非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其衣壳蛋白P72的原核表达

摘要

本论文由两部分组成，一是非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立；二是非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72在大肠杆菌中的表达。主要试验和结果如下： 1.为建立一种快速、准确、特异的ASFV定量检测方法，根据TaqMan探针荧光定量分析原理，借助计算机辅助，对ASFV基因序列进行分析并利用Beacondisigner软件对检测引物和探针进行了优化筛选；利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的退火温度、镁离子、引物、探针浓度等参数进行了优化并对本方法的灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估，同时通过对田间样品的检测对本方法的检测效果进行检验，建立了ASFV实时荧光定量PCR检测方法。经优化，荧光PCR反应中退火温度、Mg2+、探针和引物的最佳浓度分别为52℃、4.5mmo/L、500nmol/L和400nmol/L，最低检出量为102个拷贝数的质粒，特异性为100﹪，Ct值的CV小于5﹪。对送检的15份猪肉样品进行检测，结果全为阴性。上述结果表明，所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASF病毒核酸进行定量分析，从而为ASF的预防提供了一个更新、更为可靠的检测方法。 2.利用PCR技术，从含非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因的克隆质粒BBBBPr4中扩增出1.94kb的P72基因。将P72基因和表达载体pET-30c(+)分别用限制性核酸内切酶FhaⅠ/XHoⅠ和BamHⅠ/XHoⅠ进行双酶切，然后在T4DNA连接酶作用下，将P72基因定向克隆至载体pET-30c(+)中相应位点上，并转化至宿主菌BL21(DE3)中，得到了重组菌株BL21(DE3)(pET-ASFVP72)。经PCR鉴定，构建的重组菌株中含有P72基因。重组菌株BL21(DE3)(pET-ASFVP72)经IPTG诱导后，其表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析，结果表明衣壳蛋白P72基因可以在受体菌中高效表达，达到了菌体总蛋白的34﹪，表达产物的分子量约为78kD，并能被ASFV抗体所识别。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩写词表

独创性声明及关于论文使用受权的说明

第一章引言

1非洲猪瘟及其危害

2非洲猪瘟病毒研究

3非洲猪瘟诊断、检测技术研究

3.1 ASFV感染的临床诊断

3.2 ASFV的实验室分析

4非洲猪瘟病毒检测常用的抗原、抗体及其制备

5 PCR检测常用的目的基因

6 ASFV检测方法的发展趋势

7实时定量荧光PCR技术简介

7.1实时定量荧光PCR原理

7.2常用的荧光PCR探针

7.3实时定量荧光PCR的定量方法

7.4实时定量荧光PCR的特点

7.5实时定量荧光PCR技术的应用

第二章非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1实时荧光PCR反应体系相关参数的确定

2.2检测的敏感度与定量线性分析及与常规PCR结果判定的比较

2.3实时荧光定量PCR反应的重复性

2.4实时荧光PCR反应的特异性

2.5田间样品荧光定量PCR检测结果

3讨论

3.1荧光定量PCR反应的特点

3.2影响荧光定量PCR反应的因素

3.3实验室PCR产物的污染问题

3.4荧光PCR反应的优点与不足

3.5开发荧光PCR检测试剂盒的构想

第三章非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72在大肠杆菌中的表达

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1目的蛋白抗原决定簇、跨膜区预测

2.2 PCR扩增目的基因P72,结果见图3-3

2.3表达载体pET-ASFVP72的构建

2.4重组质粒的稳定性

2.5表达产物SDS-PAGE、溶解性和Western-blotting分析

2.6重组蛋白的纯化

3讨论：

3.1表达系统及表达载体的选择

3.2影响大肠杆菌系统表达的因素

3.3实验中遇到的问题

4小结

第四章结论

参考文献

致谢

附录

作者简介