一种棉花下胚轴单细胞的分离方法

摘要

本发明涉及分子生物技术领域，且公开了一种棉花下胚轴单细胞的分离方法。该棉花下胚轴单细胞的分离方法，基于棉花叶片、愈伤组织、根的原生质体分离技术，对酶促体系进行优化改进，构建了适用于棉花下胚轴单细胞分离的实验体系，利用该方法可得到高质量，数量多的下胚轴单细胞，愈伤组织原生质体酶解方法中，酶解后的原生质体用W5solution重悬，本发明中用PBS+0.04％BSA进行重悬，效果较好，酶解时间只需4‑6小时，两次离心之后过40μm过滤筛，可以得到分散完整的下胚轴单细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体为一种棉花下胚轴单细胞的分离方法。

背景技术

植物的原生质体系统是现代植物生物学中强大的工具，在植物分子生物技术中有广泛的应用，可用于瞬时表达，亚细胞定位，融合杂交，荧光活细胞分选，植物育种等，去掉植物细胞壁获得原生质体有两种方法，机械的人工操作和酶解法，较早利用机械法制备原生质体，如将组织切片置于低渗状态从而细胞壁收缩(质壁分离)，这种方法操作困难，产量低，现在很少使用，目前应用最多的是酶解法，并不是所有的植物材料都能通过酶解法得到原生质体。原生质体的成功分离受到物种类型、源材料、酶组合配比等因素的影响。原生质体分离的最常见来源是叶片组织，目前已从烟草，拟南芥，水稻和其他非典范植物物种苜蓿，百日草，杜鹃花，巴西橡胶树，木薯，菜豆，木兰中成功分离出植物叶肉原生质体；一些观赏植物，如蔷薇果则是从花瓣中分离原生质体，玉米胚乳也可用于原生质体分离。另外，通过改变酶促条件，优化配比，在单子叶植物兰花花瓣和芽中成功分离了高产可用的原生质体。

目前，棉花原生质体主要从叶片，根，愈伤组织中获得，在下胚轴中还没有具体的分离方法，还需要对现有酶解体系进行优化，建立有效的下胚轴单细胞分离方案。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种棉花下胚轴单细胞的分离方法，具备下胚轴单细胞分离等优点，解决了棉花原生质体主要从叶片，根，愈伤组织中获得，在下胚轴中还没有具体的分离方法的问题。

(二)技术方案

为实现上述下胚轴单细胞分离目的，本发明提供如下技术方案：一种棉花下胚轴单细胞的分离方法，包括以下步骤：

1)制备母液：将1.95g的固体MES溶于80ml的ddH2O中，用KOH调PH至5.7，再定容至100ml；

2)制备酶解液：首先称量纤维素酶(0.15g)、半纤维素酶(0.1g)、离析酶(0.75g)，加入5ml甘露醇，0.2ml的KCL，2ml的MES，稍微混匀后放入55℃水浴锅加热10min，冷却至室温，再依次加入100μl的CaCl2，0.01gBSA，少量的ddH2O，此时酶解液是淡褐色，澄清溶液，然后用0.22μm孔径的滤膜过滤到无菌容器中备用；

3)下胚轴取样：将剥好的棉花种子(品种为Jin668，专利申请号201510833618.0)用50％次氯酸钠杀菌，无菌水清洗数次后放入无菌苗培养基中，28℃暗培养1天，挑去种皮，将苗扶正，在28℃，暗培养4-5d，结束后将无菌苗切掉根部和顶端，再用锋利的解剖刀，避免拉扯地将剩下的下胚轴均匀切割成1-2mm的小段，所用的无菌苗培养基组分及配比：无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel，pH:6.1-6.2；

4)酶解：在培养皿中倒入之前配好的酶解液，将切好的下胚轴加入到酶解液中(组织完全浸没在酶解液里)，在摇床上最低速匀速(50左右)避光，酶解4-6h；

5)过滤：用PBS把40μm的过滤筛润洗两次，对酶解好的单细胞悬浮液进行过滤，取过滤后的细胞悬浮液入离心管中，加入两倍的PBS(0.04％BSA)混匀，超低速离心机，70g，升降速3，离心3min，弃上清，留0.5ml沉淀，加1倍的PBS，混匀，70g，升降速3，离心2min，弃上清，留0.5ml左右沉淀，用剪过的枪头混匀，用40μm过滤筛过滤到离心管中，显微镜观察细胞数量和细胞活性。

优选的，所述BSA为牛血清蛋白，PBS为磷酸缓冲液，MES为2-吗啉乙磺酸。

优选的，所述ddH2O为双蒸水，制作酶解液时ddH2O的用量为2.7ml。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种棉花下胚轴单细胞的分离方法，具备以下有益效果：

该棉花下胚轴单细胞的分离方法，基于棉花叶片、愈伤组织、根的原生质体分离技术，对酶促体系进行优化改进，构建了适用于棉花下胚轴单细胞分离的实验体系，利用该方法可得到高质量，数量多的下胚轴单细胞，愈伤组织原生质体酶解方法中，酶解后的原生质体用W5solution重悬，本发明中用PBS+0.04％BSA进行重悬，效果较好，酶解时间只需4-6小时，两次离心之后过0.22μm过滤筛，可以得到分散完整的下胚轴单细胞。

附图说明

图1为棉花下胚轴单细胞的取样、酶解过程。

图2为棉花下胚轴单细胞镜检图(FDA染色)。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种棉花下胚轴单细胞的分离方法，包括以下步骤：

1)制备母液：将1.95g的固体MES溶于80ml的ddH2O中，用KOH调PH至5.7，再定容至100ml；

2)制备酶解液：首先称量纤维素酶(0.15g)、半纤维素酶(0.1g)、离析酶(0.75g)，加入5ml甘露醇，0.2ml的KCL，2ml的MES，MES为2-吗啉乙磺酸，稍微混匀后放入55℃水浴锅加热10min，冷却至室温，再依次加入100μl的CaCl2，0.01gBSA，BSA为牛血清蛋白，少量的ddH2O，ddH2O为双蒸水，ddH2O的用量为2.7ml，此时酶解液是淡褐色，澄清溶液，然后用0.22μm孔径的滤膜过滤到无菌容器中备用；

3)下胚轴取样：将剥好的棉花种子(品种为Jin668，专利申请号201510833618.0)用50％次氯酸钠杀菌，无菌水清洗数次后放入无菌苗培养基中，28℃暗培养1天，挑去种皮，将苗扶正，在28℃，暗培养4-5d，结束后将无菌苗切掉根部和顶端，再用锋利的解剖刀，避免拉扯地将剩下的下胚轴均匀切割成1-2mm的小段，所用的无菌苗培养基组分及配比：无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel，pH:6.1-6.2；

4)酶解：在培养皿中倒入之前配好的酶解液，将切好的下胚轴加入到酶解液中(组织完全浸没在酶解液里)，在摇床上最低速匀速(50左右)避光，酶解4-6h；

5)过滤：用PBS把0.4微米的过滤筛润洗两次，对酶解好的单细胞悬浮液进行过滤，取过滤后的细胞悬浮液入离心管中，加入两倍的PBS(0.04％BSA)混匀，超低速离心机，70g，升降速3，离心3min，弃上清，留0.5ml沉淀，加1倍的PBS，混匀，PBS为磷酸缓冲液，70g，升降速3，离心2min，弃上清，留0.5ml左右沉淀，用剪过的枪头混匀，用40μm过滤筛过滤到离心管中，显微镜观察细胞数量和细胞活性。

本发明的有益效果是：该棉花下胚轴单细胞的分离方法，基于棉花叶片、愈伤组织、根的原生质体分离技术，对酶促体系进行优化改进，构建了适用于棉花下胚轴单细胞分离的实验体系，利用该方法可得到高质量，数量多的下胚轴单细胞，愈伤组织原生质体酶解方法中，酶解后的原生质体用W5solution重悬，本发明中用PBS+0.04％BSA进行重悬，效果较好，酶解时间只需4-6小时，两次离心之后过40μm过滤筛，可以得到分散完整的下胚轴单细胞。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。