一种提高谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸产量的方法

摘要

本发明公开了一种提高谷氨酸棒杆菌合成5‑氨基乙酰丙酸产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明成功实现了敲除α‑酮戊二酸抑制蛋白和琥珀酸脱氢酶以及过表达5‑氨基乙酰丙酸合成酶的重组谷氨酸棒杆菌的构建。采用5‑L发酵罐分批发酵策略，优化发酵条件，最终重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 13032/△odhI△sdhA/pXMJ19‑hemA发酵84h，在加终浓度4g/L甘氨酸的情况下在48h合成了25.05g/L的5‑ALA，生产率为0.52g/L/h，此时糖酸转化率达到16.79％。实现了5‑氨基乙酰丙酸的高产，获得了以葡萄糖为碳源开始一步发酵的截止目前的最高产量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸产量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，5-ALA)是很多四吡咯化合物例如血红素、叶绿素、维生素B12前体的一种非蛋白原氨基酸。在诸多领域尤其医药和农业方面有着非常重要的作用。在医药行业，5-ALA目前主要被应用于各种癌症的光动力诊断治疗和多种疾病的肿瘤定位。在农业领域，它被用作一种可生物降解的除草剂、杀虫剂或对作物、动物和人类无毒的生长调节剂。

5-ALA生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。由于化学合成法产量低，又存在严重的环境污染问题，因而不适合大规模的生产。因此，目前国内外主要采用微生物菌株发酵生产5-ALA。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是我国一种短杆或小棒状、无芽孢、无内毒素的革兰氏阳性菌株，在国内的氨基酸生产中被广泛应用。杨等运用分批补料发酵和两阶段发酵的策略，以重组C.glutamicum C4途径最终产生14.7g/L 5-ALA，生产率为0.92g/L/h，这是迄今为止报道的通过C.glutamicum以葡萄糖为原料合成5-ALA的最高产率(具体参见文献Yang P,Liu W,Cheng X,et al.A new strategy for production of5-aminolevulinic Acid in recombinant Corynebacterium glutamicum with highyield.Appl Environ Microbiol,2016,82(9):2709-2717.)，但是，该方法的缺点为需要两阶段发酵，并且培养基成分较复杂，甘氨酸的初始浓度较高，还需要添加琥珀酸。

由于目前发酵生产5-ALA的水平普遍较低，导致5-氨基乙酰丙酸的价格比较的昂贵，并且目前生产5-ALA的产能并不能满足国内需求；因此，提高5-ALA的发酵生产水平非常重要。

发明内容

技术问题

本发明要解决的技术问题是提高5-氨基乙酰丙酸的产量，同时，提高5-ALA的发酵生产水平。

技术方案

为了解决上述技术问题，本发明构建了一种重组谷氨酸棒杆菌，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主，敲除了α-酮戊二酸抑制蛋白odhI和琥珀酸脱氢酶sdhA，并且过表达了5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA。

在本发明的一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌是以pXMJ19质粒或pK18mobsacB质粒为表达载体，过表达了5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA。

在本发明的一种实施方式中，所述α-酮戊二酸抑制蛋白odhI的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述α-酮戊二酸抑制蛋白odhI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述琥珀酸脱氢酶sdhA的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述琥珀酸脱氢酶sdhA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了一种构建重组谷氨酸棒杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建宿主细胞：通过敲除谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 13032中编码α-酮戊二酸抑制蛋白odhI的基因odhI和编码琥珀酸脱氢酶sdhA的基因sdhA，构建宿主细胞C.glutamicum13032△odhI△sdhA；

(2)构建重组质粒：将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA与穿梭型载体pXMJ19连接，得到重组质粒pXMJ19-hemA；

(3)将重组质粒pXMJ19-hemA电转入重组谷氨酸棒杆菌株C.glutamicum 13032△odhI△sdhA，构建得到重组菌C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述谷氨酸棒杆菌是以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，采用同源重组的方法敲除α-酮戊二酸抑制蛋白odhI：以pK18mobsacB质粒作为载体，设计两段同源臂，将odhI基因与载体进行连接，完成第一次同源重组后，采用蔗糖平板进行筛选，完成第二次交换，得到odhI敲除成功的重组谷氨酸棒杆菌株，命名为谷氨酸棒杆菌C1；

在C1菌株中按照相同的方法继续敲除基因sdhA，得到菌株C.glutamicum 13032△odhI△sdhA。

本发明还提供了一种生产5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法为，应用上述重组谷氨酸棒杆菌，以葡萄糖为原料，发酵生产5-氨基乙酰丙酸。

在本发明的一种实施方式中，将上述重组谷氨酸棒杆菌添加至种子培养基中，得到种子液；将种子液接种至发酵培养基中，进行发酵培养，生产5-氨基乙酰丙酸。

在本发明的一种实施方式中，所述种子液按8～12％的比例接种至发酵培养基中，进行发酵培养。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：葡萄糖125-140g/L，硫酸铵20-25g/L，磷酸二氢钾2-3g/L，七水合硫酸镁0.5-1g/L，玉米浆30-50g/L，七水合硫酸亚铁0.02-0.05g/L，一水合硫酸锰0.02-0.05g/L，尿素1-2g/L。

在本发明的一种实施方式中，将上述发酵培养基用体积分数为50％的氨水调节其pH至6.5，在121℃下高温灭菌20min，葡萄糖分消。

在本发明的一种实施方式中，所述种子液的制备方法是从活化平板上挑取单菌落接种于含氯霉素的BHI培养基中，30℃振荡培养24h，然后全部转接于种子培养基中，30℃培养20-22h。

在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基组成：葡萄糖140-150g/L，三水合磷酸氢二钾1-2g/L，硫酸镁0.6-1.0g/L，玉米浆5-8g/L，七水合硫酸亚铁0.002-0.005g/L，一水合硫酸锰0.002-0.005g/L，尿素7.0-8.0；去离子水配置，pH 7.0。

在本发明的一种实施方式中，将重组谷氨酸棒杆菌添加至种子培养基中，在28-32℃、180-200rpm条件下培养20-24h，得到种子液。

在本发明的一种实施方式中，将种子液接种至发酵培养基中，在28-32℃、200-220rpm条件下培养84-96h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将重组谷氨酸棒杆菌添加至含有种子培养基的5-L发酵罐中，得到种子液，将得到的种子液按照10％(v/v)的比例接种至含有发酵培养基的5-L发酵罐中，在30℃条件下进行发酵培养，制备5-氨基乙酰丙酸。

在本发明的一种实施方式中，发酵过程中，温度由发酵罐自动控制，pH通过补加体积分数为25％氨水维持稳定。

本发明还提供了上述重组谷氨酸棒杆菌，或上述方法在制备含有5-氨基乙酰丙酸产品中的应用。

有益效果

(1)本发明成功实现了敲除α-酮戊二酸抑制蛋白odhI和琥珀酸脱氢酶sdhA以及过表达5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA的重组谷氨酸棒杆菌的构建。采用本发明提供的方法，在摇瓶阶段，能够实现在66h合成了9.94g/L的5-ALA，生产率为0.15g/L/h，此时糖酸转化率达到62.1％。

(2)采用本发明构建重组谷氨酸棒杆菌在5-L发酵罐中，实行分批发酵策略，优化发酵条件，采用重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA发酵84h，在加甘氨酸的情况下在48h内合成了25.05g/L的5-ALA，生产率为0.52g/L/h，此时糖酸转化率达到16.79％。实现了5-氨基乙酰丙酸的高产，获得了以葡萄糖为碳源开始一步发酵的截止目前的最高产量。

附图说明

图1：5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA基因SDS-PAGE；其中，M：marker；1：C.glutamicum13032/pXMJ19对照；2：C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA上清。

图2：在5升发酵罐中菌株C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA补料分批发酵。

图3：菌株C.glutamicum13032/pXMJ19-hemA和C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA摇瓶发酵图。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的糖酸转化率是指生成的5-氨基乙酰丙酸与消耗的葡萄糖的量的比值，是指菌株利用葡萄糖的能力。

下述实施例中所涉及的溶液配制方法如下：

125g/L葡萄糖溶液：称250g葡萄糖，用蒸馏水定容至400mL，葡萄糖分消。

甘氨酸溶液：称200g甘氨酸，用蒸馏水溶解并最后定容至1000mL。

下述实施例中涉及的培养基如下：

BHI培养基：称取脑心浸液肉汤成品粉末38.5g,搅拌溶解于1000mL蒸馏水中。(固体培养基加入2.0％左右的琼脂粉即可)。

LBGS平板(g/L)：胰蛋白胨10；酵母提取物5；NaCl 10；葡萄糖7；蔗糖100定容至1L，倒LBGS平板。

Kan抗性BHI平板：将BHI固体培养基加热溶解之后加入终浓度50μg/mL的Kan抗生素，倒BHI带有Kan抗性平板。

LB液体培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。

LB固体培养基：在LB液体培养基里加入质量体积比为1.5-2.0％琼脂粉。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

葡萄糖的含量的检测：

取适当稀释后的发酵液上清，用生物传感分析仪测定(SBA-50，山东省科学院生物研究所)葡萄糖的含量。

5-ALA的含量的检测：

5-ALA含量检测方法：称取400μL稀释后的发酵液加入200μL乙酸钠缓冲液(pH4.6)，然后加入100μL乙酰丙酮，于沸水中煮沸15min，冷却至室温后加700μL Ehrlich’s试剂(1g对二甲氨基苯甲醛与8mL的70％的高氯酸用冰乙酸定容至50mL)，显色20min后于554nm波长下测吸光度。

实施例1：敲除α-酮戊二酸抑制蛋白odhI的谷氨酸棒杆菌C1的构建

具体步骤如下：

(1)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，以odhI F1(序列如SEQ IDNO.7所示)和R1(序列如SEQ ID NO.8所示)、odhI F2(序列如SEQ ID NO.9所示)和R2(序列如SEQ ID NO10所示)为引物，进行PCR扩增出上下游两段同源臂各500bp左右，进行融合延伸PCR，纯化回收后的基因片段与pK18质粒酶切后获得的线性化产物利用DNA连接酶连接，将连接产物使用化学转化法导入E.coli BL21感受态细胞，于Kan抗性BHI平板培养，挑取单菌落转接至LB培养基，取菌液抽提重组质粒pK18-△odhI，将pk18-△odhI测序，通过DNAMAN进行序列比对，结果表明基因序列无误，制备得到重组质粒pK18-△odhI。

(2)将步骤(1)得到的重组质粒pK18-△odhI以电穿孔法转化进C.glutamicumATCC13032感受态细胞，得到转化子，将制备得到的转化子培养2h后涂布于Kan抗性BHI平板，30℃培养36～48h进行第一轮筛选，挑取转化子在Kan抗性BHI平板划线，30℃培养24h后挑取单菌落于含有Kan(50μg/mL)的液体BHI培养基继续培养12h，吸取100μL培养液涂布于含有10％蔗糖的BHI无抗固体培养基，进行第二轮筛选，随机挑取在蔗糖平板上生长的转化子进行PCR鉴定，筛选得到odhI缺失菌株C1，提取基因组后再次进行PCR验证并送至苏州金唯智生物科技有限公司测序以确认基因odhI被成功敲除，最终得到谷氨酸棒杆菌C1：C.glutamicum ATCC13032/pK18-△odhI。

实施例2：敲除琥珀酸脱氢酶sdhA的重组谷氨酸棒杆菌的构建

具体步骤如下：

(1)以实施例1构建的谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13032/pK18-△odhI的基因组DNA为模板，以sdhA F1(序列如SEQ ID NO.11所示)和R1(序列如SEQ ID NO.12所示)、sdhA F2(序列如SEQ ID NO.13所示)和R2(序列如SEQ ID NO.14所示)为引物，进行PCR扩增出上下游两段同源臂各500bp左右，进行融合延伸PCR，得到大小为2200bp基因片段，连接至pK18mobsacB载体得到pk18-△sdhA，将pk18-△sdhA测序，通过DNAMAN进行序列比对，结果表明基因序列无误。

(2)将重组质粒pk18-△sdhA电转到谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13032/pK18-△odhI中，得到转化子，将制备得到的转化子进行扩大培养，转接至含蔗糖的LBGS平板上进行筛选，采用菌落PCR进行验证，筛选得到sdhA基因完全敲除的谷氨酸棒杆菌株，命名为谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 13032△odhI△sdhA。

实施例3：5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA在谷氨酸棒杆菌株C.glutamicum 13032-△odhI△sdhA中的克隆与表达

具体步骤如下：

(1)重组质粒的构建

将沼泽红假单胞菌来源的基因hemA(Genebank：AY489557.1)序列于苏州金唯智生物有限公司进行合成。

以合成的含有目的基因的重组质粒为模板，分别使用引物hemA-F、hemA-R，通过PCR扩增获得目的基因片段hemA片段，将得到的hemA片段和pXMJ19质粒采用HindIII和EcoRI双酶切并且连接后，得到重组质粒，将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中，挑取阳性转化子提取质粒，利用质粒为模板，进行PCR验证，结果表明质粒pXMJ19-hemA构建成功。

所述引物hemA-F、hemA-R序列如下：

hemA-F：ACAGAATTAATTAAGCTTAAAGGAGGGAAATCATGGATTACACCAAGTTCTTCGC(SEQ IDNO.15)；

hemA-R：CAAAACAGCCAAGCTGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCCGCAGCGAGCGGC T(SEQ ID NO.16)。

(2)重组谷氨酸棒杆菌的构建

将步骤(1)得到的重组质粒pXMJ19-hemA电转化到实施例2制备得到的谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 13032△odhI△sdhA中，得到重组菌C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA。

将质粒pXMJ19电转化到C.glutamicum 13032菌株中，得到对照菌株C.glutamicum13032/pXMJ19。

(3)5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA的表达

分别将步骤(2)得到的重组菌C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA和对照菌株C.glutamicum 13032/pXMJ19在装有10mL BHI液体培养基的50mL容器中培养16-20h，得到种子液，然后将种子液按2％(v/v)的接种量转移到装有50mL BHI液体培养基的250mL容器中培养4h，加入25μL的0.1mmol/L的IPTG进行诱导，整个培养过程均在30℃，180rpm的往复式摇床中进行。诱导培养10-12h后收集细胞，菌体收集后用100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗涤两次，加入终浓度10mg/mL的溶菌酶后，在冰上静置2h后进行超声波破碎(工作2s,间隔5s，30-40min)，在12 000rpm离心20min后收集上清液，即为含有5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA的粗酶液。

分别对含有5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA的粗酶液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，分析结果见图1。

由图1可知，与1泳道的对照菌株C.glutamicum 13032/pXMJ19相比，2泳道的重组菌C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA发酵生产的5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA在45kDa附近有很明显的条带，表明5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA在重组菌C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA得到正常表达。

实施例4：重组谷氨酸棒杆菌摇瓶发酵生产5-氨基乙酰丙酸

(1)种子液培养

从活化平板上分别挑取对照菌株C.glutamicum 13032/pXMJ19、重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA的单菌落接种于20mL BHI液体培养基(含100mg/mL氯霉素)中，30℃振荡培养24h，然后全部转接于170mL种子培养基中，另加125g/L葡萄糖10mL，30℃培养20～22h，分别得到种子液。

种子培养基为：葡萄糖140～150g/L，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，硫酸镁0.6～1.0g/L，玉米浆5～8g/L，七水合硫酸亚铁0.002～0.005g/L，一水合硫酸锰0.002～0.005g/L，尿素7.0～8.0g/L。

(2)发酵培养

分别将步骤(1)得到的种子液按10％(v/v)的比例接种至含有发酵培养基的摇瓶当中，在30℃，pH为6.5，转速为600r/min，进行发酵培养，发酵时间为84h，生产5-氨基乙酰丙酸。

发酵培养基的制备：硫酸铵20～25g/L，磷酸二氢钾2～3g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，玉米浆30～50g/L，七水合硫酸亚铁0.02～0.05g/L，一水合硫酸锰0.02～0.05g/L，尿素1～2g/L去离子水配置，pH 6.5；将上述发酵培养基用体积分数为50％的氨水调节其pH至6.5，在121℃下高温灭菌20min。

结果如表1和图3所示，结果表明，在摇瓶阶段，菌株C.glutamicum13032/pXMJ19-hemA在66h合成了9.94g/L的5-ALA，产量比对照菌株提高了31％；生产率为0.15g/L/h，比对照菌株(生产率为0.11g/L/h)提高了36％；此时糖酸转化率达到11.8％，比对照菌株(糖酸转化率为9.4％)提高了25％。

表1：菌株C.glutamicum13032/pXMJ19和C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA在发酵66h的性能参数对比

实施例5：重组谷氨酸棒杆菌在发酵罐中生产5-氨基乙酰丙酸

种子液的制备和发酵培养基的制备同实施例4。

初始发酵培养体积为1.4L。

发酵条件：按照实施例4步骤(1)相同的方法，制备得到的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA种子液，将制备得到的种子液全部转接于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为30℃，起始pH为6.5，起始搅拌转速为600r/min，发酵时间为84h；等到重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA的OD

发酵过程中，搅拌转速根据溶氧量自动偶联设定，温度由发酵罐自动控制，pH通过补加体积分数为25％氨水维持。发酵24h前控制30％溶氧(将发酵液的溶氧％和通入气体的量、搅拌的转速、添加的补料进行关联，从而通过发酵系统自动控制这些参数来调节溶氧。参考文献Chen J,Wang Y,Guo X,et al.Efficient bioproduction of 5-aminolevulinicacid,a promising biostimulant and nutrient,from renewable bioresources byengineered Corynebacterium glutamicum.Biotechnol Biofuels,2020,13:41.)，用体积分数为25％的氨水维持pH在6.5，24h后控制10％的溶氧，同时调整发酵罐pH使其维持在6.0。

从第3h起，每3h取样一次检测葡萄糖的含量，并测定发酵上清液5-ALA的浓度。

由图2可知菌株C.glutamicum 13032△odhI△sdhA/pXMJ19-hemA最大生物量出现在30h，OD

实施例6：敲除不同的基因得到的重组谷氨酸棒杆菌摇瓶发酵生产5-氨基乙酰丙酸

按照实施例1-2的方法，分别制备敲除gdhA的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum13032△gdhA，敲除gdhA和odhI的C.glutamicum 13032△gdhA△odhI，设计的引物序列如下：

gdhA F1：CACAGGAAACAGCTATGACATGATTACGAATTCCAACTACGGTCTGGAACCATCACCATC(SEQ ID NO.17)；

gdhA R1：GGGCTTTGAGCAGACCCATCCACTAAACTTAAACAAGACAACGGCTGCCGTTTCGTTGC T(SEQ ID NO.18)；

gdhA F2：CGGCAGCCGTTGTCTTGTTTAAGTTTAGTGGATGGGTCTGCTCAAAGCCCAGGAACTTC A(SEQ ID NO.19)；

gdhA R2：ACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTACCAATTCCATTTGAGGGCGCTCA A(SEQ ID NO.20)；

odhI F1：AGGAAACAGCTATGACATGATTACGAATTCGTCCGTGAGGGAACAGGCAGCACGA(SEQID NO.21)；

odhI R1：TAACGCCCATCCACTAAACTTAAACAGAGCAGTACCGGTGCTCGACTCCATTTCCT(SEQID NO.22)；

odhI F2：CTGCTCTGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCGTTAACCGCGAGCCACGCAACGCTCAGG(SEQID NO.23)；

odhI R2：CGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAGGAACCAAGGATGGCGGTGACAGA(SEQID NO.24)；

按照实施例4的方法生产5-氨基乙酰丙酸，结果表2所示：

表2：不同基因敲除重组菌株在发酵66h的性能参数对比

由表1和表2可知，相比较之下，只有同时敲除odhI和sdhA之后，菌株生长良好且5-ALA产量最高，耗糖也较快。

对比例1：发酵培养基成分对重组谷氨酸棒杆菌生产5-氨基乙酰丙酸的影响

具体实施方式同实施例4，区别在于，将发酵培养基更改为CGXII medium培养基(记载于A New Strategy for Production of 5-Aminolevulinic Acid in RecombinantCorynebacterium glutamicum with High Yield论文当中)；具体成分如下：

20g/L(NH4)

结果为：菌株生长较之前的培养基更加缓慢，5-ALA产量也更低，在33h获得最高产量为5.82g/L，所以相比较而言，发酵培养基成分对生产5-氨基乙酰丙酸有很大影响，玉米浆更加有利于菌株生长。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸产量的方法

<130> BAA201675A

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ser Asp Asn Asn Gly Thr Pro Glu Pro Gln Val Glu Thr Thr Ser

1 5 10 15

Val Phe Arg Ala Asp Leu Leu Lys Glu Met Glu Ser Ser Thr Gly Thr

20 25 30

Ala Pro Ala Ser Thr Gly Ala Glu Asn Leu Pro Ala Gly Ser Ala Leu

35 40 45

Leu Val Val Lys Arg Gly Pro Asn Ala Gly Ala Arg Phe Leu Leu Asp

50 55 60

Gln Pro Thr Thr Thr Ala Gly Arg His Pro Glu Ser Asp Ile Phe Leu

65 70 75 80

Asp Asp Val Thr Val Ser Arg Arg His Ala Glu Phe Arg Ile Asn Glu

85 90 95

Gly Glu Phe Glu Val Val Asp Val Gly Ser Leu Asn Gly Thr Tyr Val

100 105 110

Asn Arg Glu Pro Arg Asn Ala Gln Val Met Gln Thr Gly Asp Glu Ile

115 120 125

Gln Ile Gly Lys Phe Arg Leu Val Phe Leu Ala Gly Pro Ala Glu

130 135 140

<210> 2

<211> 673

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Ser Thr His Ser Glu Thr Thr Arg Pro Glu Phe Ile His Pro Val

1 5 10 15

Ser Val Leu Pro Glu Val Ser Ala Gly Thr Val Leu Asp Ala Ala Glu

20 25 30

Pro Ala Gly Val Pro Thr Lys Asp Met Trp Glu Tyr Gln Lys Asp His

35 40 45

Met Asn Leu Val Ser Pro Leu Asn Arg Arg Lys Phe Arg Val Leu Val

50 55 60

Val Gly Thr Gly Leu Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Glu

65 70 75 80

Leu Gly Tyr Asp Val Lys Ala Phe Thr Tyr His Asp Ala Pro Arg Arg

85 90 95

Ala His Ser Ile Ala Ala Gln Gly Gly Val Asn Ser Ala Arg Gly Lys

100 105 110

Lys Val Asp Asn Asp Gly Ala Tyr Arg His Val Lys Asp Thr Val Lys

115 120 125

Gly Gly Asp Tyr Arg Gly Arg Glu Ser Asp Cys Trp Arg Leu Ala Val

130 135 140

Glu Ser Val Arg Val Ile Asp His Met Asn Ala Ile Gly Ala Pro Phe

145 150 155 160

Ala Arg Glu Tyr Gly Gly Ala Leu Ala Thr Arg Ser Phe Gly Gly Val

165 170 175

Gln Val Ser Arg Thr Tyr Tyr Thr Arg Gly Gln Thr Gly Gln Gln Leu

180 185 190

Gln Leu Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gln Arg Gln Ile His Leu Gly Ser

195 200 205

Val Glu Ile Phe Thr His Asn Glu Met Val Asp Val Ile Val Thr Glu

210 215 220

Arg Asn Gly Glu Lys Arg Cys Glu Gly Leu Ile Met Arg Asn Leu Ile

225 230 235 240

Thr Gly Glu Leu Thr Ala His Thr Gly His Ala Val Ile Leu Ala Thr

245 250 255

Gly Gly Tyr Gly Asn Val Tyr His Met Ser Thr Leu Ala Lys Asn Ser

260 265 270

Asn Ala Ser Ala Ile Met Arg Ala Tyr Glu Ala Gly Ala Tyr Phe Ala

275 280 285

Ser Pro Ser Phe Ile Gln Phe His Pro Thr Gly Leu Pro Val Asn Ser

290 295 300

Thr Trp Gln Ser Lys Thr Ile Leu Met Ser Glu Ser Leu Arg Asn Asp

305 310 315 320

Gly Arg Ile Trp Ser Pro Lys Glu Pro Asn Asp Asn Arg Asp Pro Asn

325 330 335

Thr Ile Pro Glu Asp Glu Arg Asp Tyr Phe Leu Glu Arg Arg Tyr Pro

340 345 350

Ala Phe Gly Asn Leu Val Pro Arg Asp Val Ala Ser Arg Ala Ile Ser

355 360 365

Gln Gln Ile Asn Ala Gly Leu Gly Val Gly Pro Leu Asn Asn Ala Ala

370 375 380

Tyr Leu Asp Phe Arg Asp Ala Thr Glu Arg Leu Gly Gln Asp Thr Ile

385 390 395 400

Arg Glu Arg Tyr Ser Asn Leu Phe Thr Met Tyr Glu Glu Ala Ile Gly

405 410 415

Glu Asp Pro Tyr Ser Ser Pro Met Arg Ile Ala Pro Thr Cys His Phe

420 425 430

Thr Met Gly Gly Leu Trp Thr Asp Phe Asn Glu Met Thr Ser Leu Pro

435 440 445

Gly Leu Phe Cys Ala Gly Glu Ala Ser Trp Thr Tyr His Gly Ala Asn

450 455 460

Arg Leu Gly Ala Asn Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Asp Gly Trp Phe

465 470 475 480

Thr Leu Pro Phe Thr Ile Pro Asn Tyr Leu Gly Pro Leu Leu Gly Ser

485 490 495

Glu Arg Leu Ser Glu Asp Ala Pro Glu Ala Gln Ala Ala Ile Ala Arg

500 505 510

Ala Gln Ala Arg Ile Asp Arg Leu Met Gly Asn Arg Pro Glu Trp Val

515 520 525

Gly Asp Asn Val His Gly Pro Glu Tyr Tyr His Arg Gln Leu Gly Asp

530 535 540

Ile Leu Tyr Phe Ser Cys Gly Val Ser Arg Asn Val Glu Asp Leu Gln

545 550 555 560

Asp Gly Ile Asn Lys Ile Arg Ala Leu Arg Asp Asp Phe Trp Lys Asn

565 570 575

Met Arg Ile Thr Gly Ser Thr Asp Glu Met Asn Gln Val Leu Glu Tyr

580 585 590

Ala Ala Arg Val Ala Asp Tyr Ile Asp Leu Gly Glu Leu Met Cys Val

595 600 605

Asp Ala Leu Asp Arg Asp Glu Ser Cys Gly Ala His Phe Arg Asp Asp

610 615 620

His Leu Ser Glu Asp Gly Glu Ala Glu Arg Asp Asp Glu Asn Trp Cys

625 630 635 640

Phe Val Ser Ala Trp Glu Pro Gly Glu Asn Gly Thr Phe Val Arg His

645 650 655

Ala Glu Pro Leu Phe Phe Glu Ser Val Pro Leu Gln Thr Arg Asn Tyr

660 665 670

Lys

<210> 3

<211> 409

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Met Asp Tyr Thr Lys Phe Phe Ala Asp Ala Leu Asp Arg Leu His Ala

1 5 10 15

Glu Arg Arg Tyr Arg Val Phe Ala Asp Leu Glu Arg Val Ala Gly Arg

20 25 30

Phe Pro His Ala Thr Trp His Ser Pro Ser Gly Glu Arg Asp Val Val

35 40 45

Ile Trp Cys Ser Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Gln His Pro Lys Val

50 55 60

Val Gly Ala Met Val Glu Thr Ala Thr Arg Leu Gly Thr Gly Ala Gly

65 70 75 80

Gly Thr Arg Asn Ile Ala Gly Thr His His Pro Leu Val Met Leu Glu

85 90 95

Arg Glu Leu Ala Asp Leu His Gly Lys Glu Ala Ala Leu Leu Phe Thr

100 105 110

Ser Gly Tyr Val Ser Asn Gln Thr Gly Ile Ser Thr Leu Ala Lys Leu

115 120 125

Ile Pro Asn Cys Leu Ile Leu Ser Asp Ala Leu Asn His Asn Ser Met

130 135 140

Ile Glu Gly Ile Arg Gln Ser Gly Cys Glu Arg Ile Val Trp Arg His

145 150 155 160

Asn Asp Thr Ala His Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ala Val Glu Pro Gly

165 170 175

Arg Pro Val Leu Ile Ala Phe Glu Ser Leu Tyr Ser Met Asp Gly Asp

180 185 190

Val Ala Pro Met Ala Lys Ile Cys Asp Leu Ala Glu Lys Tyr Gly Ala

195 200 205

Met Thr Tyr Cys Asp Glu Val His Ala Val Gly Met Tyr Gly Ala Arg

210 215 220

Gly Ala Gly Val Ala Glu Arg Asp Gly Val Met His Arg Ile Asp Ile

225 230 235 240

Ile Glu Ala Thr Leu Ala Lys Ala Phe Gly Cys Leu Gly Gly Tyr Ile

245 250 255

Ser Gly Lys Lys Asp Val Ile Asp Ala Val Arg Ser Tyr Ala Pro Gly

260 265 270

Phe Ile Phe Thr Thr Ala Leu Pro Pro Pro Ile Cys Ala Ala Ala Thr

275 280 285

Ala Ala Ile Arg His Leu Lys Thr Ser Thr Trp Glu Arg Glu Arg His

290 295 300

Gln Asp Arg Ala Ala Arg Leu Lys Ala Val Leu Asn Thr Ala Gly Leu

305 310 315 320

Pro Val Met Pro Thr Asp Thr His Ile Val Pro Val Phe Val Gly Asp

325 330 335

Ala Glu Arg Cys Lys Lys Ala Ser Asp Leu Leu Leu Glu Lys His Gly

340 345 350

Ile Tyr Ile Gln Pro Ile Asn Tyr Pro Thr Val Ala Lys Gly Lys Glu

355 360 365

Arg Leu Arg Ile Thr Pro Ser Pro Tyr His Asp Asp Asp Leu Met Asp

370 375 380

Arg Leu Ala Glu Ala Leu Val Asp Val Trp Glu Thr Leu Glu Leu Pro

385 390 395 400

Leu Gly Ala Lys Pro Leu Ala Ala Glu

405

<210> 4

<211> 1221

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gtccgtgagg gaacaggcag cacgagacat catgctgtac cacctcgatt acaactggtc 60

agagcacctc gcgttgatgg atgatgtccg cgaatccatt cacctgcgcg ccatcgccag 120

ggaaaccccc cttgatgaat accaccgcat cgctgtgcgt gaattcaagg atttggcaca 180

acgcgctgtc gatgatgcgg tgtccacgtt caagtctgtg accatcgatc acgagggtgc 240

ccatttggat gatgagggct tggcgcgtcc atcagcaacg tggacctaca tggtctctga 300

caacccactt gcgggtagtg gtaactcagt gatcagtggc ataggaaata tctttagata 360

acctgagaac tatgaaattc cagctcacgg cgttttttca ggaaattcta ggatcttacg 420

gagggtaact ccgcactcaa catctagaca aaggctatga tgaaaatcgt taagaataat 480

gtcgacacgg aggaagttta atgagcgaca acaacggcac cccggagcca caggtcgaga 540

ccacctcagt attccgcgct gatctactga aggaaatgga gtcgagcacc ggtactgctc 600

tgtttaagtt tagtggatgg gcgttaaccg cgagccacgc aacgctcagg tcatgcagac 660

cggtgatgag atccagattg gcaagttccg cctggttttc ctcgcaggcc ctgctgagta 720

aaaacacttc ctaggaaagt tctttgcagt gtttcactgc aaacagtgcg gttgcaggat 780

acatacctat cttgcaaccg ttttgtgtat agaatgccta aaatagtggt acaagtccct 840

gtccgcccat ttaattcaca gcaggtagca gcaacatcgt gagtgcactc cgtaaaacat 900

ccccaaacgg ctccatcggc gcatccgcca ccagaaccgt tccggtgaaa ccaaccaaga 960

ctatgtcaat tggtgtggta cttgaacgtc taaacgcaga gttccccgat gtcactgtgt 1020

ccaaaattcg cttcctcgaa tcagaggggc tgattacccc tgagcgaacc gcatctggat 1080

accgccgttt tacggaatca gatgtggaac gcctccgcta catcctggtc acccagcgtg 1140

acaactacct tccgctgaag gtcatcaggg aacagctgga agccatggac aacggctctg 1200

tcaccgccat ccttggttcc t 1221

<210> 5

<211> 2125

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cctacgtatt atcctgctgg tcgcattggt tctgcacatc tactgtgcat tcgcattgac 60

cggccgttct caccagtccc gcggaaagtt ccgccgtacc aacctcgttg gcggcttcaa 120

ctccttcgcg acccgctcca tgctggtgac cggaatcgtt ctccttgcgt tcattatctt 180

ccacatcctc gacctgacca tgggtgttgc tccagcagcc ccaacctcat tcgagcacgg 240

cgaagtatac gcaaacatgg tggcttcctt tagccgctgg cctgtagcaa tttggtacat 300

cattgccaac ctggtcctgt tcgtccacct gtcacacggc atctggcttg cagtctctga 360

cctgggaatc accggacgcc gctggagggc aatcctcctc gcagttgcgt acatcgttcc 420

tgcactggtc ctgatcggca acatcaccat tccgttcgcc atcgctgttg gctggattgc 480

gtaaaggtta ggaagaattt atgagcactc actctgaaac cacccgccca gagttcatcc 540

acccagtctc agtcctccca gaggtctcag ctggtacggt ccttgacgct gcagagccag 600

caggcgttcc caccaaagat atgtgggaat accaaaaaga ccacatgaac ctggtctccc 660

cactgaaccg acgcaagttc cgtgtcctcg tcgttggcac cggcctgtcc ggtggtgctg 720

cagcagcagc cctcggcgaa ctcggatacg acgtcaaggc gttcacctac cacgacgcac 780

ctcgccgtgc gcactccatt gctgcacagg gtggcgttaa ctccgcccgc ggcaagaagg 840

tagacaacga cggcgcatac cgccacgtca aggacaccgt caagggcggc gactaccgtg 900

gtcgcgagtc cgactgctgg cgtctcgccg tcgagtccgt ccgcgtcatc gaccacatga 960

acgccatcgg tgcaccattc gcccgcgaat acggtggcgc cttggcaacc tgtttaagtt 1020

tagtggatgg ggaagcacag gcagcgattg cgcgtgcaca ggctcgcatt gaccgcctca 1080

tgggcaaccg cccagagtgg gtcggtgaca acgttcacgg acctgagtac taccaccgcc 1140

agcttggcga tatcctgtac ttctcctgtg gcgtttcccg aaacgtagaa gacctccagg 1200

atggcatcaa caagatccgt gccctccgcg atgacttctg gaagaacatg cgcatcaccg 1260

gcagcaccga tgagatgaac caggttctcg aatacgcagc acgcgtagcc gactacatcg 1320

acctcggcga actcatgtgt gtcgacgccc tcgaccgcga cgagtcctgt ggcgctcact 1380

tccgcgacga ccacctctcc gaagatggcg aagcagaacg tgacgacgaa aactggtgct 1440

tcgtctccgc atgggaacca ggcgagaacg gaaccttcgt ccgccacgca gaaccactgt 1500

tcttcgaatc cgtcccactg cagacaagga actacaagta atgaaactta cacttgagat 1560

ctggcgtcaa gcaggcccaa ctgcggaagg caagttcgaa accgtccagg ttgacgacgc 1620

cgtcgcgcag atgtccatcc tggagctgct tgaccacgta aacaacaagt tcatcgaaga 1680

aggcaaagaa ccattcgcgt tcgcctctga ctgccgcgaa ggcatttgtg gtacctgtgg 1740

tctcctcgtg aacggtcgcc ctcacggcgc cgaccagaac aagcctgcct gtgcgcagcg 1800

cctggtcagc tacaaggaag gcgacaccct caagatcgaa ccactgcgtt ccgccgcata 1860

cccagtgatc aaggacatgg tcgtcgaccg ctccgcactg gaccgtgtca tggaacaggg 1920

tggctacgtg accatcaacg caggtaccgc acctgacgct gataccctcc acgtcaacca 1980

cgaaaccgca gaactcgcac ttgaccacgc agcctgcatc ggctgtggcg catgtgttgc 2040

tgcctgccct aacggcgcag cacacctgtt caccggcgca aagcttgttc acctctccct 2100

cctcccactg ggtaaggaag agcgc 2125

<210> 6

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atggactaca ccaagttctt tgctgacgct ctggatcgcc tccacgcaga acgtcgctac 60

cgcgtgttcg cagatctcga acgcgtcgct ggccgcttcc cacatgctac ttggcactcc 120

ccttccggtg aacgtgatgt ggtcatctgg tgctccaacg actatctggg tatgggccag 180

cacccaaagg tggtgggcgc aatggtcgag actgctactc gcctcggtac cggtgctggc 240

ggtacccgca acatcgctgg cactcaccac ccactggtca tgctcgagcg cgagctcgca 300

gatctccatg gtaaggaggc agctctcctc ttcacctccg gctacgtgtc caaccagact 360

ggcatctcca ctctggctaa gctcattcca aactgtctga ttctgtccga cgctctcaac 420

cacaactcta tgatcgaggg catccgtcag tccggttgcg aacgcatcgt ctggcgccat 480

aacgataccg cacacctcga agaactgctc cgcgcagtcg aaccgggccg cccagtgctg 540

atcgctttcg agtctctgta ttccatggac ggtgacgtcg ctcctatggc aaaaatctgt 600

gatctggcag agaagtacgg cgcaatgact tactgcgatg aagtccacgc agtgggcatg 660

tacggtgcac gtggtgctgg cgtcgcagaa cgtgacggcg tgatgcaccg catcgatatc 720

atcgaggcta ccctcgcaaa ggctttcggt tgtctgggcg gctatatctc cggcaagaag 780

gacgtcatcg acgcagtccg ctcctacgct ccgggcttca tcttcaccac cgcactccct 840

ccacctatct gcgctgcagc aactgctgca atccgtcatc tgaaaacctc cacttgggaa 900

cgcgagcgtc atcaagatcg cgctgcacgt ctgaaggcag tgctcaatac cgctggtctg 960

ccagtgatgc caaccgatac ccatatcgtg ccagtgttcg tcggcgatgc tgagcgctgt 1020

aagaaggcat ccgatctgct gctggagaag cacggcatct acatccagcc aatcaactat 1080

cctaccgtcg ctaagggcaa agaacgtctg cgcatcaccc catcccctta ccacgatgat 1140

gatctgatgg accgtctggc tgaggcactg gtggacgtgt gggaaaccct cgaactgcca 1200

ctgggcgcaa agccactggc agcagaataa 1230

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

aggaaacagc tatgacatga ttacgaattc gtccgtgagg gaacaggcag cacga 55

<210> 8

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

taacgcccat ccactaaact taaacagagc agtaccggtg ctcgactcca tttcct 56

<210> 9

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ctgctctgtt taagtttagt ggatgggcgt taaccgcgag ccacgcaacg ctcagg 56

<210> 10

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt aggaaccaag gatggcggtg acaga 55

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

aggaaacagc tatgacatga ttacgaattc cctacgtatt atcctgctgg tcgcattggt 60

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cgctgcctgt gcttccccat ccactaaact taaacaggtt gccaaggcgc caccgtattc 60

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gtggcgcctt ggcaacctgt ttaagtttag tggatgggga agcacaggca gcgattgcgc 60

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc aagcttgcgc tcttccttac ccagtgggag 60

<210> 15

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

acagaattaa ttaagcttaa aggagggaaa tcatggatta caccaagttc ttcgc 55

<210> 16

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

caaaacagcc aagctgaatt cttagtggtg gtggtggtgg tgttccgcag cgagcggct 59

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

cacaggaaac agctatgaca tgattacgaa ttccaactac ggtctggaac catcaccatc 60

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

gggctttgag cagacccatc cactaaactt aaacaagaca acggctgccg tttcgttgct 60

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

cggcagccgt tgtcttgttt aagtttagtg gatgggtctg ctcaaagccc aggaacttca 60

<210> 20

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gctttaccaa ttccatttga gggcgctcaa 60

<210> 21

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

aggaaacagc tatgacatga ttacgaattc gtccgtgagg gaacaggcag cacga 55

<210> 22

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

taacgcccat ccactaaact taaacagagc agtaccggtg ctcgactcca tttcct 56

<210> 23

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

ctgctctgtt taagtttagt ggatgggcgt taaccgcgag ccacgcaacg ctcagg 56

<210> 24

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt aggaaccaag gatggcggtg acaga 55