟病毒的产品、制备非洲猪瘟抗体或制备非洲猪瘟疫苗中。

附图说明

图1所示为本发明P72纯化蛋白SDS-PAGE胶图；

图2所示为本发明 P72蛋白三聚体负染电镜图片；

图3 所示为本发明P72蛋白三聚体冷冻电镜图片（侧面图和俯视图）。

具体实施方式

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72及其制备方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72及其制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。在对比试验中，如无特别说明，除蛋白差异外，其他实验条件保持一致。

本发明具体提供了一种非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72的制备方法，将所述P72蛋白编码基因与酵母GAL1启动子和ADH1终止子构建到质粒上形成P72蛋白基因表达盒。通过PCR扩增出带有同源重组臂的P72蛋白基因表达盒作为修复模板。利用CRISPR-Cas9技术，共表达识别GGATTTAGGAATCCATAAAA（SEQ ID NO: 4所示）的gRNA，将P72蛋白基因表达盒通过同源重组的方式插入到酿酒酵母多拷贝的Ty2逆转录转座子中，实现基因多拷贝表达。将修复模板和pCas-ty2质粒共转化酿酒酵母BY4743中，利用缺URA的平板进行克隆筛选。筛选出单克隆，通过qPCR方法鉴定拷贝数，挑取高拷贝菌株进行表达检测。

高拷贝菌株培养后离心收集沉淀，高压匀浆机破碎酵母细胞，然后进行蛋白纯化，获得本发明所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72。

以下就本发明所提供的一种非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72及其制备方法和应用做进一步说明。

实施例1：本发明所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72制备方法

1. 非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72重组表达菌株的制备

本发明通过生物信息学方法分析，使用化学合成的方法合成非洲猪瘟病毒的p72（strep-tag）基因序列，如SEQ ID NO.3所示。将p72基因与酵母GAL1启动子和ADH1终止子构建到质粒上形成P72蛋白基因表达盒。通过PCR扩增出带有同源重组臂的P72蛋白基因表达盒作为修复模板。利用CRISPR-Cas9技术，共表达识别GGATTTAGGAATCCATAAAA（SEQ ID NO:4所示）的gRNA，将P72蛋白基因表达盒通过同源重组的方式插入到酿酒酵母多拷贝的Ty2逆转录转座子中，实现基因多拷贝表达。将修复模板和pCas-ty2质粒共转化酿酒酵母BY4743中，利用缺URA的平板进行克隆筛选。筛选出单克隆，通过qPCR方法鉴定拷贝数，挑取高拷贝菌株进行表达检测。

2. 重组蛋白表达

挑选高拷贝阳性单克隆酿酒酵母菌落接种于YPD液体培养基中，30℃过夜培养。取过夜培养的菌液于YPD+2%葡萄糖液体培养基中100倍扩大培养，30℃培养60h至OD

3. 重组蛋白纯化

取1L酿酒酵母培养物，6000 rpm，离心10 min，收集沉淀。沉淀用50ml buffer W（IBA）重悬，然后用高压匀浆机破碎酵母细胞，17000rpm 4℃离心60分钟，取上清用0.45 μm滤膜过滤，进行纯化。应用Strep-Tactin XT gravity-flow 柱（IBA）进行融合蛋白亲和纯化，主要操作步骤如下：

a.用10ml buffer W（IBA）平衡层析柱，取过滤后上清加到层析柱中。然后通过重力流缓慢流出，重复操作两次。

b.用20 mL buffer W（IBA）洗涤，洗除杂蛋白。

c.用洗脱buffer BXT (IBA) 洗脱所需目的蛋白，收集洗脱液，1ml/管。

d.将目的蛋白收集，并用Merck-Millipore 30KD浓缩管浓缩蛋白。

e.在4℃条件下用FPLC平衡分子筛（Superdex S-200，GE），流速为1ml/min。将蛋白分批上样至上样环，用分子筛进一步纯化P72蛋白。

f.收集的样品进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示，纯化后胶图中出现单一条带，大小约为73kD。将目的蛋白用Merck-Millipore 30KD浓缩管浓缩，然后通过BCA方法测蛋白浓度，浓度为5mg/ml，共4ml。

实施例2：分析非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72

1、负染电镜分析

将提前配置好的2%负染剂（PTA）用台式小离心机13000rpm离心10min；

用镊子夹住提前辉光放电处理过的铜网边缘，向有碳膜的一面滴加5μl浓度为0.07mg/ml的样品，静置1min，用滤纸由铜网边缘吸走多余液体；

向铜网滴加5μl 2% PTA，静置1min后吸走多余液体，待铜网上残余液体挥发，负染样品制备完毕；

将样品用镊子置入样品杆，在120kVFEI Tecnai Spirit显微镜上收集显微照片，从图像分析可得，P72蛋白形成三聚体结构，结果如图2所示。

2、冷冻电镜数据收集和图像处理

使用Vitrobot Mark II，设置湿度为滤纸加湿，并组装好液态乙烷、液氮装置；

用冷冻制样的专用镊子夹取一个提前辉光放电处理的铜网，放入仪器准备制样，在铜网的一侧加入3μl蛋白浓度为0.2mg/ml的样品，启动仪器操作按钮；

待仪器操作完成后，小心地将铜网从液态乙烷中快速转入液氮中，冷冻样品制备完毕；

采用300kV FEI Arctica电子显微镜对样品进行数据收集；

遵循RELION的常规处理流程进行数据分析。对拍取的照片进行挑选，再进行手动挑选颗粒，经二维分类，选择几个具有不同取向的二维分类作为模版让程序自动化挑选单颗粒；检查挑选出的单颗粒，剔除不好的颗粒后进行归一化处理；计算CTF相关参数；将二维分类中挑选的颗粒进行auto-refine，加入C3对称性，对单颗粒进行三维分类，进行多循环过程直到收敛。p72三聚体的PDB模型6KU9用于初始数据处理。经处理，由金标准FSC确定的最终分辨率为3.4Å。结果见图3。

综合图2和图3可以说明，本发明提供的P72蛋白可以形成稳定的三聚体，具有与天然P72蛋白相似的蛋白结构。

实施例3：基于非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72的抗体ELISA检测

1、间接ELISA检测方法建立

以非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72为包被抗原，经过常规ELISA方法优化筛选出最佳抗原包被浓度，最佳封闭液、血清稀释液、酶标二抗稀释液、酶标二抗浓度等，建立间接ELISA检测方法。

2、间接ELISA检测方法的灵敏性和特异性

应用建立的间接ELISA方法对非洲猪瘟病毒抗体阳性血清进行检测，血清以1:100倍稀释为起始点，依次做倍比稀释至1:16000倍，检测灵敏性可达1:16000，与天然P72蛋白（与B602L共表达的P72蛋白）相似，结果见表1。

应用建立的间接ELISA方法依次对非洲猪瘟病毒抗体阳性血清和阴性血清、猪瘟病毒抗体阳性血清、猪蓝耳病毒抗体阳性血清、猪伪狂犬病毒抗体阳性血清和猪圆环病毒抗体阳性血清进行检测，结果如表 2所示，利用本发明提供的P72蛋白按照间接ELISA抗体检测方法检测，只与非洲猪瘟病毒抗体阳性血清检测成阳性反应，与其他猪病抗体阳性血清检测均成阴性，表明本发明P72蛋白具有较高的特异性。

3、间接ELISA检测方法的符合率测定

应用建立的间接ELISA抗体检测方法和商品化的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒对134份猪血清进行检测，结果显示本方法的检测结果与商品化检测试剂盒的检测结果符合度达92%。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

清华大学

<120> 一种非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72及其制备方法和应用

<130> MP2028007

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 646

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Ser Gly Gly Ala Phe Cys Leu Ile Ala Asn Asp Gly Lys Ala

1 5 10 15

Asp Lys Ile Ile Leu Ala Gln Asp Leu Leu Asn Ser Arg Ile Ser Asn

20 25 30

Ile Lys Asn Val Asn Lys Ser Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Glu Pro Thr

35 40 45

Leu Ser Gln Ile Glu Glu Thr His Leu Val His Phe Asn Ala His Phe

50 55 60

Lys Pro Tyr Val Pro Val Gly Phe Glu Tyr Asn Lys Val Arg Pro His

65 70 75 80

Thr Gly Thr Pro Thr Pro Gly Asn Lys Leu Thr Phe Gly Ile Pro Gln

85 90 95

Tyr Gly Asp Phe Phe His Asp Met Val Gly His His Ile Leu Gly Ala

100 105 110

Cys His Ser Ser Trp Gln Asp Ala Pro Ile Gln Gly Thr Ser Gln Met

115 120 125

Gly Ala His Gly Gln Leu Gln Thr Phe Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp

130 135 140

Asp Asn Gln Thr Pro Leu Glu Gly Ala Val Tyr Thr Leu Val Asp Pro

145 150 155 160

Phe Gly Arg Pro Ile Val Pro Gly Thr Lys Asn Ala Tyr Arg Asn Leu

165 170 175

Val Tyr Tyr Cys Glu Tyr Pro Gly Glu Arg Leu Tyr Glu Asn Val Arg

180 185 190

Phe Asp Val Pro Gly Asn Ser Leu Asp Glu Tyr Ser Ser Asp Val Thr

195 200 205

Thr Leu Val Arg Lys Phe Cys Pro Pro Gly Asp Pro Met Thr Gly Tyr

210 215 220

Lys His Leu Val Gly Gln Glu Val Ser Val Glu Gly Thr Ser Gly Pro

225 230 235 240

Leu Leu Cys Asn Ile His Asp Leu His Lys Pro His Gln Ser Lys Pro

245 250 255

Ile Leu Thr Asp Glu Asn Asp Thr Gln Arg Thr Cys Ser His Thr Asn

260 265 270

Pro Lys Phe Leu Ser Gln His Phe Pro Glu Asn Ser His Asn Ile Gln

275 280 285

Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile Thr Pro Ile Thr Asp Ala Thr Tyr Leu

290 295 300

Asp Ile Arg Arg Asn Val His Tyr Ser Cys Asn Gly Pro Gln Thr Pro

305 310 315 320

Lys Tyr Tyr Gln Pro Pro Leu Ala Leu Trp Ile Lys Leu Arg Phe Trp

325 330 335

Pro Asn Glu Asn Val Asn Pro Ala Ile Pro Ser Val Ser Ile Pro Phe

340 345 350

Gly Glu Arg Phe Ile Thr Ile Lys Leu Ala Ser Gln Lys Asp Leu Val

355 360 365

Asn Glu Phe Pro Gly Leu Phe Val Arg Gln Ser Arg Phe Ile Ala Gly

370 375 380

Arg Pro Ser Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly

385 390 395 400

Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn

405 410 415

Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg

420 425 430

Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Val Thr His Thr Asn Asn

435 440 445

Pro His His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile Glu

450 455 460

Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys Pro Thr Trp Asn Ile Pro Asp Gln Asn

465 470 475 480

Pro Pro Gln His Arg Asp Trp His Lys Phe Gly His Val Val Asn Ala

485 490 495

Ile Met Gln Pro Thr His His Ala Glu Ile Ser Phe Pro Asp Arg Asp

500 505 510

Thr Ala Leu Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro Val

515 520 525

Thr Tyr Pro Ile Thr Leu Pro Ile Ile Lys Asn Ile Ser Val Thr Ala

530 535 540

Pro Gly Ile Asn Leu Ile Asp Lys Phe Pro Ser Lys Phe Cys Ser Ser

545 550 555 560

Tyr Ile Pro Phe Pro Pro Gly Gly Asn Ala Ile Lys Thr Pro Asp Asp

565 570 575

Pro Gly Ala Met Met Ile Thr Phe Ala Leu Lys Pro Arg Glu Glu Tyr

580 585 590

Gln Pro Ser Gly His Ile Asn Val Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile

595 600 605

Ser Trp Asp Thr Asp Tyr Val Gly Ser Pro Thr Thr Ala Asp Leu Val

610 615 620

Val Ser Ala Ser Ala Ile Asn Phe Leu Leu Leu Gln Asn Gly Ser Ala

625 630 635 640

Val Leu Arg Tyr Ser Thr

645

<210> 2

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 3

<211> 2028

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtggtctc atcctcaatt tgaaaagggt ggtggtagtg gtggtggatc aggtgggtca 60

tctgcttgga gccatccaca attcgaaaaa atggcatctg gtggcgcctt ctgtctaatt 120

gctaacgacg gtaaagcaga taagatcatc cttgcacagg atttgctgaa ttctagaatt 180

tcaaacataa agaatgtgaa taagtcctat ggtaaacccg accctgaacc caccttgagc 240

caaatcgagg aaaccccttt ggtgcatttc aacgcacatt tcaaaccgta cgtaccagtt 300

ggctttgaat ataacaaagt cagaccccat accgggactc caactctggg caataagttg 360

acatttggaa taccgcaata tggcgacttc tttcatgaca tggtcgggca tcatattttg 420

ggggcatgtc actcaagttg gcaagacgca ccaattcagg gcacttccca aatgggggcg 480

cacggtcagc tgcaaacctt tccaagaaac ggttatgatt gggacaatca aacccctcta 540

gagggtgctg tttatacctt ggttgatccc ttcggtaggc caatccctcc cggtacaaaa 600

aacgcgtata gaaatctagt gtactactgc gaatacccgg gagaaaggct ttacgaaaac 660

gtgcgttttg atgttaacgg taactctcta gacgaatact ctagcgatgt aactactcta 720

gtcagaaaat tttgcccgcc tggagatccc atgacaggtt acaaacacct ggtcggacaa 780

gaagttagtg tagaaggcac ttctggacca ttattgtgta atattcatga tcttcataaa 840

ccacatcaat caaaaccaat cttaacagat gagaatgata ctcaacgtac ttgtagtcat 900

actaatccaa aattcttaag ccagcatttc ccggagaatt ctcataacat acaaaccgca 960

ggtaaacagg atattacacc aataacggat gctacatatt tggacattcc gaggaatgtt 1020

cattatccat gtaatggtcc acaaactcca aagtattacc agccccctct tgccctatgg 1080

atcaagctta ggttttggtt taatgaaaat gtgaacttgg caatacctag tgtttctatc 1140

ccctttggcg aaaggtttat cactatcaag cttgcatctc agaaggacct agtgaacgaa 1200

ttccccggat tgtttgttag acagtcaaga ttcatagctg ggagaccatc tagaaggaat 1260

ataaggttta aaccatggtt cataccaggc gttattaatg aaatcagttt aacaaataat 1320

gagttgtaca ttaataacct gttcccgacc cctgaaattc acaatttgtt cgttaagaga 1380

gtcaggttta gtttgatcag agtgcacaaa acccaagtca cacatacaaa taacaatcac 1440

catgatgaaa aattgatgag cgcattgaaa tggcctattg aatatatgtt tattgggctg 1500

aaacctacat ggaatattcc agatcctaac cccccacaac atagagattg gcacaaattt 1560

ggtcacgttg ttaatgcaat catgcaacca acacatcacg cagaaatttc atttcaagat 1620

agagatacag ctccacctga tgcatgtagt tctattagtg atatttctcc agtgacctat 1680

cctatcacgc tgcctatcat caaaaatata tccgtgacgg cacacggtat aaatttaata 1740

gacaaattcc cgtctaaatt ttgctcatca tacattccat ttcccccagg tggcaatgcc 1800

ataaaaaccc cagatgatcc cggagcaatg atgatcacct tcgctttaaa acctagagaa 1860

gaataccagc cctcaggtca catcaatgta tctagagcca gggaatttta catttcatgg 1920

gataccgact acgttggttc tattacaact gctgacttgg ttgtgagtgc ctctgcaatt 1980

aacttcctgt tgctacagaa cgggtcagcc gttttgagat acagcacc 2028

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatttagga atccataaaa 20