一种抑制HTT基因表达的siRNA及其前体和应用

摘要

本发明提供了一种抑制HTT基因表达的siRNA及其前体和应用，具体地，本发明提供了一种siRNA前体序列以及由其产生的siRNA，本发明的siRNA及其前体可有效治疗亨廷顿舞蹈症。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抑制HTT基因表达的siRNA及其前体和应用。

背景技术

亨廷顿舞蹈症(Huntington’s disease，HD)是一种以运动障碍为主的神经退行性疾病,属常染色体显性遗传性疾病。它的主要症状是不受控制的大肢体运动,伴有认知障碍和精神异常。HD是一种致死性的神经退行性疾病，病患多于成年起病，并与起病后15-20年内死亡，然而目前缺乏有效的治疗方法。因此，寻找安全有效的治疗方法十分重要。

目前利用ASO降低HTTmRNA水平并抑制其翻译的治疗方法已在临床上取得初步成功，但是ASO鞘内注射的方式并不利于其在深部脑组织的分布，而且鞘内注射属于有创操作，限制了其临床推广。

因此，本领域迫切需要开发一种能够调控HTT活性或表达量的siRNA。

发明内容

本发明提供了一种能够调控HTT活性或表达量的siRNA。

本发明第一方面提供了一种前体序列，其5’至3’端具有式I所示的结构：

B1为所需要的第一核糖核酸序列，其中所述的第一核糖核酸序列包括HTTsiRNA正义链序列；

B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；

C为茎环结构序列；

其中，所述HTT siRNA正义链的核苷酸序列选自下组：

SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO.:5、或其组合。

在另一优选例中，所述前体序列如SEQ ID NO.:6－10中任一所示。

本发明第二方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成本发明第一方面所述的前体序列。

本发明第三方面提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第一方面所述的前体序列或本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的表达载体包括病毒载体、非病毒载体。

在另一优选例中，所述的表达载体为质粒。

在另一优选例中，所述的表达载体还含有编码狂犬病毒表面糖蛋白短肽(RVG肽)的多核苷酸。

本发明第四方面提供了一种药物制剂，所述的制剂含有：

(a)用于表达抑制HTT基因表达的siRNA的表达载体；以及

(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的表达载体含有表达本发明第一方面所述的前体序列或本发明第二方面所述的多核苷酸，或表达本发明第一方面所述的前体序列。

在另一优选例中，所述的表达载体表达式I所示的前体，

B1为所需要的第一核糖核酸序列，其中所述的第一核糖核酸序列包括HTTsiRNA正义链序列；

B2为与B1基本互补或完全互补的序列，且B2与C不互补；

C为茎环结构序列；

其中，所述HTT siRNA正义链的核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、或其组合。

在另一优选例中，所述的表达载体还含有编码狂犬病毒表面糖蛋白短肽(RVG肽)的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的制剂为液体剂型。

在另一优选例中，所述的制剂为注射剂。

在另一优选例中，所述的表达载体包括质粒。

在另一优选例中，所述的表达载体或质粒含有启动子、复制起点和标记基因。

在另一优选例中，所述的表达载体中含有表达HTT siRNA的表达盒。

在另一优选例中，所述的表达盒(即多核苷酸)为双链，并且具有以下结构：

启动子-attB1-任选的RVG-任选的标签蛋白(如Lamp2b)-5’siRNA侧翼区序列-式I所示的序列-3’siRNA侧翼区序列-attB2。

在另一优选例中，所述的制剂为脂质体或外泌体制剂。

本发明第五方面提供了一种抑制HTT基因表达的siRNA，所述siRNA的正义链核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、或其组合。

本发明第六方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明第一方面所述的前体序列、或本发明第三方面所述的表达载体，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括HTT siRNA质粒。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括其他治疗亨廷顿舞蹈症的药物。

在另一优选例中，所述其他治疗亨廷顿舞蹈症的药物选自下组：丁苯那嗪、ASO、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物组合物为权利要求3所述的表达载体，较佳地，为含有权利要求1所述前体序列的质粒。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括：

片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、注射液、或粉针剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型还包括喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、挥发性液体、外用溶液剂、洗剂、浇淋剂、搽剂、巴布膏剂、膏药、橡胶膏剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂或栓剂。

在另一优选例中，所述的剂型为注射剂，较佳地，为静脉注射剂、腹腔注射剂。

本发明第七方面提供了本发明第六方面所述siRNA、本发明第一方面所述前体序列、或本发明第三方面所述表达载体的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(i)治疗亨廷顿舞蹈症。

在另一优选例中，所述组合物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途：

(ii)抑制哺乳动物脑组织中HTT的表达；和/或

(iii)改善哺乳动物的运动协调能力。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如鼠、兔)、灵长类动物(如猴)。

在另一优选例中，所述脑组织包括纹状体、皮层。

本发明第八方面提供了一种治疗亨廷顿舞蹈症的方法，将安全有效量的本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的药物制剂、或本发明第六方面所述的药物组合物施用于所需对象，从而治疗亨廷顿舞蹈症。

在另一优选例中，所述施用的剂量为1-20mg/kg，较佳地，为5-10mg/kg。

在另一优选例中，所述施用频率为两天一次。

在另一优选例中，所述施用包括：口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜或腔道给药；

在另一优选例中，所述施用包括注射质粒。

本发明第九方面提供了一种(ii)抑制哺乳动物脑组织中HTT的表达；和/或(iii)改善哺乳动物的运动协调能力的方法，包括：

将安全有效量的本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的药物制剂、或本发明第六方面所述的药物组合物施用于所需对象，从而(ii)抑制哺乳动物脑组织中HTT的表达；和/或(iii)改善哺乳动物的运动协调能力。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是本发明的质粒骨架图。

图2是质粒分子表达的siRNA在细胞水平及对HTT的抑制效果。

图3是HTT siRNA/RVG质粒分子对转基因小鼠BACHD的疾病治疗效果；

其中，图3A是每两天注射一次质粒，注射七次后利用western检测3个月的HD转基因小鼠BACHD脑组织的mHTT蛋白表达水平。图3B是图3A对应的western定量图，图3C是利用qpcr检测脑组织中mHTT的mRNA水平。

图4是HTT siRNA/RVG质粒分子对转基因小鼠N171-82Q的疾病治疗效果；

其中，图4A是每两天注射一次质粒，注射七次后利用western检测8周的HD转基因小鼠N171-82Q脑组织的HTT蛋白表达水平。图4B是图4A对应的western定量图。图4C是利用qpcr检测脑组织中mHTT的mRNA水平。图4D是利用滚轴实验来检测小鼠平衡协调能力效果图。

图5是HTT siRNA/RVG质粒分子对转基因小鼠YACHD的疾病治疗效果；

其中，图5A是每周注射两次质粒，注射8周后利用western检测6周的HD转基因小鼠YACHD脑组织的mHTT蛋白表达水平。图5B是图5A对应的western定量图。

图5C是利用qpcr检测脑组织中mHTT的mRNA水平。图5D是利用滚轴实验来检测小鼠平衡协调能力效果图。图5E是脑组织病理切片免疫荧光效果图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次筛选了大量核酸序列，首次发现某些特定siRNA对于HTT具有非常高的抑制能力。

并且本发明首次制备了一种能够高效表达HTT siRNA的前体siRNA。本发明前体siRNA经过宿主细胞的加工后，能够高效地表达siRNA,从而有效地避免了目的序列的反向互补序列对目的序列发挥功能的干扰作用。实验证明，本发明前体siRNA能够在体内有效表达HTT siRNA序列，并对亨廷顿舞蹈症都具有更有效的治疗作用。在此基础上，本发明人完成了本发明。

siRNA及其前体

如本文所用，所述的“siRNA”是指一类RNA分子，从可形成siRNA前体的转录物加工而来。成熟的siRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的siRNA分子。siRNA通常可被Northern印迹检测到。

人来源的siRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

值得说明的是，siRNA一般通过模拟miRNA产生机制来产生的，这样的siRNA就可从前体RNA(Precursor RNA，Pre-RNA)加工而来。所述的前体RNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体RNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体RNA可以是天然的或是人工合成的。

在本发明中，所述的前体siRNA为人工合成的前体siRNA，且所述的前体siRNA具有式I所示的结构：

作为代表性的例子，B1为HTT siRNA正义链序列；

B2为与B1互补(包括基本互补和完全互补)的序列；

C为茎环结构；

其中，所示的前体siRNA能在宿主中加工形成HTT siRNA。

在本发明中，形成HTT siRNA的前体miRNA可被剪切生成调节HTT基因的siRNA，即HTT siRNA(例如，SEQ ID NO.:1、2、3、4、5)；

SEQ ID NO 1:UGACUCUGCGUCAUCACUGCA

SEQ ID NO 2:UAACUUUGUUGAGGCAUUCGU

SEQ ID NO 3:AACCUUGGAAGAUUAGAAUCC

SEQ ID NO 4:GUAGCUGAAAGUUCUUUCUU

SEQ ID NO 5:UUGGUAGCUGAAAGUUCUU。

前体RNA可被剪切生成siRNA，所述的siRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。在式I中，B2和B1为基本互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

在本发明的一优选实施方式中，本发明的前体如SEQ ID NO.:6-10中任一所示：

HTT-Si409sense5’-AATTCGTGACTCTGCGTCATCACTGCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGCAGTGAACGCAGAGTCACA-3(SEQ ID NO.:6)

HTT-Si449sense5’AATTCGTAACTTTGTTGAGGCATTCGTGTTTTGGCCACTGACTGACACGAATGCCAACAAAGTTACA-3’(SEQ ID NO.:7)

HTT-Si483sense5’-AATTCGAACCTTGGAAGATTAGAATCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGATTCTACTTCCAAGGTTCA-3’(SEQ ID NO.:8)

HTT-Si271sense5’-AATTCGGTAGCTGAAAGTTCTTTCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGAAAGATTTCAGCTACCA-3’(SEQ ID NO.:9)

HTTSi-275-sense5’AATTCGTTGGTAGCTGAAAGTTCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGAACTTTCAGCTACCAACA-3’)(SEQ ID NO.:10)。

如本申请所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明中，“茎环结构”可存在于式I所示前体siRNA的末端，例如由于B1和B2形成基本互补后，C会形成一固定的末端茎环结构；所述的“茎环结构”还可存在于式I所式前体siRNA内部，例如由于B1和B2之间并非完全互补，造成未互补结合的B1或B2的碱基会形成一内部的茎环(internal loop)。

本发明所述的siRNA是指：抑制HTT的siRNA家族的微小RNA，所述抑制HTT的siRNA家族的微小RNA包括：抑制HTT的siRNA或经修饰的抑制HTT的siRNA衍生物。

在本发明的一个优选例中，抑制HTT的siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1-5所示(分别对应于实施例中的siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、siRNA-5)。优选的是SEQ IDNO.:2和5，更优选SEQ ID NO.:5。

本发明还包括siRNA变体和衍生物。此外，广义上的siRNA衍生物也可包括siRNA变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对抑制酪氨酸激酶的siRNA进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的siRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的siRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的siRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体RNA，所述的前体RNA可被人细胞剪切且表达成所述的siRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有一个或多个式II所示的结构单元：

Seq

式II

式II中，

Seq

其中，各结构单元可表达相同或不同的siRNA；

式II所示的结构在转入细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III

式III中，Seq

||表示在Seq

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的siRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

药物组合物及施用方法

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、微粒子(micro particle)、微泡(micro vesicle)、外泌体(exosomes)、脱落囊泡(sheddingvesicle)、纳米胶囊(Nanocapsules/Nanoparticles)、β环糊精胶囊(β-cyclodextriniclusion compound)蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

在本发明中，可将所述的表达载体直接施用于对象，也可将所述的表达载体与药学上可接受的载体制备成药物组合后进行施用。所述的施用包括静脉注射。

治疗方法

本发明还提供了一种治疗亨廷顿舞蹈症的方法，即，将安全有效量的本发明表达载体或药物组合物施用于所需对象，从而治疗亨廷顿舞蹈症。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明首次开发了针对HTT特异性设计的siRNA序列，可有效抑制脑组织中HTT的表达，还可改善运动协调能力，有效治疗亨廷顿舞蹈症。

(b)本发明前体siRNA能够有效的避免在过表达目的序列得同时也过表达目的序列得反向互补序列，从而有效避免了目的序列得反向互补序列对目的序列发挥功能的干扰作用。

(c)本发明通过开发设计特定蛋白标签(RVG-Lamp2b),使得在其下游与其串联表达的siRNA，能够顺利、高效穿过血脑屏障，到达脑组织并发挥功能。

(d)本发明通过静脉注射的方式给药，与鞘内注射、颅内注射给药方式相比，侵入性小，更为安全。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用原料或仪器，若非特别说明，均市售可得。

通用方法

一、基因型鉴定

1、主要试剂和仪器

试剂名称：小鼠基因组提取试剂盒(碧云天公司)、Q5高保真DNA聚合酶套装(美国NEB公司)、100bp DNA ladder(美国NEB公司)、5x DNA loading buffer(美国NEB公司)

仪器名称：恒温水浴锅(美国Labnet公司)、PCR仪(德国BIOMETRA公司)、常温离心机(德国Eppendorf公司)、电泳仪(美国BIO-RAD公司)、Nano Drop紫外分光光度计(美国Thermo公司)、紫外透射仪(日本SANYO公司)

2、主要溶液配制

1X TAE电泳缓冲液：0.5M EDTA(pH8.0)2ML、Tris碱4.84g、冰醋酸1.142mL，去离子水定容至1L。

3、基因型鉴定引物序列及扩增程序

BACHD小鼠基因型鉴定引物序列及扩增程序

上游引物：AGG TCG GTG CAG AGG CTC CTC

下游引物：CCG CTC AGG TTC TGC TTT TA

Step1 98℃5min Step2 98℃10s Step3 65℃20s Step4 72℃20s Step5 Go tostep 2 29Cycles Step6 72℃10s Step7 4℃维持

N171-82Q小鼠基因型鉴定引物序列及扩增程序

上游引物：GTG GAT ACC CCC TCC CCC AGC CTA GAC C

下游引物：GAA CTT TCA GCT ACC AAG AAA GAC CGT GT

Step1 98℃5min Step2 98℃20s Step3 65℃15s Step4 68℃10s(重复step2-step4，每个循环退火温度降低0.5℃)Step5 98℃15sStep6 60℃15s Step7 72℃10sStep8 Goto step 5 28循环Step9 72℃2min Step10 4℃维持

YAC128小鼠基因型鉴定引物序列及扩增程序

上游引物：GGC TGA GGA AGC TGA GGA G

下游引物：CCG CTC AGG TTC TGC TTT TA

Step1 98℃5min Step2 98℃20s Step3 65℃15s Step4 68℃10s(重复step2-step4，每个循环退火温度降低1.5℃)Step5 98℃15s Step6 50℃15s Step7 72℃10sStep8 Goto step 5 28循环Step9 72℃2minStep10 4℃维持

4、实验方法及步骤

4.1小鼠基因组DNA提取

(1)转基因小鼠离乳后(3周龄)，剪取鼠尾约2-3mm，加入180μL组织裂解液

A及20μL蛋白酶K，56℃水浴过夜，至小鼠尾巴呈凝胶状。

(2)加入组织裂解液B 200μL，充分混匀。转移至分离柱内。

(3)12000rpm室温离心1min，弃废液。

(4)加入洗涤液A 500μL，12000rpm室温离心1min，弃废液。

(5)加入洗涤液B 500μL，12000rpm室温离心1min，弃废液。

(6)将分离柱套至新的1.5mL EP管，加入洗脱液50μL，室温孵育2min，

(7)12000rpm室温离心1min，所离心下来的液体即含有小鼠基因组DNA。

(8)Nano Drop紫外分光光度计定量小鼠基因组DNA浓度。

4.2小鼠基因型鉴定

(1)按下列配方配置PCR反应体系

5×Q5 reaction buffer 10ul 10mMdNTP mix 1ul 10μMPrimer Up 2.5u10μMPrimer Down 2.5ul模板DNA 100ng Q5 DNA聚合酶0.5ul去离子水补齐至50ul

(2)按3条件设置PCR反应步骤

(3)配制琼脂糖电泳凝胶：本实验选用浓度为1％的凝胶，将琼脂0.5g溶于50mL

1×TAE溶液配制凝胶液，微波炉中火2min加热使之完全溶解。加入GelRed溶液

5μL，混匀后趁热倒入制胶槽，插入梳子。

(4)待凝胶冷却凝固后，拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加样孔一端朝向阴

极，电泳槽内倒入1×TAE至没过制好的琼脂凝胶。

(5)在PCR产物内加入5XDNA Loading Buffer 10μL，吹打混匀后上样至加样孔内，另取加样孔加入100bp DNA Marker。

(6)开始电泳，电泳条件为恒压120V，时间约30min。

(7)取出凝胶置于紫外透射仪上成像。

二、行为学检测：

所有行为学均于9:00-11:00am进行。实验开始前将小鼠提前放进行为学检测室，适应1小时。每个待检行为学设备上方2.4m放置照明光源，功率为60w白色灯泡。每次完成测试后，均用75％乙醇喷洒并擦拭干净相应的行为学设备。

1.疲劳转棒试验(RotaRodTest)

为了测试小鼠的运动协调能力，我们选取Rotarod试验。具体实验流程如下：于试验干预前，治疗后2周或者4周和8周行Rotarod试验。试验第一天为训练模块，让小鼠在4rpm匀速转棒上跑动5min。重复3次，每次间隔30min，让小鼠适应在转棒跑动。此后为测量模块，持续3天。转棒将于3min内由4rpm匀加

速40rpm，记录小鼠能在转棒上维持直立体位的时间。每天重复3次，每次间隔

30min。

2.旷场试验

为了测量小鼠自主活动能力，我们选取旷场试验。旷场试验仪器为一个尺寸为25X25X38cm的封闭箱子，箱子上盖安装有摄像头。于观测时间点，将小鼠放入箱子中，盖上上盖，启动录像。记录5min内小鼠在箱子中自主运动的路程。

3.平衡木试验

为了测量小鼠平衡及肢体协调能力，我们选取平衡木试验。80厘米长，12mm宽，截面为方形的木棒用于本次实验。木棒横放架设于桌面上方50cm，一端悬空，一端放置小鼠鼠笼。实验前3天为训练日，小鼠会放在木棒悬空端，头朝鼠笼。并通过推动其身体敦促小鼠回到鼠笼，每天重复3次，每次间隔时间大于10分钟。小鼠均能在3天训练后，在无外界刺激条件下自行回到鼠笼。测试日，每只小鼠重复4次，每次间隔时间大于10分钟，记录平均肢体滑落木棒的次数。

三、生化检测

1.小鼠取材

(1)小鼠戊巴比妥钠过量麻醉并固定妥当，用手术器械暴露胸腔，

(2)将灌流针插入小鼠左心室，随后用眼科剪剪开右心房。

(3)灌入100mL 0.1M PBS(4℃预冷)。

(4)灌流完毕后断头，快速取出脑组织。

(5)于冰上手术分离两侧脑组织皮层、纹状体。

2.小鼠脑组织Western Blot蛋白定量

2.1主要试剂和仪器

试剂：RIPA蛋白抽提液(美国Thermo公司)、Phostop磷酸酶抑制剂(瑞士罗氏公司)、PMSF(美国Invitrogen公司)、BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)、4X SDS LoadingBuffer(中国博士德公司)、预染蛋白Marker(美国Thermo公司)、

SDS-PAGE配胶试剂盒(中国碧云天公司)、PVDF膜(美国Millipore公司)小鼠抗HTT抗体(美国Millipore公司)、HRP标记羊抗小鼠抗体美国(CST公司)、

化学发光液(美国Millipore公司)

仪器：电泳仪(美国Bio-Rad公司)、化学发光成像仪(美国GE公司)、水平旋转摇床(美国Labnet公司)、低温离心机(德国Eppendorf公司)、超声裂解仪(日本SANYO公司)、组织研磨机(德国Qiagen公司)、酶标仪(美国Thermo公司)

2.2主要溶液配制

(1)10×电泳液：蒸馏水定容至1000mL。甘氨酸144g Tris base 30g SDS 10g

(2)10×转膜液：蒸馏水定容至1000mL。甘氨酸144g Tris base 30g

(3)1×转膜液：蒸馏水定容至1000mL，现配现用，4℃预冷。10×转膜液100mL

甲醇200mL

(4)10×TBS：蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至7.6。Tris base24.2g Nacl 80g

(5)1×TBST：蒸馏水定容至1L。10×TBS 100mL Tween-20 1mL

(6)5％封闭用BSA：分装成10mL一管，-20℃保存。1×TBST 100mLBSA 5g

(7)二抗稀释液：1×TBST 100mL BSA 1g

(8)6％分离胶:超纯水5.3ml、30％Acr/Bic 2ml、1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8)2.5ml、10％SDS 0.1ml、10％AP 0.1ml、TEMED 0.008ml

(9)5％浓缩胶：超纯水2.85ml、30％Acr/Bic 0.85ml、0.5mol/LTris·HCl(pH6.8)1.25ml、10％SDS 0.05ml、10％AP 0.025ml、TEMED 0.005ml

2.3小鼠脑组织蛋白的提取

(1)灌注完成后，迅速取出脑组织，置于冰上，用显微镊分离皮层及纹状体，

装于1.5mL EP管内，置于液氮中速冻。

(2)按试剂说明书，向RIPA组织裂解液中，加入Phostop磷酸酶抑制剂，按100:1的比例加入蛋白酶抑制剂PMSF。

(3)称量待抽提脑组织，按照100mg/100μL的比例，加入组织裂解液。

(4)冰浴状态下超声裂解仪裂解5s，重复3-5次，至裂解液中无可见组织块。

(5)冰上静置30min，14000rpm4℃离心15min，转移上清至新EP管中待测。

(6)用BCA法测定抽提蛋白样品浓度，配平样品蛋白浓度至5μg/μL，并分装

成20μL/管，-80℃保存备用。

2.4SDS-PAGE蛋白凝胶电泳(Western blot)

(1)将配胶玻璃板清洗干净，37℃烤箱烘干。随后将玻璃板底边对齐后放入配

胶装置中夹紧，再将玻璃板卡在架子上，使其底边紧压于密封橡胶条中，防止漏胶。

(2)配置6％分离胶，吹打混匀后沿玻璃板一侧缓慢将分离胶加入两玻

璃板之间，随后加入异丙醇压胶，左右摇晃2-3次后室温静置30min，待分离胶凝固。

(3)分离胶凝固后，倒掉异丙醇并用滤纸吸干多余的液体,配制5％浓缩胶，吹打混匀后沿玻璃板一侧缓慢加入两玻璃板之间，随后将预先洗净晾干的梳子快速插入两玻璃板之间，注意避免气泡产生，室温静置30min。

(4)从-80℃冰箱中取出待测样本，冰浴化冻，按3:1的比例加入4X SDS LoadingBuffer，吹打混匀，100℃煮沸10min，随后冰上静置待用。

(5)将玻璃板放入电泳夹中夹紧，将梳子拔出，倒入1×电泳液。

(6)上待检测的蛋白样品8μL(30μg)，170kDa或350kDa蛋白marker8μL。

(7)80V电泳至Loading Buffer的溴芬蓝跑过浓缩胶并压缩成一条线后，恒压120V电泳至目的蛋白分离充分。

(8)转膜：剪取7cm X 6cm PVDF膜，甲醇彻底浸泡20s后，置1X转膜液中平衡5min。分离玻璃板，弃置浓缩胶，将分离胶置于铺放好的滤纸上。于1X转膜液水浴中，从正极到负极，按下列顺序依次放置夹子透明面、海绵、两层滤纸、

PVDF膜、分离胶、两层滤纸、海绵，夹子黑面制作转膜三文治结构。

(9)然后将夹子放入转膜槽，夹子黑面对槽的黑面，夹子的透明面对槽的红面，加入1×转膜液，冰上湿转，300mA恒流180min。

(10)取出PVDF膜，1X TBST漂洗1min，5％BSA室温摇床封闭1h。

(11)封闭后，根据蛋白Marker条带显示的位置将目的蛋白及内参蛋白所在

PVDF膜剪出放置于抗体孵育盒中，加入用5％BSA稀释后的一抗，4℃摇床孵育过夜。

(12)过夜孵育后，将膜放在1X TBST中常温摇床漂洗3次，每次5min。

(13)随后加入1％BSA稀释后的二抗，室温摇床孵育1h。

(14)1X TBST中常温摇床漂洗3次，每次5min。

(15)按照说明书配置化学发光液。

(16)将PVDF膜置于化学发光液中浸泡均匀，取出放于化学发光仪样品托板上，用滤纸印干多余发光液，进行化学发光成像。

实施例1：HTT siRNA/RVG质粒的构建以及干扰效率检测

利用限制性内切酶对对照质粒进行处理，回收线性载体后，利用T4连接酶将RVG-HTT siRNA组合片段与载体进行连接；得到的连接产物进行转化实验并涂布于抗性平板；第二天挑取单克隆，测序确定质粒序列的正确性。按照这种方法，将4个含有不同的针对HTT的组合片段连入载体，构成质粒分子，分别命名为HTT si-1、HTT si-2、HTT si-3、HTT si-4、HTT si-5(如图1所示)。

将五种质粒分子分别转染汇合度60-70％的人源神经细胞系SHSY5Y，30小时后利用western实验检测细胞中HTT的表达水平。结果表明五种HTT si对HTT蛋白的干扰效率都比较高(如图2所示)。

实施例2：质粒表达的siRNA在体内对HTT的抑制效果

使用HTT si-2、HTT si-5进行后续的实验，将对照质粒和HTT siRNA/RVG质粒按照10mg/kg的剂量对3个月的HD转基因小鼠BACHD进行尾静脉注射，每两天注射一次，共注射7次，最后一次注射24小时后处死小鼠，取小鼠的脑组织进行western blot实验。

结果表明，两种质粒分子在体内都可以有效降低脑组织中mHTT的表达水平，HTTsi-5干扰效率更高(如图3，A-C所示)。

将8周的HD转基因小鼠N171-82Q随机分成对照组和治疗组，将对照质粒和HTT si-5质粒按照10mg/kg的剂量对N171-82Q小鼠进行尾静脉注射，每两天注射一次，共注射7次，最后一次注射24小时后处死小鼠，取小鼠的脑组织进行western blot实验。结果表明HTTsi-5质粒分子在体内可以有效降低脑组织中mHTT的表达水平(如图4，A-C所示)

将6周的HD转基因小鼠YACHD随机分成对照组和治疗组，将对照质粒和HTT si-5质粒按照10mg/kg的剂量对YACHD小鼠进行尾静脉注射，每周注射两次，注射8周，最后一次注射24小时后处死小鼠，取小鼠的脑组织进行westernblot实验。结果表明HTT si-5质粒分子在体内可以有效降低脑组织中mHTT的表达水平(如图5，A-D所示)。

并且，HTT si-1、2、3以及4质粒分子在体内也可以有效降低脑组织中mHTT的表达水平。

实施例3：HTT siRNA/RVG质粒对HD转基因小鼠运动能力的改善效果

同时还对HD转基因小鼠的运动能力进行了评估，在给药之前对N171-82Q小鼠进行疲劳转棒实验，训练一天，之后每天三次，一共进行三天，在给药后完成为期三天的疲劳转棒实验以及平衡实验。结果表明，注射HTT siRNA/RVG质粒可以有效提高N171-82Q小鼠疲劳耐受能力(如图4，D所示)。

对于YACHD小鼠，在给药之前进行为期三天的疲劳转棒实验，在尾静脉注射四周和八周之后再次进行疲劳转棒实验。结果表明注射HTT siRNA/RVG质粒可以有效缓解YACHD小鼠疲劳转棒试验指标恶化(如图5，E所示)

并且，注射HTT siRNA(1-4)/RVG质粒也可以有效缓解YACHD小鼠疲劳转棒试验指标恶化。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 南京优智源医药科技有限公司

<120> 一种抑制HTT基因表达的siRNA及其前体和应用

<130> P2019-0390

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

ugacucugcg ucaucacugc a 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

uugguagcug aaaguucuu 19

<210> 6

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

aattcgtgac tctgcgtcat cactgcagtt ttggccactg actgactgca gtgaacgcag 60

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<210> 7

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

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<210> 8

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

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<210> 9

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

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tacca 65

<210> 10

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

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