包含出芽短梗霉菌株的培养物或提取物的用于皮肤再生或皮肤镇定的低刺激组合物

摘要

本说明书公开了一种用于皮肤再生或皮肤镇定的低刺激的组合物，其包含作为有效成分的以下物质：出芽短梗霉菌株，其裂解物，其培养物，或所述菌株、裂解物或培养物的提取物。与现有的功能性成分不同地，所述组合物在具有皮肤再生效果的同时，因没有皮肤刺激而安全，并且通过缓解刺激而具有皮肤镇定效果。

说明书

技术领域

本说明书公开了一种用于皮肤再生或皮肤镇定的低刺激的组合物，其包含作为有效成分的以下物质：出芽短梗霉菌株，其裂解物，其培养物，或所述菌株、裂解物或培养物的提取物。

【相关申请】

本申请要求2018年11月9日提出申请的、申请号为第10-2018-0137527号的韩国专利申请的优先权，在此将其全文引入作为参考。

背景技术

近来，随着避免使用化学原料、昆虫和动物性原料，对于源自自然的亲生物的功效原料的需求正在增加。与石油、水等不同地，微生物资源由于可以再生产而被归类为可再生资源，并且可以利用适应各种环境的微生物所固有的特性，因此研究及工业应用可能性极高。

另一方面，在许多皮肤外用产品中，不可避免会使用到与皮肤保护目的无关的成分，例如表面活性剂、防腐剂、香料、色素等，但是这些成分会对敏感皮肤产生各种副作用。此外，以美白、改善皱纹、去除角质、皮肤再生等目的而包含于功能性产品中的功能性成分，如AHA(α羟基酸)、视黄醇、熊果苷等是刺激皮肤和引起皮肤不适的主要原因，并且由于这些副作用，导致难以用能够发挥最大功效的浓度来使用这些物质。例如，视黄醇及其衍生物已被认为是具有优异的皮肤再生效果的功效成分，但同时对皮肤刺激较大，因此在敏感皮肤中需谨慎使用。因此，需要开发具有缓解皮肤刺激或镇定皮肤功效的材料，并且需要开发能够充分发挥其功能性功效而不会刺激皮肤的材料。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：韩国专利公开号10-2008-0010443A。

发明内容

技术问题

在一个方面，本说明书旨在提供一种通过利用微生物资源而对皮肤无刺激且具有皮肤再生功效的组合物。

在另一个方面，本说明书旨在提供一种通过利用微生物资源而对皮肤无刺激且具有皮肤镇定功效的组合物。

在又另一个方面，本说明书旨在提供一种对皮肤无刺激且具有皮肤再生及皮肤镇定功效的菌株。

技术方案

在一个方面，本说明书公开的技术提供一种用于皮肤再生的低刺激的组合物，其包含作为有效成分的以下物质：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物。

在另一个方面，本说明书公开的技术提供一种用于皮肤镇定的低刺激的组合物，其包含作为有效成分的以下物质：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物。

在一个示例性的实施例中，所述菌株可以是保藏编号为KCCM12142P的出芽短梗霉GJW。

在一个示例性的实施例中，所述菌株可具有SEQ ID NO：1所示的18S rDNA。

在一个示例性的实施例中，所述培养物的提取物可为培养液的乙醇馏分。

在一个示例性的实施例中，所述组合物可促进皮肤伤口愈合或缓解疤痕形成。

在一个示例性的实施例中，所述组合物可缓解皮肤刺激。

在一个示例性的实施例中，所述组合物可缓解由α羟基酸引起的皮肤刺激。

在一个示例性的实施例中，所述α羟基酸可为选自乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸和甘醇酸中的一种或多种物质。

在一个示例性的实施例中，所述皮肤可为敏感性皮肤。

在一个示例性的实施例中，所述组合物可为化妆品组合物。

在又另一个方面，本说明书公开的技术提供保藏编号为KCCM12142P的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GJW菌株。

在一个示例性的实施例中，所述菌株可具有低刺激的皮肤再生功效。

在一个示例性的实施例中，所述菌株可具有低刺激的皮肤镇定功效。

有益效果

在一个方面，本说明书公开的技术效果在于提供一种通过利用微生物资源而对皮肤无刺激且具有皮肤再生功效的组合物。

在另一个方面，本说明书公开的技术效果在于提供一种通过利用微生物资源而对皮肤无刺激且具有皮肤镇定功效的组合物。

在又另一个方面，本说明书公开的技术效果在于提供一种对皮肤无刺激且具有皮肤再生及皮肤镇定功效的菌株。

附图说明

图1示出了在本说明书的一个实验实施例中对出芽短梗霉培养液的提取物的皮肤细胞安全性进行确认的结果。

图2示出了在本说明书的一个实验实施例中对出芽短梗霉培养液的提取物的皮肤再生功效进行确认的结果。在图表中，x轴代表时间，y轴代表再生面积(wound healingarea，伤口愈合面积，％)。

图3示出了在本说明书的一个实验实施例中对出芽短梗霉培养液的提取物的皮肤镇定功效进行确认的结果。

具体实施方式

以下，将详细描述本发明。

在一个方面，本说明书公开的技术提供一种用于皮肤再生的低刺激的组合物，其包含作为有效成分的以下物质：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物。

在另一个方面，本说明书公开的技术提供一种低刺激的皮肤再生方法，该方法包括：将出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物以低刺激的对皮肤再生有效的剂量施用于需要其的受试者。

在另一个方面，本说明书公开的技术提供用于皮肤再生的低刺激的出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物。

在另一个方面，本说明书公开的技术提供出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物用于皮肤再生的低刺激的非治疗性用途。

在另一个方面，本说明书公开的技术提供出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物在制备用于皮肤再生的低刺激的组合物中的用途。

在另一个方面，本说明书公开的技术提供一种用于皮肤镇定的低刺激的组合物，其包含作为有效成分的以下物质：出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物。

在另一个方面，本说明书公开的技术提供一种低刺激的皮肤镇定方法，该方法包括：将出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物以低刺激的对皮肤镇定有效的剂量施用于需要其的受试者。

在另一个方面，本说明书公开的技术提供用于皮肤镇定的低刺激的出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物。

在另一个方面，本说明书公开的技术提供出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物用于皮肤镇定的低刺激的非治疗性用途。

在另一个方面，本说明书公开的技术提供出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物在制备用于皮肤镇定的低刺激的组合物中的用途。

在一个示例性的实施例中，所述出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物可以以药物组合物、皮肤外用剂组合物、化妆品组合物或食品组合物的形式使用。

在一个示例性的实施例中，所述施用可为向受试者进行给药或涂布。

在功能性化妆品所包含的功能性成分，例如具有皮肤再生功效的成分中，因对皮肤刺激较大而引起皮肤不适的情况较多，但根据本说明书的组合物的特征在于，具有皮肤再生和/或皮肤镇定功效的同时，对皮肤无刺激，从而具有能够使用于敏感皮肤的优异效果。

在本说明书中，“有效成分”是指可单独表现出所需活性的成分或与自身无活性的载体等一起表现出所需活性的成分。

出芽短梗霉也被称为黑酵母，是发现于土壤、空气中的微生物之一，具有出色的环境适应性。据悉，出芽短梗霉可以在低湿度、高温、高日照辐射、甚至放射性核素(radionuclides)的环境中生存和生长。出芽短梗霉会像人类皮肤通过生成黑色素色素来保护自身免受紫外线或有机自由基(free radical)的侵害，并且通过在菌体周围生成β-葡聚糖例如普鲁兰多糖(pullulan)来保护自身免受外部环境的侵害(N.A.Yurlova等人，2008，微生物学研究(Studies in Micrology)61：39-49)。

在一个示例性的实施例中，所述菌株可以是保藏编号为KCCM12142P的出芽短梗霉GJW。

在一个示例性的实施例中，所述菌株可具有SEQ ID NO：1所示的18S rDNA。

【SEQ ID NO：1】

在又另一个方面，本说明书公开的技术提供保藏编号为KCCM12142P的出芽短梗霉GJW菌株。所述菌株具有SEQ ID NO：1所示的18S rDNA。

在一个示例性的实施例中，所述菌株可具有低刺激的皮肤再生功效。

在一个示例性的实施例中，所述菌株可具有低刺激的皮肤镇定功效。

在一个示例性的实施例中，所述菌株可通过如下方式制备成冻干粉的形式来使用：对菌株进行培养，将培养液进行离心分离后，用无菌生理盐水进行洗涤，然后分散在溶剂如无菌油中并进行冷冻干燥以制备冻干粉。

所述菌株的裂解物可以是指通过用化学或物理的力使菌株本身破碎而获得的产物。

所述菌株的培养物可以是指培养菌株的培养基中所含的部分或全部物质，而与诸如固体培养或液体培养的培养物形式无关。例如，可以是指包含作为菌株培养产物的代谢物或分泌物的物质或其裂解物，菌株本身也可包含于培养物中。根据本发明的一个实施例，所述培养物可在包含马铃薯提取物(potato extract)和葡萄糖(dextrose)的培养基中进行培养。

所述提取物可以是指通过对菌株本身、菌株的裂解物、菌株的培养物或它们的混合物进行提取而获得的产物，而与提取方法、提取溶剂、提取出的成分或提取物的形态无关，是包括可在提取后通过其他方法进行加工或处理而获得的所有物质的广义概念。

在一个示例性的实施例中，所述提取物可使用选自水、具有1至6个碳原子的无水或含水醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇或丁醇)、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、甘油、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、亚甲基氯、乙酸丁酯、二乙醚、二氯甲烷、己烷及它们的混合物中的提取溶剂来提取。

在一个示例性的实施例中，所述提取物可使用选自水、醇或它们的混合物中的溶剂来提取，可优选使用选自C

在一个示例性的实施例中，所述提取物可为乙醇馏分。

在一个示例性的实施例中，所述培养物的提取物可为培养液的乙醇馏分。

在一个示例性的实施例中，基于组合物的总重量，所述出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物的含量可为0.001重量％至30重量％。具体地，基于组合物的总重量，含量可为0.001重量％或以上、0.01重量％或以上、0.1重量％或以上、0.5重量％或以上、1重量％或以上、1.5重量％或以上、或2重量％或以上，且可为30重量％或以下、25重量％或以下、20重量％或以下、15重量％或以下、10重量％或以下、或5重量％或以下。

本说明书中的“低刺激”可指，当在诊断为敏感性皮肤的人的皮肤上涂布所述出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物时，不会发生皮肤干燥、红斑、皮疹、角质、发痒或灼热等皮肤不适(skintroubles)，或者刺激程度很小以至于敏感性皮肤当事人感觉不到不适。

在另一个方面，本说明书中的“低刺激”可指，通过HET-CAM测试并用终止反应评估法对所述组合物或所述出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物进行刺激分数的评估时，S分数值小于6、小于5、小于4、小于3、小于2、小于1、或为0。

在又另一个方面，本说明书中的“低刺激”可指，通过HET-CAM测试并用反应时间评估法对所述组合物或所述出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物进行刺激分数的评估时，IS分数值小于5、小于4、小于3、小于2、小于1、或为0。

HET-CAM测试是兔眼刺激Draise试验方法的替代试验方法，该试验方法用于评估测试物质对粘膜的急性刺激程度。代替表示由物质引起的眼结膜(conjunctiva)的血管反应程度，通过将测试物质施用于受精培养的鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)来进行，并且一般会使用熟知的品种(通常为white horn)产出的新鲜且具有固有形态的种蛋。

<1>眼的校准

在每次接收种蛋时，通过将Texapon

[0.5％-弱-出血及溶解]

[1.0％-中等-出血及溶解]

[5.0％-强-出血及溶解]

根据上述给定的浓度施用于至少两个种蛋，并用肉眼确认实时的反应参数，以将判断基准保持在一定的状态，所描述的程度类别由5分钟的施用时间确定，将成为预备试验的主观评估标准。

<2>预备试验

通过预备试验来确定本实验是用反应时间测定法进行、还是用终止反应评估法进行。

-将测试物质滴到准备好的种蛋上。

-液体：300μl

(**SOP依据论文：在固体情况下，滴下的量需足以覆盖至少25％的膜)

-施用测试物质后，检查毛细血管是否发生出血(hemorrhage)、溶解(lysis)、凝固(血管内/血管外)。

-对于固体、霜、有颜色的物质或没有渗透性的测试物质，进行30秒的反应后，用生理盐水进行20秒的洗涤，然后由测试观察者进行一定时长(例如3分钟)的观察。反应后，根据下表1中的反应基准进行分类。

【表1】

(**在进入实验之前，先确认是否符合以下要求，然后进行实验)

(甲)在反应时间测定法中，当施用测试物质时，所施用的测试物质不应妨碍观察整个CAM(应确保整个CAM的视野)。

(乙)在终止反应评估法中，将测试物质施用于CAM后，用生理盐水进行洗涤时，测试物质应为能够与膜分离的物质。

-使用测试物质时，用生理盐水进行洗涤后，至少观察30秒或以上，然后运用所述表1的基准。

<2>本实验

[反应时间测定法]

-每种测试物质使用6个种蛋。

-准备3个或更多的秒表。

-如果在预备试验中仅发生出血和溶解反应，则用左手握住2个秒表，用右手将移液管中的300μl物质施用于CAM，然后立即启动秒表。

-仔细进行观察，在开始出现出色和溶解时停止秒表，然后以秒为单位记录在纸上。

-如果是发生凝固反应的物质，则只停止2个秒表中的1个，用剩余的1个观察溶解后，记住该时间点的时间。然后，在不停止的情况下测定发生凝固时的时间。

-在完成6个种蛋的记录之后，求得刺激指数(将在下面详细描述)。

-当天如果有实验进行，则需要按照相同的方法施用浓度为5％的作为实验室推荐物质的阴离子表面活性剂Texapon

【表2】

[终止反应评估法]

-如果因非渗透性物质而无法观察到CAM，则进行终止反应评估法。

-与反应时间测定法相同地，每种测试物质使用6个准备好的种蛋。

-施用物质后，按秒表。

-静置30秒，经过30秒后用生理盐水对CAM小心地进行20秒的洗涤。此时，应注意避免用生理盐水强力洗涤，以防止CAM被撕裂。

-如果在物质处理期间血液与之混合在一起，则在洗涤期间会被洗掉，因此应在洗涤后经过30秒后再评估反应。

-与预备试验相同地，对各个反应的程度进行分类并跟随列表(0＝无，1＝弱，2＝中等，3＝强反应)。

<4>计算结果

表3示出了根据反应时间测定法的换算分数判定表。IS值由原始数据通过公式300[IS]＝5[301-H]+7[301-L]+9[301-C]计算得出，该值介于0至21之间(H、L、C是在300秒的观察时间内观察到各个反应的开始时间)。

【表3】

根据终止反应评估法的评估通过用各观察项目的合计[S]值表示，并将换算分数判定表示于表4。为了评估非渗透性物质的刺激程度，应将测试物质溶解于水中并以最高浓度通过反应时间测定法进行计算。

【表4】

在一个示例性的实施例中，所述组合物或所述出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物可促进皮肤伤口愈合或缓解疤痕形成。

在一个示例性的实施例中，所述组合物或所述出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物可缓解皮肤刺激或皮肤不适。

在一个示例性的实施例中，所述组合物或所述出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物可缓解由皮肤外用产品引起的皮肤刺激。

在一个示例性的实施例中，所述皮肤外用产品可包含选自表面活性剂、防腐剂、香料、色素及功能性成分中的一种或多种物质，并且所述功能性成分可具有例如美白、改善皱纹、去除角质或皮肤再生等的功效。

在一个示例性的实施例中，所述组合物或所述出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物可缓解由α羟基酸引起的皮肤刺激。

在一个示例性的实施例中，所述α羟基酸是通过在羧酸的α位碳上加成醇基或羟基而得的化合物，可为选自乳酸(lactic acid)、苹果酸(Malic acid)、酒石酸(Tartaricacid)、柠檬酸(citric acid)和甘醇酸(Glycolic acid)中的一种或多种物质。

在一个示例性的实施例中，所述组合物或所述出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物可缓解由皮肤刺激引起的皮肤干燥、红斑、皮疹、角质、发痒或灼热。

在一个示例性的实施例中，所述皮肤可为敏感性皮肤。根据本说明书的组合物或出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物具有使皮肤对外部刺激敏感的人的受损皮肤得到再生或镇定的效果，而不会刺激皮肤。

在一个示例性的实施例中，所述组合物可为药物组合物。

除了有效成分之外，所述药物组合物可进一步包含防腐剂、稳定剂、可湿性粉剂或乳化剂、如盐和/或缓冲剂等的用于控制渗透压的药物辅助剂、以及其它对治疗有用的物质，并且可根据常规方法制备成各种口服剂型或肠胃外给药剂型。

所述口服剂型例如可为片剂、丸剂、硬胶囊及软胶囊、液体、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、粉剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、微丸剂等，这些剂型除了包含有效成分以外，还可以包含表面活性剂、稀释剂(例：乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例：二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁盐或钙盐、以及聚乙二醇)。片剂还可包含诸如硅酸铝镁、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮的粘合剂，并根据具体情况还可包含诸如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐的崩解剂、吸收剂、着色剂、调味剂、以及甜味剂等的药物添加剂。所述片剂可通过常规的混合、制粒或包衣方法进行制备。

此外，所述肠胃外给药剂型可为经皮给药剂型，例如可为注射剂、滴剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、霜剂、喷雾剂、悬浮剂、乳剂、栓剂、贴剂等剂型，但不限于此。

确定所述有效成分的给药剂量属于本领域普通技术人员的知识水平内，并且药物的日剂量将根据待给药的受试者的进展程度、发病时间、年龄、健康状况和并发症等的各种因素而变化，当以成人为基准时，在一个方面，可每天将1μg/kg至200mg/kg的所述组合物分为1次至3次进行给药，在另一个方面，可每天将50μg/kg至50mg/kg的所述组合物分为1次至3次进行给药，但所述给药剂量不以任何方式限制本发明的范围。

在一个示例性的实施例中，所述组合物可为皮肤外用剂组合物。所述皮肤外用剂作为可包含涂布于皮肤外部的任何物质的总称，其可包含多种剂型的医药品。

除了包含根据本说明书的有效成分之外，所述皮肤外用剂组合物可进一步包含防腐剂、稳定剂、可湿性粉剂或乳化剂、如盐和/或缓冲剂等的用于调节渗透压的药物辅助剂、以及其它对治疗有用的物质，并且可根据常规方法制备成各种肠胃外给药剂型。

所述肠胃外给药剂型可为经皮给药剂型，例如可为注射剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、霜剂、喷雾剂、悬浮剂、乳剂、贴剂等剂型，但不限于此。

在一个示例性的实施例中，所述皮肤外用剂组合物可为针对皮肤再生或皮肤镇定具有药物用途的局部涂布剂。

在一个示例性的实施例中，所述组合物可为化妆品组合物。

除了包含根据本发明的有效成分以外，所述化妆品组合物还可以包含功能性添加剂和通常的化妆品组合物中所包含的成分。所述功能性添加剂可包含选自水溶性维生素、油溶性维生素、高分子肽、高分子多糖、鞘脂和海藻提取物中的成分。除此之外包含的调配成分可为油脂成分、保湿剂、润肤剂、表面活性剂、有机颜料和无机颜料、有机粉末、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物提取物、pH调节剂、醇、色素、香料、血液循环促进剂、冷却剂、止汗剂、纯净水等。

所述化妆品组合物的剂型没有特别的限制，可根据目的适当进行选择。例如，可制备成选自爽肤乳、柔肤水、爽肤水、收敛水、乳液、滋润乳液、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华、面膜、香皂、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、身体乳和沐浴露中的一种或多种剂型，但不限于此。

在一个示例性的实施例中，当本发明的剂型为糊剂、霜剂或凝胶剂时，可将动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅胶、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等用作载体成分。

在一个示例性的实施例中，当本发明的剂型为粉末或喷雾时，可将乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末用作载体成分，尤其当剂型为喷雾时，可进一步包含如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚的推进剂。

在一个示例性的实施例中，当本发明的剂型为溶液或乳浊液时，可将溶剂、溶剂化剂或乳浊化剂用作载体成分，例如有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。

在一个示例性的实施例中，当本发明的剂型为悬浮液时，作为载体成分可使用如水、乙醇或丙二醇的液体稀释剂、如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯等的悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等。

在一个示例性的实施例中，当根据本发明的剂型为含有表面活性剂的洁面剂时，作为载体成分可使用脂肪族醇硫酸盐、脂肪族醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物性油、亚麻酸衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。

在一个示例性的实施例中，所述化妆品组合物可为爽肤水剂型的化妆品组合物，其包含：0.001重量％至0.1重量％的出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物，5重量％至12重量％的包含丙二醇、丁二醇和甘油的多元醇，0.01重量％至1重量％的包含PPG-13-癸基十四醇聚醚-24和PEG-60氢化蓖麻油的增溶剂，0.3重量％至1重量％的包含丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物和丙烯酸酯/C10-30烷基丙烯酸酯交联聚合物的增稠剂，以及余量的水。

在一个示例性的实施例中，所述化妆品组合物可为面膜剂型的化妆品组合物，其包含：0.001重量％至0.1重量％的出芽短梗霉菌株、其裂解物、其培养物、所述菌株的提取物、所述裂解物的提取物、或所述培养物的提取物，15重量％至20重量％的包含鲸蜡醇乙基己酸酯、氢化聚(C6-14烯烃)和角鲨烷的油，1重量％至2重量％的包含聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯和聚甘油-10硬脂酸酯的表面活性剂，5重量％至12重量％的包含丙二醇、丁二醇和甘油的多元醇，0.3重量％至1重量％的包含丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物的增溶剂，以及余量的水。

在一个示例性的实施例中，所述组合物可为食品组合物。

所述食品组合物可为液体或固体状态的剂型，例如为各种食品类、饮料、口香糖、茶、维生素复合剂、健康辅助食品类等，可以以粉末、颗粒、片剂、胶囊或饮料的形式来使用。除有效成分外，各剂型的食品组合物可包含该领域通常所使用的成分，本领域技术人员可以毫无困难地根据剂型或使用目的适当选择这些成分进行配制，并且当与其它原料同时使用时可以获得协同效应。

除了本说明书中公开的有效成分之外，可以包含的液体成分不受特别限制，并且如通常的饮料一样，可以包含各种调味剂或天然碳水化合物等附加成分。所述天然碳水化合物例如包括单糖、葡萄糖、果糖等的二糖，麦芽糖、蔗糖等的多糖，糊精、环糊精等的常规糖，以及木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇等的糖醇等。作为所述调味剂可有利地使用天然调味剂及合成调味剂(例如糖精、阿斯巴甜等)。在本说明书中公开的每100ml组合物中，所述天然碳水化合物的比例一般可为约1g至20g，在一个方面可为约5g至12g。

在一个方面，所述食品组合物可以包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、合成增味剂和天然增味剂等增味剂、着色剂及风味剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。在另一个方面，可包含用于制作天然果汁及蔬菜饮料的果肉。所述成分可以单独使用或组合使用。所述添加剂的比例可以更改，但基于100重量份的本说明书中公开的组合物，所述添加剂的比例通常选择为0.001重量份至约20重量份。

【实施例】

以下，将参考实施例对本发明进行更详细的描述。这些实施例仅用于示例性描述本发明，本领域技术人员应理解的是，本发明的范围并不受这些实施例的限制。

【实施例1】菌株的分离及鉴定

在本实施例中使用的出芽短梗霉菌株是从济州岛Gotjawal地形的伏石蕨中分离的，其分离方法如下。

首先，将收集的伏石蕨在灭菌蒸馏水中进行一次的洗涤以除去异物，然后浸入10倍重量的PBS(磷酸盐缓冲液)中，并以250rpm的速度进行1小时的反应。之后，将所述PBS溶液以10倍、100倍的比例稀释于生理盐水后，接种到PDA(4g/L的马铃薯提取物，20g/L的葡萄糖，15g/L的琼脂)中。在25℃至30℃下对接种的培养基进行2天至7天的培养，并对显示出微生物菌落的菌株进行至少2次到最多4次的继代培养，以最终分离出单一菌株。

通过使用下表5中的ITS1引物和ITS4引物来分析18S rRNA碱基序列，以对分离出的菌株进行鉴定。通过在基因库中搜索已分析的碱基序列，其结果确认到与出芽短梗霉F3-3-60的18S rRNA碱基序列的相似性为94％，将所述菌株命名为出芽短梗霉GJW。此外，在2017年10月31日将所述菌株存放于作为保藏机构的韩国微生物保藏中心(KCCM),被授予的保藏编号为KCCM12142P。

【表5】

【实施例2】出芽短梗霉GJW的培养液及提取物的制备

将所述实施例1中鉴定的出芽短梗霉GJW菌株接种到培养基(4g/L的马铃薯提取物，20g/L的葡萄糖)中，在30℃及120rpm的条件下进行5天的培养，以获得培养液。

之后，在所述出芽短梗霉GJW菌株的培养液中加入等量的乙醇以进行反应，并在4℃下静置1天，以获得培养液的乙醇馏分。通过离心分离对沉淀物进行分离，对所述乙醇馏分进行冷冻干燥，以获得培养液的提取物。

【比较例1】普通酵母提取物的制备

将普通酵母(酿酒酵母，accharomyces cerevisiae KCTC7296)菌株接种到培养基(20g/L的蛋白胨，20g/L的葡萄糖，10g/20L的酵母提取物)中，并在30℃和120rpm的条件下进行1天的培养，以获得培养液。

之后，在所述普通酵母的培养液中加入等量的乙醇以进行反应，并在4℃下静置1天，以获得培养液的乙醇馏分。通过离心分离对沉淀物进行分离，对所述乙醇馏分进行冷冻干燥，以获得培养液的提取物。

【实验实施例1】皮肤细胞安全性的确认

进行如下实验，以确认所述实施例2中获得的出芽短梗霉菌株培养液的提取物对皮肤细胞是否具有安全性。

将在所述实施例2中获得的出芽短梗霉菌株培养液的提取物溶解于纯净水(DW)中，然后处理在皮肤角质形成细胞(HaCaT)上，以确认是否影响细胞生物活性。具体地，将浓度为2×10

其结果，确认到所述出芽短梗霉菌株培养液的提取物对皮肤细胞的生长没有影响，从而对皮肤细胞具有安全性(参照图1)。

【实验实施例2】皮肤低刺激的确认

进行如下实验，以确认所述实施例2中获得的出芽短梗霉菌株培养液的提取物是否刺激皮肤。

通过HET-CAM(The Hen's egg test-Chorioallantoic membrane，鸡胚绒毛尿囊膜)测试来确认是否有刺激性。HET-CAM测试通常用作动物和人体眼刺激试验的替代和预筛选(pre-screening)的方法。具体地，在自动培养箱中并在37.5±0.5℃的温度、55±7％的湿度的条件下对受精卵进行9天的培养。在培养的第10天，通过检蛋器仅选择观察到气室的CAM发育良好的受精卵，以用于实验。将待测样品以相同浓度稀释于溶媒，然后将其涂布在已培养10天的受精卵的绒毛尿囊膜上并进行30秒的反应，然后用37℃的灭菌生理盐水小心洗涤CAM，在经过30秒的时间点通过评估血管的出血、溶解、凝固反应程度来测定刺激分数。使用HET-CAM测试的评估方法中的终止反应评估法，并重复实验3次。通过评估绒毛尿囊膜的血管反应(出血、溶解、凝固)并利用各项目值而测得的S分数示于下表6中。S分数的评估基准表参照所述表4。

如下表6所示，出芽短梗霉菌株培养液的提取物的S分数值为0，确认到无刺激。相反地，普通酵母(Saccharomyces cerevisiae KCTC7296)提取物的S分数值为7，确认到具有轻微的刺激性(moderately irritating)，因此可确认到，出芽短梗霉菌株培养液的提取物是明显优于普通酵母提取物的低刺激成分。

【表6】

【实验实施例3】皮肤再生的确认

进行如下实验，以确认所述实施例2中获得的出芽短梗霉菌株培养液的提取物是否具有皮肤再生效果。

在由皮肤角质形成细胞(HaCaT)充满的单层(Monolayer)上形成线性刮擦伤口(wound)。使用含有10％FBS(胎牛血清，Gibco公司，美国)的DMEM(DDulbecco′s ModifiedEagle Medium，Lonza公司，美国)培养基并在37℃、5％CO

其结果，与未经处理组(CON)相比，出芽短梗霉菌株培养液的提取物在12小时、24小时和36小时均显示出显着的细胞再生功效，并且显示出的再生功效显着更优于已知具有优异的再生功效的羟基积雪草苷。相反地，与未处理组(CON)相比，普通酵母提取物在12小时、24小时和36小时均没有显示出显着的细胞再生功效(参照图2和表7)。与未处理组(CON)的再生面积相比，出芽短梗霉菌株培养液的提取物在形成刮擦伤口的36小时后再生面积增加率约为10.3％，显示出扩大的再生面积，而普通酵母提取物的再生面积增加率仅为约1.3％，因此可确认到出芽短梗霉菌株培养液的提取物与普通酵母提取物不同地具有优异的再生功效。

【表7】

【实验实施例4】皮肤镇定的确认

进行如下实验，以确认所述实施例2中获得的出芽短梗霉菌株培养液的提取物是否具有皮肤镇定效果。

在96孔细胞培养板中对适当量的人皮肤角质形成细胞(HaCaT)进行培养，除去培养基后，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤细胞，然后用含有0.1％乳酸的培养基进行更换。此时，用不同浓度的所述实施例2中获得的出芽短梗霉菌株培养液的提取物进行处理，并进一步培养24小时。在本实验实施例中，通过使用ELISA试剂盒(酶联免疫吸附试验，赛默飞世尔#BMS-243-2)来测定细胞培养液中分泌的IL-1α(白介素-1α)的浓度，以评估对于刺激反应的皮肤镇定效果(每组n＝4)。

其结果，由乳酸诱导的刺激反应使IL-1α的浓度上升，但是在用出芽短梗霉菌株培养液的提取物进行处理时，由乳酸诱导的刺激反应会得到缓解，从而确认到具有皮肤镇定效果(参照图3)。

以下将描述根据本说明书的一个方面的组合物的剂型实施例，但是也可以应用于各种其他剂型，其仅旨在详细地描述本发明，而并非限制本发明。

【剂型实施例1】柔肤化妆水

将0.01重量％的所述实施例2的出芽短梗霉培养液、3重量％的甘油、2重量％的丁二醇、2重量％的丙二醇、0.1重量％的羧基乙烯聚合物、10重量％的乙醇、0.1重量％的三乙醇胺、微量的防腐剂、微量的着色剂、微量的香料及剩余量的纯净水进行混合，并根据常规的制备方法制备柔肤化妆水。

【剂型实施例2】营养化妆水

将0.01重量％的所述实施例2的出芽短梗霉培养液、4重量％的蜂蜡、1.5重量％的聚山梨醇酯60、0.5重量％的失水山梨醇倍半油酸酯、5重量％的液体石蜡、5重量％的角鲨烷、5重量％的辛酸/癸酸甘油三酯、3重量％的甘油、3重量％的丁二醇、3重量％的丙二醇、0.1重量％的羧基乙烯聚合物、0.2重量％的三乙醇胺、微量的防腐剂、微量的着色剂、微量的香料及剩余量的纯净水进行混合，并根据常规的制备方法制备营养化妆水。

【剂型实施例3】营养霜

将0.01重量％的所述实施例2的出芽短梗霉培养液、10重量％的蜂蜡、1.5重量％的聚山梨醇酯60、0.5重量％的失水山梨醇倍半油酸酯、10重量％的液体石蜡、5重量％的角鲨烷、5重量％的辛酸/癸酸甘油三酯、5重量％的甘油、3重量％的丁二醇、3重量％的丙二醇、0.2重量％的三乙醇胺、微量的防腐剂、微量的着色剂、微量的香料及剩余量的纯净水进行混合，并根据常规的制备方法制备营养霜。

【剂型实施例4】面膜

将0.01重量％的所述实施例2的出芽短梗霉培养液、13重量％的聚乙烯醇、0.2重量％的羧甲基纤维素钠、0.1重量％的尿囊素、5重量％的乙醇、0.3重量％的壬基苯基醚、微量的防腐剂、微量的着色剂、微量的香料及剩余量的纯净水进行混合，并根据常规的制备方法制备面膜。

【剂型实施例5】用于局部给药的药物(贴剂)

按照下表8中所示的组成并根据常规的制备方法制备用于局部给药的药物(贴剂)。

【表8】

【剂型实施例6】散剂

将2g所述实施例2的出芽短梗霉培养液和1g乳糖进行混合后，填充至不透气的小袋中以制备散剂。

【剂型实施例7】片剂

将100mg所述实施例2的出芽短梗霉培养液、100mg玉米淀粉、100mg乳糖、2mg硬脂酸镁进行混合后，根据常规的制备方法进行压片以制备片剂。

【剂型实施例8】胶囊剂

将100mg所述实施例2的出芽短梗霉培养液、100mg玉米淀粉、100mg乳糖、2mg硬脂酸镁进行混合后，根据常规的制备方法填充至明胶胶囊中以制备胶囊剂。

【剂型实施例9】丸剂

将1g所述实施例2的出芽短梗霉培养液、1.5g乳糖、1g甘油、0.5g木糖醇进行混合后，根据常规方法制备每丸为4g的丸剂。

【剂型实施例10】颗粒剂

将150g所述实施例2的出芽短梗霉培养液、50mg大豆提取物、200mg葡萄糖、600mg淀粉进行混合后，添加100mg的30％乙醇，并在60℃下进行干燥以形成颗粒，然后填充至小袋中以制备颗粒剂。

【剂型实施例11】饮剂

将50mg所述实施例2的出芽短梗霉培养液、10g葡萄糖、0.6g柠檬酸、及25g液体寡醣进行混合后，添加300ml纯净水，在每瓶中填装200ml。向瓶中填装后，在130℃下进行4秒至5秒的杀菌，以制备饮料。

【剂型实施例12】焦糖

将150g所述实施例2的出芽短梗霉培养液、1.8g玉米糖浆、0.5g脱脂奶、0.5g大豆卵磷脂、0.6g黄油、0.4g氢化植物油、1.4g砂糖、0.58g人造黄油和20mg食盐进行混合并成型，以制备焦糖。

如上所述，已详细描述了本发明内容的特定部分，本领域技术人员应理解的是，这些具体的技术仅为优选实施例，本发明的范围不限于此。因此，本发明的保护范围将由所附权利要求书及其等同物限定。

【保藏机构】

保藏机构名称：韩国微生物保藏中心，

保藏编号：KCCM12142P，

保藏日期：2017年10月31日。

【微生物保藏证明】

<110> 株式会社爱茉莉太平洋

<120> 包含出芽短梗霉菌株的培养物或提取物的用于皮肤再生或皮肤镇定的低刺激组合物

<130> OF19P109/PCT

<150> KR 10-2018-0137527

<151> 2018-11-09

<160> 3

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 574

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 出芽短梗霉 GJW

<400> 1

ggggactgcg gaggatcatt aagagtaagg gtgctcagcg cccgacctcc aaccctttgt 60

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ITS1 primer

<400> 2

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<210> 3

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ITS4 primer

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

PCT/RO/134表