公开/公告号CN112996537A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-06-18
原文格式PDF
申请/专利权人 勃林格殷格翰动物保健有限公司;
申请/专利号CN201980071662.9
申请日2019-10-28
分类号A61K39/12(20060101);A61K39/215(20060101);C07K14/005(20060101);A61K39/00(20060101);A61P31/12(20060101);
代理机构72002 永新专利商标代理有限公司;
代理人左路;区斌
地址 德国英格尔海姆
入库时间 2023-06-19 11:27:38
序列表
本申请包含根据37C.F.R.1.821–1.825的序列表。本申请所附的序列表通过引用以其全部内容并入本文。
发明背景
禽冠状病毒传染性支气管炎病毒(IBV)是巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科的原型γ冠状病毒。传染性支气管炎病毒主要感染鸡的上呼吸道上皮,导致呼吸系统疾病,通常并发继发细菌病原体感染(Cook et al.2012.Avian Pathol.41:239-250)。一些IBV毒株还影响肾小管、输卵管和部分胃肠道,导致这些器官系统中的病理性病变和临床体征。所述病毒广泛存在于商业家禽和庭院家禽中。由于其高基因组变异性,IBV被划分为多种基因型、血清型和保护型。IBV目前被认为是家禽业中经济上最相关的病毒病原体之一。
传染性支气管炎病毒是一种包膜病毒,具有27.6kb的正向单链RNA基因组(Cavanagh 2007.Vet.Res.38:281-297)。病毒基因组的前三分之二包含一个大编码区(也称为基因1),分为两个开放读框1a和1b,其编码参与RNA复制、编辑和转录的15种非结构蛋白。病毒基因组的最后三分之一编码结构蛋白:刺突蛋白(S,由基因2编码),包膜蛋白(E,由基因3c编码),膜蛋白(M,由基因4编码),核壳蛋白(N,由基因6编码)。蛋白质S、E和M是病毒包膜的一部分,而蛋白质N与病毒RNA一起形成核糖核蛋白核心。冠状病毒刺突蛋白决定了宿主物种向性(Kuo et al.2000.J.Virol.74:1393-1406)。其是一种二聚体或三聚体跨膜蛋白,被蛋白水解成两个亚基S1和S2。高度糖基化的S1 结构域形成刺突蛋白的“头部”,包含与宿主细胞表面上的2,3-连接的唾液酸相互作用的受体结合域(Promkuntod etal.2014.Virology.448:26-32)。S2结构域包含胞外域 (ectodomain)的其余部分(“茎干”)、跨膜结构域和位于细胞质中的胞内域。
迄今为止,最广泛使用的减毒活IBV疫苗株是在1960年代在荷兰通过对Massachusetts样IBV毒株进行连续传代而开发的(Bijlenga et al.2004;Avian Pathol.33:550-557)。然而,自1970年代以来,出现了新的IBV血清型,传统的Massachusetts 样疫苗对其没有提供足够的保护(Cook et al.2012.Avian Pathol.41:239-250)。因此,仍需要针对其它IBV血清型的新型且高效的IBV疫苗。
IBV Beaudette(Geilhausen et al.1973.Arch Gesamte Virusforsch.:40(3)(1973),pp. 285-290)和H120(G.Bijlenga et al.2004.Avian Pathol.:33(6);pp.550-557)是减毒的IBV。但是,减毒可能会导致免疫原性丧失。
此外,已经产生重组IBV。Zhou et al.2016(Arch Virol.;161:3179–3187)公开了具有Beaudette(Massachusetts基因型)刺突蛋白的H120(Massachusetts基因型)IBV。Hodgson et al.2004(J Virol 78:13804–13811)公开了具有M41(Massachusetts基因型)刺突蛋白的Beaudette(Massachusetts基因型)IBV。此外,Armesto et al.2011(PLoS One:6(8):e24352)公开了具有来自4/91(4/91基因型)的异源刺突蛋白的IBV Beaudette(Massachusetts基因型)。
然而,Zhou et al.2016和Hodgson et al.2004公开的重组IBV均不能被视作具有异源刺突蛋白的IBV,因为IBV和插入的刺突蛋白均来自相同的基因型/血清型(Massachusetts)。再者,所有提及的疫苗均基于Beaudette的骨架或具有来自Beaudette的刺突蛋白。
此外,尽管已经在数十年前已经描述了Beaudette以及已知使用Beaudette的重组方法已超过十年,但是尚无基于Beaudette的疫苗和这种重组疫苗(具有异源刺突蛋白) 可商购。基于Beaudette的重组IBV不适合作为疫苗。Wei et al 2014(Apl MicrobiolBiotechnol 98)公开了具有H120的S1亚基的Beaudette IBV。
Ellis et al 2018(J.Virol.92(23))、Hodgson et al(J.Virol.78(24))和Armesto et al. 2011(PLoS One:6(8):e24352)均公开了具有M41或4/91刺突蛋白的Beaudette IBV。然而, Ellis et al 2018(J.Virol.92(23))描述了重组Beaudette,其具有来自M41或QX的异源S1 亚基组合Beaudette刺突蛋白S2亚基的嵌合刺突蛋白,其不能为S1同源性攻击提供足够的保护(“用表达毒性毒株M41或QX的S1即BeauR-M41(S1)和BeauR-QX(S1)的rIBV 单次接种无特定病原体的鸡,基于纤毛活动性和临床体征提供不完全的抵抗同源攻击的保护作用”;摘要)。进一步地,Ellis et al 2018(J.Virol.92(23))描述了全长S基因(来自 M41的S1和S2)仅提供抵抗同源血清型IBV攻击的部分保护作用(第12页),提示IBV Beaudette毒株不适合作为重组IBV疫苗的骨架。Hodgson et al(J.Virol.78(24))进一步公开了Baudette毒株“也被认为是较差免疫原性”,因此,“其从未被用作疫苗毒株”(第13802 页,左栏,第二段)。因此,需要分别产生新型高效IBV疫苗和重组IBV疫苗。此外,需要高效的IBV疫苗载体。
发明详述
在描述本发明的各方面之前,必须注意,如本文和所附权利要求书中所使用的,单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义,除非上下文另外明确指出。因此,例如,提及“一种抗原”时包括多种抗原,提及“病毒”时是指本领域技术人员已知的一种或多种病毒及其等同物,等等。除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中,但是现在描述优选的方法、装置和材料。为了描述和公开出版物中报道的可以与本发明一起使用细胞系、载体和方法学的目的,本文提及的所有出版物均通过引用以其全部内容并入本文。本文任何内容都不能被解释为承认本发明无权由于发明在先而先于这些披露。
本发明解决了现有技术中固有的问题,并在现有技术中提供了明显的进步。
通常,本发明提供了编码异源IBV S(刺突)蛋白或其片段的4/91 IBV(传染性支气管炎病毒)。
术语“4/91 IBV”为是本领域技术人员熟知。术语“IBV”是指传染性支气管炎病毒。术语“4/91”可与术语“793B”互换使用,定义特定的IBV血清型或基因型。4/91血清型或基因型为本领域技术人员熟知,包括例如UK/4/91、UK/793B/91和CR88的毒株。IBV 株通常通过刺突蛋白S1亚基的编码序列加以区分(Valastro et al.2016.Infect Genet Evol. 39:349-364),但也可以通过其完整核苷酸序列或特定蛋白如刺突蛋白、核壳蛋白、包膜 (E)蛋白或膜(M)糖蛋白的序列加以区分。由于刺突蛋白决定了IBV的宿主向性和抗原性,因此IBV基因型通过刺突蛋白亚基1的编码序列进行分类。或者,IBV毒株可以通过其血清型加以区分。血清型分类涉及用中和抗体处理病毒。
如何获得4/91 IBV是本领域技术人员的常识。4/91 IBV毒株可以商购,例如示例的
术语“刺突蛋白”是指为本领域技术人员熟知的IBV的一种特定蛋白质。刺突蛋白是抗体和保护性免疫反应的主要诱导物。此外,刺突(S)蛋白通过结合宿主细胞的细胞受体以及还通过介导与宿主细胞的病毒-细胞膜融合而促进IBV进入细胞。此外,其确定了病毒毒株的组织和细胞向性。
术语“异源S(刺突蛋白)”是指已经导入4/91 IBV中的刺突蛋白或其片段来自与4/91 IBV不同的基因型或血清型。因此,异源刺突蛋白是非4/91基因型或血清型。
术语“蛋白质”、“氨基酸”和“多肽”可互换使用。术语“蛋白质”是指由天然存在的氨基酸及其衍生物组成的氨基酸序列。天然存在的氨基酸为本领域熟知,在生物化学的标准教科书中进行了描述。在氨基酸序列内,氨基酸通过肽键连接。此外,将氨基酸序列的两个末端称为羧基末端(C-末端)和氨基末端(N-末端)。术语“蛋白质”包括基本上纯化的蛋白质或另外包含其它蛋白质的蛋白质制品。此外,该术语还涉及蛋白质片段。而且,其包括化学修饰的蛋白质。这种修饰可以是人工修饰或天然存在的修饰,例如磷酸化、糖基化、肉豆蔻基化等。
进一步地,本发明还提供了一种免疫原性组合物,其包含编码异源S(刺突)蛋白或其片段的4/91 IBV(传染性支气管炎病毒)。
此外,本发明还提供了包含本文所述的IBV(传染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物。进一步地,本发明还提供了一种免疫原性组合物,其包含编码异源S(刺突)蛋白或其片段的4/91 IBV(传染性支气管炎病毒)。
术语“免疫原性组合物”是指包含至少一种抗原的组合物,其在给予所述免疫原性组合物的宿主体内引发免疫应答。这种免疫应答可以是对本发明的免疫原性组合物的细胞和/或抗体介导的免疫应答。优选地,所述免疫原性组合物诱导免疫应答,更优选地赋予针对IBV感染的一种或多种临床体征的保护性免疫。宿主也称作“对象”。优选地,本文描述或提及的任何宿主或对象是禽类或家禽。
通常,“免疫应答”包括但不限于以下一种或多种作用:特异性针对本发明免疫原性组合物中包含的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γ-δT细胞的产生或激活。优选地,宿主将显示保护性免疫应答或治疗反应。
“保护性免疫应答”或“保护性免疫”通过感染的宿主通常表现出的临床体征减少或消失、感染的宿主较快的康复时间和/或感染持续时间缩短或者组织或体液或排泄物中病原体效价降低而证实。
如果在宿主表现出保护性免疫应答,由此对新感染的抵抗力增强和/或疾病的临床严重性降低,则将免疫原性组合物描述为“疫苗”。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV具有如KF377577所示的核苷酸序列(SEQ ID NO:53)或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV具有如SEQID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
术语“核酸”或“核酸序列”或“核苷酸序列”是指包括DNA分子、RNA分子、cDNA 分子或衍生物的多核苷酸。该术语涵盖单链和双链多核苷酸。本发明的核酸包括分离的多核苷酸(即分离自其自然环境)和遗传修饰的形式。此外,还包括化学修饰的多核苷酸,包括天然存在的修饰的多核苷酸,例如糖基化或甲基化的多核苷酸,或人工修饰的多核苷酸,例如生物素化的多核苷酸。此外,术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用,是指任何核酸。术语“核酸”和“多核苷酸”也具体包括由除了五个生物学存在的碱基(腺嘌呤,鸟嘌呤,胸腺嘧啶,胞嘧啶和尿嘧啶)之外的碱基组成的核酸。
术语“RNA”是指任何核糖核酸。该术语涵盖单链和双链RNA。本发明的RNA包括分离的RNA(即分离自其自然环境)和遗传修饰的形式。此外,还包括化学修饰的RNA,包括天然存在的修饰的RNA,例如甲基化RNA,或人工修饰的RNA,例如生物素化的 RNA。术语“RNA”也具体包括由除了四个生物学存在的核苷酸/碱基(腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶和尿嘧啶)之外的碱基组成的RNA。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV毒株具有刺突(S)蛋白,所述刺突蛋白具有如AGY56140所示氨基酸序列(SEQ ID NO:54)或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、 99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV毒株具有刺突(S1)蛋白,所述刺突蛋白S1具有如AF093793所示氨基酸序列(SEQ ID NO:60)或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、 99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV毒株具有刺突(S1)蛋白,所述刺突蛋白S1具有如EU914938所示氨基酸序列(SEQ ID NO:55)或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、 99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV毒株具有刺突(S1)蛋白,所述刺突蛋白S1具有如KM067900所示氨基酸序列(SEQ ID NO:56)或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、 99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
必须理解,所述刺突蛋白序列或核酸可用于确定任何IBV毒株是否源于4/91。但是,由于将4/91 IBV用作骨架,并且4/91刺突蛋白或核酸序列由异源刺突蛋白或其片段置换,因此具有异源刺突蛋白的最终IBV不包含任何4/91刺突蛋白或仅剩余一部分4/91 刺突蛋白。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV毒株具有刺突(S)蛋白,所述刺突蛋白具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、 99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV毒株具有核壳(N)蛋白,所述核壳蛋白具有如EU780081所示氨基酸序列(SEQ ID NO:57)或与上述序列至少之一具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、 99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV毒株具有核壳(N)蛋白,所述核壳蛋白具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或与其具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV毒株具有包膜(E)蛋白,所述包膜蛋白具有如AGY56143所示氨基酸序列(SEQ ID NO:58)或与其具有至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、 99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV毒株具有包膜(E)蛋白,所述包膜蛋白具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或与其具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV毒株具有膜糖蛋白(M),所述膜糖蛋白具有如AGY56144所示氨基酸序列(SEQ ID NO:59)或与其具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV毒株具有膜糖蛋白(M),所述膜糖蛋白具有如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或与其具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
术语“相同性”或“序列相同性”为本领域已知,是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系,即参考序列和待与参考序列进行比较的指定序列之间的关系。在将指定序列与参考序列进行最佳比对以产生最高程度的序列相似性后,通过序列比较确定序列相同性,通过序列字符串之间的匹配而确定。基于这种比对,可以在逐个位置的基础上确定序列相同性,例如如果在某位置上核苷酸或氨基酸残基是相同的,则在该特定位置所述序列是“相同的”。将这种位置相同性的总数除以参考序列中核苷酸或残基的总数,以得出序列相同性百分比。序列相同性可以通过已知方法容易地计算,所述方法包括但不限于在Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.,ed.,Oxford UniversityPress,New York(1988),Biocomputing:Informatics和Genome Projects,Smith, D.W.,ed.,Academic Press,New York(1993);Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey(1994);SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987);SequenceAnalysis Primer, Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York(1991);及Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中描述的那些方法,所述教导通过引用并入本文。确定序列相同性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。确定序列相同性的方法编撰在确定指定序列之间的序列相同性的可公开获得的计算机程序中。这种程序的示例包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.,etal.,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.et al.,J.Molec. Biol.,215:403-410(1990))。BLASTX程序可公开得自NCBI和其它来源(BLAST Manual, Altschul,S.et al.,NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894,Altschul,S.F.et al.,J.Molec. Biol.,215:403-410(1990),所述教导通过引用并入本文)。这些程序使用默认的缺口权重以最佳比对序列,以在指定序列和参考序列之间产生最高水平的序列相同性。例如,多核苷酸具有与参考核苷酸序列具有至少例如85%、优选90%、甚至更优选95%“序列相同性”的核苷酸序列,是指指定的多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同,除了指定的多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸的至多15个、优选至多10个、甚至更优选至多5个点突变之外。换句话说,在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85%、优选90%、甚至更优选95%相同性的核苷酸序列的多核苷酸中,参考核苷酸序列中至多15%、优选10%、甚至更优选5%的核苷酸可以缺失或被另一核苷酸取代,或者参考序列中全部核苷酸的至多15%、优选10%、甚至更优选5%的核苷酸可以插入参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的任何位置,散布在参考序列中各个核苷酸之间,或者在参考序列内的一个或多个连续基团中。类似地,具有与参考氨基酸序列具有至少例如85%、优选90%、甚至更优选95%序列相同性的氨基酸序列的多肽,是指指定的多肽的氨基酸序列与参考序列相同,除了指定的多肽序列可包括参考氨基酸酸序列的每100个氨基酸的至多15个、优选至多10个、甚至更优选至多5个氨基酸改变之外。换句话说,为了获得与参考氨基酸序列具有至少85%、优选90%、甚至更优选95%序列相同性的指定多肽序列,参考序列中至多15%、优选至多10%、甚至更优选至多5%的氨基酸残基可以缺失或被另一氨基酸取代,或者参考序列中全部氨基酸数目的至多15%、优选至多10%、甚至更优选至多5%的氨基酸可以插入参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置之间的任何位置,散布在参考序列中各个残基之间,或者在参考序列内的一个或多个连续基团中。优选地,不相同的残基位置的保守氨基酸取代不同。但是,在确定序列相同性时不包括保守取代作为匹配项。
术语“相同性”、“序列相同性”和“相同性百分比”在本文可互换使用。为了本发明的目的,在此定义了为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性百分比,将序列为最佳比较目的进行比对(例如,可以在第一个氨基酸序列或核酸中导入缺口以与第二个氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后比较相应氨基酸或核苷酸位置上的氨基酸或核苷酸残基。当第一序列中的位置由与第二个序列中相应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时,则分子在该位置是相同的。两个序列之间的相同性百分比是序列共享的相同位置数目的函数(即相同性%=相同位置数目/位置总数(即重叠位置)×100)。优选地,两个序列具有相同的长度。
可以在所比较的两个序列的全长上或在两个序列的片段上进行序列比较。通常,在比较的两个序列的全长上进行比较。然而,序列相同性可以在例如20、50、100或更多个连续的氨基酸残基的区域进行比较。
技术人员将意识到可利用不同的计算机程序确定两个序列之间的同源性。例如,可以使用数学算法来完成序列的比较和两个序列之间的相同性百分比的确定。在一个优选的实施方案中,使用如下算法确定两个氨基酸或核酸序列之间的相同性百分比:Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法,所述算法已经并入Accelrys GCG软件包中的GAP程序(可得自http://www.accelrys.com/products/gcg/),使用 Blosum 62矩阵或PAM250矩阵,缺口权重为16、14、12、10、8、6或4,长度权重为 1、2、3、4、5或6。技术人员将理解,当使用不同的算法时,所有这些不同的参数会产生略有不同的结果,但是两个序列的总体相同性百分比不会显著改变。
本发明的蛋白质序列或核酸序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索,例如以鉴别其它家族成员或相关序列。这种搜索可以使用BLASTN和BLASTP 程序(version 2.0)进行,所述程序如Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10所述。可以使用BLASTP程序进行BLAST蛋白质搜索,得分=50,字长=3,以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对,可以使用Gapped BLAST程序,如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402所述。当使用 BLAST和Gapped BLAST程序时,可以使用各个程序(例如BLASTP和BLASTN)的默认参数。见NationalCenter for Biotechnology Information主页 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
如本文所用,应特别理解术语“与SEQ ID NO:X的序列相同”等同于术语“在SEQ IDNO:X的长度与SEQ ID NO:X的序列相同”或者与术语“在SEQ ID NO:X的序列全长与 SEQ IDNO:X相同”。在本文中,“X”是选自1-61的任何整数,由此“SEQ ID NO:X”表示本文提及的任何SEQ ID NO。
根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,4/91 IBV选自如下一组毒株:Spain/98/328、Spain/92/35、IR-3654-VM、FR-CR88061-88、FR-85131-85、 UK-1233-95、UK/3/91、Spain/00/336、UK/4/91、UK/7/91、UK/793B/91、4/91-致病性、4/91减毒、IB4-91和CR88。
IBV毒株
IBV毒株可以通过血清型和基因型分类。血清型分类涉及用中和抗体处理病毒,而基因型分类通常涉及检验S1(刺突)蛋白的序列。然而,本领域技术人员熟知不同的IBV 毒株。传染性支气管炎病毒最早于1930年代在美国发现。
第一个IBV血清型是在马萨诸塞(Massachusetts)鉴别的,直到1956年发现一种不同的IBV血清型之前,其一直是唯一的血清型。如今,除最初鉴别的Massachusetts型之外,在美国还确定了其它几种血清型,包括阿肯色(Arkansas)和特拉华(Delaware)。现今 IBVMass病毒可以在世界许多国家鉴别。
IBV毒株Beaudette是Massachusetts型,是在鸡胚中至少传代150代而产生的。IBV毒株Beaudette最初是由Beaudette和Hudson分离(J.Am.Vet.Med.A.90,51-60,1937),并在鸡胚中传代。除了Beaudette之外的其它Massachusetts型IBV毒株是H120、H52 和M41。H120毒株传代120代。
IBV QX被描述为IBV的毒性地方分离株,最初是在中国分离的。但是,该病毒已传播到欧洲,并已在西欧部分地区发现,主要在荷兰,但在德国、法国、比利时、丹麦和英国也已发现。另外,QX基因型或血清型已经在亚洲和非洲的一些国家中描述。
在1990年代后期,在意大利分离出了命名为“Italien-02”或“Italy-02”的毒株。这些分离株之一的序列分析发表于2002年(NCBI-BLAST,编号AJ457137)。然而,研究表明,这种Italian-02毒株在欧洲很普遍,除IBV变异株4/91以外,其已成为在英国、西班牙、法国和荷兰最主要的基因型之一。
自1996年以来,称为Q1的一种新的传染性支气管炎病毒(IBV)基因型在中国流行,并于2011年在意大利首次报道。Q1与增加的死亡率、肾脏病变和腺胃炎有关。
此外,在欧洲也鉴定出了毒株D274、B1648/D8880、D1466、V1397和Arkansas。
如何获得任何IBV毒株是本领域技术人员的常识。IBV毒株可以商购,得自科研机构,也可以将基因组合成为互补DNA,因为已经对IBV毒株进行了测序并且已经公布了序列,因此可以使用。此外,可以从野外分离出IBV毒株。分离IBV毒株和鉴定IBV 毒株的方法为本领域技术人员熟知。Valter Leonardo de Quadros 2011(Dissertation,Das
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源刺突蛋白是非4/91基因型或血清型。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S蛋白或其片段来自具有选自以下一组的基因型或血清型的IBV:Arkansas(例如Arkansas 99),Brazil(例如 BR-1,BR-2,23/2013,IBV/Brasil/351/1984),California(例如California1734/04,California99),Connecticut,Delaware(例如Delaware 98),Dutch(例如D207,D212,D274,D3128,D3896,D8880,D1466),Florida,Georgia(例如Georgia GA-07,GA-08,GA-12, GA-13),Gray,Holte,Iowa(例如Iowa 97和Iowa 69),Italy(例如Italy 02),JMK,LDT3, Maine(例如Maine 209),Massachusetts(M41,H52,H120),Pennsylvania(例如 Pennsylvania1220/98,Pennsylvania Wolg/98),PL84084,Qu(例如Qu-mv),QX(例如 GB341/96),Q1,SE17和变体2(例如IS/1494/06,IBV/Ck/EG/CU/4/2014, gammaCoV/Ck/Poland/G052/2016)。
根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S蛋白或其片段来自选自如下基因型或血清型的IBV:Massachusetts,QX,Q1,Italy 02,Arkansas,Conneticut,Georgia,LDT3,PL84084,变体2和Brazil。
根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S蛋白或其片段来自选自如下基因型或血清型的IBV:Massachusetts,QX,Q1,Arkansas,变体2和Brazil。
根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,Massachusetts毒株选自如下一组:H120,H52,Spain/98/308,IBMA5-1,SD/97/01,Spain/96/334,M41-M21883。
根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,QX毒株选自如下一组:FR-L1450T-05,FR-L1450L-05,NL-L1449T-04,NL-L1449K-04,IBV/Ck/SP/170/09, IBV/Ck/SP/79/08,IBV/Ck/SP/248/09,HBN,IBVQX,LX4,BJQ,CK/CH/LGD/03和 GB341/96。
根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,Q1毒株选自如下一组:CK/CH/LDL/98I,CK/CH/LSD/08-10,J2,Q1,AR08ER22,AR08BA21和Chile-295- 10。
根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,Arkansas毒株选自如下一组:Ark99,ArkGA,ArkDPI,AL/5364/00,ARKDPI11,AL/0803/01,AL/7149/00, ArkDPI101,AL/1221/01,AL/1793/01和AL/4614/98。
根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,变体2毒株选自如下一组: IS/1494/06,IBV/Ck/EG/CU/4/2014,gammaCoV/Ck/Poland/G052/2016,Eg/ CLEVB-2/IBV/012,D1344/2/4/10_EG,TR8和IB VAR2-06。
根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,Brazil毒株选自如下一组: BR-1,BR-2,23/2013和IBV/Brasil/351/1984。
根据本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S蛋白或其片段来自Massachusetts基因型或血清型。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S蛋白或其片段来自Massachusetts基因型或血清型,其与SEQ ID NO:6或7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、 99.9%、99.95%、99.98%或99.99%序列相同性。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S蛋白或其片段来自QX基因型或血清型,其与SEQ ID NO:8或9具有至少90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、 99.95%、99.98%或99.99%序列相同性。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S蛋白或其片段来自Q1基因型或血清型,其与SEQ ID NO:10或11具有至少90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、 99.95%、99.98%或99.99%序列相同性。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S蛋白或其片段来自Arkansas基因型或血清型,其与SEQ ID NO:12或13具有至少90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、 99.95%、99.98%或99.99%序列相同性。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S蛋白或其片段来自变体2基因型或血清型,其与SEQ ID NO:14或15具有至少90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、 99.95%、99.98%或99.99%序列相同性。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S蛋白或其片段来自Brazil基因型或血清型,其与SEQ ID NO:16或17具有至少90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、 99.95%、99.98%或99.99%序列相同性。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S蛋白或其片段选自SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S蛋白是全长刺突蛋白。
本发明的实验数据表明可以使用全长刺突蛋白序列。然而,众所周知,也可以使用刺突蛋白序列的片段以及如刺突蛋白的胞外域。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S(刺突)蛋白的片段的长度为至少500、750、1000或1075个氨基酸。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S(刺突)蛋白的片段的长度为从N末端的至少500、750、1000或1075个氨基酸。
术语“N末端”为本领域技术人员熟知。N末端也称作氨基末端、NH2-末端、N-末端或胺末端。当从信使RNA翻译蛋白质时,其是从N末端至C末端产生的。因此,N末端是包含所述胺基(-NH2)的氨基酸链(蛋白质或多肽)的起点。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S(刺突)蛋白的片段的长度为至少1000个氨基酸。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S(刺突)蛋白的片段是刺突蛋白的胞外域。
术语“胞外域”为本领域技术人员熟知。刺突蛋白包含不同的功能部分,即信号序列、胞外域、跨膜结构域和胞内域(从N端到C端)。因此,在切割信号序列后,刺突蛋白的 N-末端始于胞外域。IBV刺突蛋白胞外域的长度约为1075个氨基酸,取决于IBV毒株在长度上相差几个氨基酸。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,其中所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换同源S蛋白或其片段。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,其中所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换天然存在的S蛋白或其片段。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,其中所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换4/91 IBV中的S蛋白或其片段。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,IBV是减毒的。
术语“减毒的”是指与野生型分离株相比具有降低的毒性的病原体。在本发明中,减毒的IBV是其中毒性已降低从而不引起IBV感染的临床体征但能够在靶动物中诱导免疫应答的毒株,但也可指与未减毒IBV感染或未接受减毒病毒的“对照组”动物相比,减毒IBV感染的动物中临床体征的发生或严重度降低。在本文中,术语“减少/降低”是指与如上所定义的未减毒的IBV感染的对照组相比,减少至少10%、优选25%、甚至更优选50%、再更优选60%、甚至更优选70%、再更优选80%、甚至更优选90%、甚至更优选95%、最优选100%。因此,减毒的IBV毒株是适合掺入包含修饰的活IBV的免疫原性组合物中的毒株。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,IBV是灭活的。
任何常规的灭活方法都可用于本发明的目的。因此,可以通过本领域技术人员已知的化学和/或物理处理方法进行灭活。优选的灭活方法包括加入环化的二乙烯亚胺(BEI),包括加入已被环化成二乙烯亚胺(BEI)的2-溴乙烯胺氢溴酸盐(BEA)溶液。优选的其它化学灭活剂包括但不限于Triton X-100,脱氧胆酸钠,十六烷基三甲基溴化铵,β-丙内酯,硫柳汞,苯酚和甲醛(福尔马林)。但是,灭活也可以包括中和步骤。优选的中和剂包括但不限于硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠等。
优选的福尔马林灭活条件包括福尔马林浓度为约0.02%(v/v)–2.0%(v/v),更优选为约0.1%(v/v)–1.0%(v)/v),还更优选约0.15%(v/v)–0.8%(v/v),甚至更优选约0.16%(v/v)– 0.6%(v)/v),最优选的是约0.2%(v/v)-0.4%(v/v)。温育时间取决于IBV的抗性。通常,进行灭活程序直至在合适的培养系统中检测到无IBV生长。
优选地,本发明的灭活IBV是福尔马林灭活的,优选地使用本文上述浓度。
可使用已知技术将本发明的灭活IBV掺入脂质体中,例如Nature 1974,252,252-254 或Journal of Immunology,1978,120,1109-13中所述。在本发明的另一个实施方案中,本发明的灭活IBV可以与合适的生物化合物例如多糖、肽、蛋白质等或其组合缀合。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,IBV是遗传工程化的。
术语“遗传工程化的”是指已经通过使用“反向遗传学”方法突变的IBV。优选地,本发明的IBV已经进行遗传工程化。反向遗传学技术涉及制备合成的重组病毒RNA。然而,“反向遗传学”技术为本领域技术人员熟知。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,IBV是重组IBV。
如本文所用,术语“重组”涉及RNA基因组(或RNA序列,cDNA序列或蛋白质),其具有不是相应RNA基因组(或RNA序列,cDNA序列或蛋白质)天然存在的任何修饰。例如,如果RNA基因组(或RNA序列,cDNA序列或蛋白质)包含例如通过人为干预人工导入的插入、缺失、倒位、重定位或点突变,则认为其是“重组的”。因此,RNA基因组序列(或RNA序列,cDNA序列或蛋白质)与与其自然相关的全部或部分序列(或RNA 序列,cDNA序列或蛋白质)不相关。关于病毒使用的术语“重组”是指通过人工操作病毒基因组产生的病毒。术语“重组病毒”包括遗传修饰的病毒。
在本发明的IBV或免疫原性组合物的另一个具体方面,IBV是嵌合的。
术语“嵌合的”是指包含来自另一冠状病毒、优选来自另一IBV毒株的一个或多个核苷酸序列的IBV。例如,编码异源S(刺突)蛋白或其片段的IBV 4/91是嵌合IBV。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面,所述免疫原性组合物是疫苗。术语“疫苗”已经在本文别处进行了描述。然而,如果宿主表现出保护性免疫应答,由此对新感染的抵抗力增强和/或疾病的临床严重性降低,则将免疫原性组合物描述为“疫苗”。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面,所述免疫原性组合物包含药学可接受的载体。
术语“药学可接受的载体”包括任何及所有的溶剂、分散介质、包被剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂、佐剂、免疫刺激剂及其组合。
“稀释剂”可以包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐等。
在本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面,药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。
优选地,免疫原性组合物还包含蔗糖明胶稳定剂。
优选地,所述药学可接受的载体是壳聚糖。
壳聚糖是一种来自甲壳动物(如虾、蟹)、昆虫和其他无脊椎动物体内甲壳素的天然脱乙酰多糖。最近,Rauw等人在2009年(Vet Immunol Immunop 134:249-258)证明壳聚糖增强了新城疫活疫苗的细胞免疫反应,促进了其保护作用。此外,Wang等人,2012 年(ArchVirol(2012)157:1451-1461)显示了壳聚糖作为佐剂用于减毒活体流感疫苗潜力的结果。
优选地,免疫原性组合物可以进一步包括一种或多种其他免疫调节剂,例如白细胞介素、干扰素或其他细胞因子。在本发明范围内有用的佐剂和添加剂的数量和浓度可以由熟练的技术人员容易地确定。
在某些方面,本发明的免疫原性组合物含有佐剂。本文所用的"佐剂"可包括氢氧化铝和磷酸铝,皂苷例如Quil A、QS-21(剑桥生物技术公司,Massachusetts剑桥)、 GPI-0100(药物制剂股份有限公司,亚拉巴马州伯明翰),油包水乳液,水包油乳液,水包油包水乳液。该乳液尤其可基于轻质液体石蜡油(欧洲药典型);类异戊二烯油,如角鲨烷或角鲨烯;由烯类,特别是异丁烯或癸烯的低聚物产生的油。含有直链烷基的酸或醇的酯,特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯) 或丙二醇二油酸酯。支链脂肪酸或醇的酯,特别是异硬脂酸酯。该油与乳化剂结合使用,形成乳状液。乳化剂最好是非离子表面活性剂,特别是山梨糖醇、甘露糖醇(如脱水甘露醇油酸酯)、乙二醇、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯,它们可以选择性地乙氧基化,以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段,特别是Pluronic 产品,特别是L121。参见Hunter等人,《佐剂的理论和实际应用》(埃德·斯图尔特-图尔, D.E.S.),约翰·威利父子出版公司,农业行业标准,第51-94页(1995年)和托德等,《疫苗15:564-570》(1997年)。典型的佐剂是《疫苗设计,亚单位和佐剂方法》第147页中描述的SPT乳液,编辑者是M.Powell和M.Newman,普莱南出版社,1995年,以及同一本书第183页中描述的MF59乳液。
佐剂的另一个实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物,特别是与糖类或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。这些化合物被称为卡波姆 (carbomer)(Phameuropa卷8,第二期,1996年6月)。本领域的技术人员还可以参考美国专利第2,909,462号,该专利描述了此类丙烯酸聚合物与具有至少3个羟基,最好不超过8个羟基的多羟基化合物交联,至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基取代。优选的基团是那些含有2至4个碳原子的基团,例如乙烯基、烯丙基和其他乙烯基不饱和基团。不饱和基团本身可以含有其他取代基,如甲基。以卡波普 (Carbopol)为名销售的产品(BFGoodrich,美国俄亥俄州)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中,可以提及卡波普974P、934P和971P。最常用的是卡波普971P。在马来酸酐和烯基衍生物的共聚物中,有共聚物EMA(孟山都公司),其是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物溶解于水产生酸性溶液,其将被中和,优选中和至生理pH,以便制备将要掺入免疫原性、免疫学或疫苗组合物的佐剂溶液。
进一步合适的佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(RIBI公司)、Block共聚物(CytRx,亚特兰大乔治亚州)、SAF-M(Chiron,加利福尼亚州埃梅里维尔)、单磷酸脂质A、Avridine脂质胺佐剂、来自大肠杆菌(重组或其他形式)的热不稳定内毒素,霍乱毒素,IMS 1314 或鼠酰胺基二肽,或天然存在的或重组的细胞因子或其类似物,或内源性细胞因子释放的刺激物,等等。
预计佐剂的添加量为每剂约100微克至约10毫克,优选为每剂约100微克至约10毫克,更优选为每剂约500微克至约5毫克,甚至更优选为每剂约750微克至约2.5毫克,最优选为每剂约1毫克。另外,佐剂的浓度按最终产品的体积计算可以是约0.01 至50%,优选约2%至30%,更优选约5%至25%,更优选约7%至22%,最优选浓度为 10%至20%。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一具体方面,免疫原性组合物在有需要的对象中有效治疗和/或预防由IBV引起的临床体征。术语"治疗和/或预防"、"临床症状"和"有需要"已在其他地方定义。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一具体方面中,免疫原性组合物保护免受异源刺突蛋白的基因型或血清型的IBV毒株的攻击。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一特定方面中,免疫原性组合物保护免受Massachusetts、QX、Q1、Arkansas、变体2或Brazil基因型毒株的攻击。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面,所述免疫原性组合物保护免受 Massachusetts基因型毒株的攻击。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面,所述免疫原性组合物被配制为用于单剂施用。
单剂的体积已在本文其他地方定义。
此外,已经表明,在给予这种单剂的本发明免疫组合物后,一个剂量的本发明免疫组合物是有效的。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面,该免疫原性组合物经皮下、肌内、口服、卵内、通过喷雾、通过饮用水或通过滴眼剂施用。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面,所述免疫原性组合物包括每剂 1至10log
在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面,所述免疫原性组合物包括每剂 2至5log
在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面,所述免疫原性组合物包括每剂 2至4log
试剂盒
如果需要,组合物可以存在于包装或配药装置中,所述包装或配药装置包含一个或多个包含活性成份的单位剂型。例如,包装可以包含金属或塑料箔,例如泡罩包装。包装或分配器装置可附有施用说明书,优选地用于给对象,尤其是家禽施用。与这类容器有关的可以是一须知,它按管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构的规定的形式撰写,该须知反映了管理机构对人体用药的制备、使用或销售的许可。
因此,本发明提供了一种包含本文所述的IBV或免疫原性组合物的试剂盒。
在根据本发明的试剂盒的一个具体方面,该试剂盒还包含用于治疗和/或预防禽类疾病的说明书。
在根据本发明的试剂盒的一个具体方面,试剂盒还包括治疗和/或预防家禽疾病的说明书。
在根据本发明的试剂盒的一个具体方面中,试剂盒还包括用于治疗和/或预防IB(传染性支气管炎)的说明书。
此外,本发明提供了用于免疫对象的方法,包括向该对象施用如本文所述的免疫原性组合物。
术语“免疫”是指通过向待免疫的对象施用免疫原性组合物进行主动免疫,从而引起针对包含在这种免疫原性组合物中的抗原的免疫应答。
优选地,免疫导致群体中特定IBV感染的发生率降低或由特定IBV感染引起或与之相关的临床体征严重程度的降低。
此外,用本文提供的免疫原性组合物对有需要的对象进行免疫,结果是防止对象被 IBV感染。甚至更理想的是,免疫的结果是对IBV感染产生有效的、持久的免疫应答。可以理解,所述时间段将持续超过1个月,优选超过2个月,优选超过3个月,更优选超过4个月,更优选超过5个月,更优选超过6个月。应该理解的是,免疫不一定对所有被免疫的对象都有效。然而,该术语要求群体的很大一部分对象被有效免疫。
优选地,在这种情况下设想一群对象,其通常将产生通常由IBV感染引起或与IBV感染相关的临床体征,即未经免疫。该群体的对象是否被有效免疫可以由本领域技术人员进一步确定。优选地,与未免疫或用本发明之前可获得的免疫原性组合物免疫但随后被特定IBV感染的对象相比,如果某一群体的至少33%、至少50%、至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、更优选至少95%、最优选100%的对象的临床体征在发生率或严重程度上减少了至少10%,更优选至少20%,更优选至少30%,甚至更优选至少 40%,更优选至少50%,甚至更优选至少60%,更优选至少70%,更优选至少80%,更优选至少90%,更优选至少95%,且最优选100%,则该免疫应有效。。
此外,本发明提供了在有需要的对象中治疗或预防由IBV引起的临床体征的方法,该方法包括向对象施用治疗有效量的如本文所述的免疫原性组合物。
术语"治疗或预防"是指减少群体中特定IBV感染的发生率,或减少由特定IBV感染引起或与之相关的临床体征的严重程度。因此,“治疗或预防”一词也指接受有效量的本文提供的免疫原性组合物的一组对象,与未接受这种免疫原性组合物的一组对象相比,减少群体中感染特定IBV的对象数量(=减少特定IBV感染的发生率),或减轻通常与IBV 感染相关或由IBV感染引起的临床体征的严重性,或减少特定IBV感染后的病毒脱落,或防止或减少产蛋母鸡在感染特定IBV后的减蛋。
“治疗或预防”通常涉及将有效量的本发明的免疫原性组合物给有需要或可受益于这种治疗/预防的对象或对象群体施用。术语“治疗”指一旦对象或该群体的至少一些对象已经感染了这种IBV并且其中这些对象已经显示由这种IBV感染引起或与之相关的一些临床体征,施用有效量的免疫原性组合物。术语"预防"是指在对象感染IBV之前,或至少在该对象或一组对象中没有任何对象显示由该IBV感染引起或与之相关的任何临床体征的情况下,给对象进行施用。术语“预防”和“防止”在本申请中可互换使用。
如本文所用,术语“有效量”是指但不限于在对象中引发或能够引发免疫应答的抗原量。这样的有效量能够减少群体中特定IBV感染的发生率或降低特定IBV感染的临床体征的严重性。
优选的是,与未接受治疗或接受本发明之前可用的免疫原性组合物治疗但随后被特定IBV感染的对象相比,临床症状的发生率或严重程度至少减少10%,更优选至少20%,更优选至少30%,甚至更优选至少40%,更优选至少50%,甚至更优选至少60%,更优选至少70%,更优选至少80%,更优选至少90%,更优选至少95%,最优选100%。
本文所使用的术语“临床体征”是指对象感染IBV的体征。感染的临床体征取决于所选择的病原体。这种临床体征的例子包括但不限于呼吸窘迫、肾炎、输卵管炎(salphingitis)、产蛋异常、羽毛蓬乱、抑郁、生长率下降和食欲下降。呼吸窘迫的体征包括呼吸体征,包括气喘,咳嗽,打喷嚏,气管罗音,鼻和眼分泌物,气管病变和气管内的纤毛停滞 (ciliostasis)。肾炎的迹象包括肾脏病变和水样腹泻。产蛋异常的迹象包括减蛋、蛋的尺寸较小、蛋壳较差、蛋的内部质量下降、蛋的蛋白较薄以及输卵管内的纤毛停滞。但是,临床体征还包括但不限于可直接从活体动物观察到的临床体征。可从活体动物上直接观察到的临床体征的例子包括鼻腔和眼部分泌物、咳嗽、气喘、打喷嚏、气管啰音、褶皱的羽毛、结膜炎、体重降低、生长率下降、食欲下降、脱水、水样腹泻、跛行、昏睡、消瘦和不爱动等等。
优选的是,与未接受治疗或接受本发明之前可用的免疫原性组合物治疗但随后被特定IBV感染的对象相比,接受治疗的对象的临床症状在发生率或严重程度上减轻指的是纤毛停滞的减轻、罗音的减轻、落蛋的减轻、肾脏病变的减轻、水样腹泻的减轻、减少体重降低、病毒载量降低、病毒脱落减少,或其组合。
本文所使用的术语"需要"或"有需要的"是指给施用/治疗与加强或改善健康或临床体征或对接受本发明的免疫原性组合物的对象的健康有任何其他积极的医药作用有关。
术语"减少"或"减少"或"减轻或"降低"在本申请中可以互换使用。术语"减少"是指,与未接受治疗(未免疫)但随后被特定IBV感染的对象相比,临床体征减少至少10%,更优选至少20%,更优选至少30%,甚至更优选至少40%,更优选至少50%,甚至更优选至少60%,更优选至少70%,更优选至少80%,更优选至少90%,更优选至少95%,最优选100%。
此外,与相同物种的未免疫对照组的对象相比,本发明提供了在需要的对象中减少纤毛停滞的方法,该方法包括向对象施用治疗有效量的如本文所述的免疫原性组合物。
如实施例所示,本文提供的免疫原性组合物已被证明在减少纤毛停滞方面是有效的。
术语“纤毛停滞”是指纤毛在气管中的运动减少。因此,可以通过检查气管环的内层以确定纤毛的运动来确定纤毛停滞。如何确定气管内纤毛的运动,是本领域技术人员的一般知识。
优选地,与相同物种的未免疫对照组的对象相比,从攻击或感染后的第10天开始,更优选地从攻击或感染后的第5天开始,更优选地从攻击或感染后的第4天开始,更优选地,从攻击或感染后的第3天开始,并且最优选地,在用IBV攻击或感染后的第1 天或第2天开始,纤毛的运动不减少。
术语“纤毛停滞减少”是指与相同物种的未免疫对照组的对象相比,纤毛停滞减少至少10%,优选至少20%,更优选至少30%,甚至更优选至少40%,甚至更优选至少50%,甚至更优选至少60%,甚至更优选至少70%,甚至更优选至少80%,甚至更优选至少 90%,甚至更优选至少95%,最优选100%。如何测量纤毛停滞的降低,是本领域技术人员的一般知识。
在本发明的一个方面,所述对象是禽类(avian)。
术语“禽类”对于本领域技术人员是众所周知的。术语“禽类”包括所有鸟类,包括家禽。
在本发明的一个方面,所述对象是家禽(poultry)。
术语“家禽”对于本领域技术人员是众所周知的。术语“家禽”包括鸡(chicken),火鸡 (turkey),鹌鹑(quail),野鸡(pheasant),珍珠鸡(guineafowl),鹅(goose)和鸭(duck)。此外, "鸡"一词包括肉鸡、产蛋鸡,和两者的繁殖鸡,也被称为种鸡。
在本发明的一个方面,所述对象选自鸡,火鸡,鹌鹑或野鸡。
在本发明的一个方面,所述对象是鸡。
在本发明的一个方面,免疫原性组合物施用一次。
理解单剂为仅施用一次。如实施例所示,本文提供的免疫原性组合物已被证明在给有需要的对象施用单剂后具有疗效。
每只家禽的剂量体积取决于接种途径和家禽的年龄。
通常,在任何年龄,滴眼剂疫苗以每剂1至100μl的体积施用。优选地,滴眼剂疫苗的单剂的总体积在约5μl至70μl之间,更优选的是在约20μl至50μl之间,优选单剂 20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、45μl或50μl。优选的是,滴眼剂疫苗的单剂总体积在约5μl至70μl之间,更优选的是在约20μl至50μl之间,优选单剂20μl、25μl、30μl、 35μl、40μl、45μl或50μl。
对于日龄家禽,喷雾疫苗可包含25至1000μl的剂量体积。优选地,喷雾疫苗的单剂总体积在约50μl至5000μl之间,更优选在约75μl至2000μl之间,更优选在约100μl 至1000μl之间,甚至更优选在约200μl至900μl之间,更优选地,在约300μl和800μl 之间,甚至更优选在约400μl和700μl之间,优选单剂400μl,425μl,450μl,475μl,500μl, 525μl,550μl,575μl,600μl,625μl,650μl,675μl或700μl。最优选单剂的总体积为400μl、 450μl、500μl、550μl、600μl、650μl或700μl。
用于卵内接种的疫苗可以包含50至100μl,优选50μl的剂量体积。优选地,用于卵内疫苗的单剂的总体积为约10μl至250μl,更优选为约15μl至200μl,甚至更优选为约20μl至150μl,甚至更优选为约30μl。100μl,甚至更优选在约30μl至75μl之间,并且优选单剂30μl,35μl,40μl,45μl,50μl,55μl,60μl,65μl,70μl或75μl。最优选地,单剂的总体积为40μl,45μl,50μl,55μl或60μl。
用于肌肉内或皮下接种的疫苗或一剂饮用水疫苗可含有体积为30μl至1000μl的剂量。优选地,单剂的总体积在约30μl到1000μl之间,更优选在约50μl到500μl之间,更优选在约75μl到250μl之间,甚至更优选在约100μl到200μl之间,最优选单剂100μl、 110μl、120μl、125μl、130μl、135μl、140μl、145μl、150μl、160μl,170μl、175μl、180μl、 190μl,155μl或200μl。
在本发明的一个方面,免疫原性组合物以两个或多个剂量施用。
然而,免疫原性组合物可以以两个或更多个剂量施用,在施用第二剂量(加强剂)之前施用第一剂量。
在两次施用方案的优选方面中,第一和第二剂量的免疫原性组合物以相同的量施用。优选地,每个剂量为上述指定的优选量。除了第一和第二剂量方案外,替代实施方案还包括其他后续剂量。例如,可以在这些方面施用第三、第四或第五剂量。优选的是,随后的第三、第四和第五个剂量方案的施用量与第一剂量相同,并且各剂量之间的时间范围与上述第一和第二剂量之间的时间一致。
优选的是,疫苗的第一次施用是在三周龄内进行的,更优选的是在一周龄内进行,最优选的是在一天龄通过下述方法进行。第二次施用可在20周龄内,优选在16-18周龄内,更优选在6-12周龄内进行。示例性地,在1-10天龄时进行初始(第一)接种,并且在6-12或16-18周龄时使用活疫苗或灭活疫苗进行第二接种(增强)。更优选地,在一日龄时进行初始(第一)接种,并且在6-12周龄或16-18周龄时使用活疫苗或灭活疫苗进行第二接种(增强)。
在使用卵内疫苗的情况下,优选当胚胎在15到19天时进行第一次施用,优选在第17天、18天或19天,最优选在第18天。第二次施用可在出生后的前三周内进行,最好在出生后的前10天内进行。
在本发明的一个方面中,所述免疫原性组合物经皮下、肌肉内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或经由滴眼剂施用。
免疫原性组合物优选局部或全身施用。常规使用的合适施用途径是口服或肠外施用,例如鼻内、静脉内、皮内、经皮、肌肉内、腹腔内、皮下以及吸入、卵内、通过喷雾、通过饮用水或通过滴眼剂。然而,根据化合物的性质和作用方式,免疫原性组合物也可以通过其他途径施用。例如,这样的其他途径包括经皮、静脉、血管内、动脉内、鼻腔内、胸腔内、气管内、心内、腹腔内、腹膜内、髓内、腹膜外、直肠内和阴道内。然而,最优选地,免疫原性组合物经皮下,肌内,口服,卵内,通过喷雾,通过饮用水或通过滴眼剂施用。
活IBV疫苗优选通过滴眼剂,鼻内,肌内或皮下单独施用。
更优选地,使用大量施用方法,包括饮用水和气雾剂疫苗接种。还优选的是疫苗作为胚胎疫苗(所谓的卵内疫苗)的用途,如下文进一步描述。
例如,肉鸡可以在一日龄或1-3周龄时接种疫苗,特别是对于MDA水平高的肉鸡。产蛋鸡或繁殖鸡最初可在1-10日龄接种疫苗,并在7-12或16-18周龄用疫苗加强。
卵内施用
如上所述,本发明还提供了一种IBV疫苗,该疫苗可以通过卵内途径安全施用,同时能够诱发保护性免疫应答。卵内施用对于本领域技术人员是众所周知的,并且本领域技术人员可以不用费力就可以进行卵内施用。疫苗的卵内施用涉及将疫苗施用于包含在蛋中的禽胚胎(关于卵内疫苗接种的综述参见:Ricks等,兽医进展.495-515,1999)。疫苗可以被注射到鸡蛋的任何合适的隔间(如尿囊液、卵黄囊、羊膜、空气细胞或进入胚胎),如本领域所描述的(Sharma;Am.J.Vet.Res.45 1619-1623,1984)。优选地,疫苗在壳(气室)膜和绒膜尿囊膜下方施用。
优选地,将疫苗在胚胎发育的后期阶段,通常是在孵化期的最后四分之一,最好是孵化前3-4天,注射到胚胎卵中。最好是在胚胎15至19天大时进行,最好是在第17、 18或19天,最理想的是在第18天大时。随后,将接种过的胚卵转移到孵化器中进行孵化。卵内施用的过程可以使用现有技术中描述的机器人注射工艺进行自动化。
通常用于家禽孵化后疫苗接种的常规疫苗不能用于卵内疫苗接种,因为晚期胚胎对所检查的大多数疫苗病毒高度敏感。然而,国际专利申请WO 01/64244披露,IBV疫苗可以用于卵内施用,但必须以非常低的剂量应用。此外,Wakenell等人,1986(Am.J.Vet. Res.,47 933-938)公开了在组织培养物中传代IB疫苗病毒使该病毒对胚胎无致病性。
在本发明的一方面,所述免疫原性组合物通过滴眼剂施用。
通常,用于孵化后施用的活疫苗包括减毒IBV,其浓度为每剂10
用于卵内施用的活疫苗通常包含体积为50至100μl,优选50μl的10
优选地,本发明的免疫原性组合物包括本发明的IBV,其量为每剂约1至约10log
在本发明的一方面,该免疫原性组合物包含每剂1至10log
在本发明的一方面,该免疫原性组合物包含每剂2至5log
在本发明的一方面,所述免疫原性组合物包含每剂2-4log
在本发明的一个方面,免疫原性组合物在对象的一周龄内、三日龄内、两日龄内或一日龄内施用。
优选的是,待免疫的对象为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20或21日龄。更优选地,所述要免疫的对象是1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13或14日龄。最优选地,所述要被免疫的对象是1、2、3、 4、5、6或7日龄。
然而,必须理解的是,在对对象接种几天后,家禽的免疫系统确实需要几天才能建立针对IBV感染的免疫力。因此,最好是在对象出生后的头24小时内进行免疫接种。
在本发明的一个方面,免疫原性组合物是在对象出生后的第一天内施用。如实施例所示,本文提供的免疫组合物在给1日龄的家禽施用时已被证明是安全和有效的。
在本发明的一个方面,所述方法导致与相同物种的未处理对照组的对象相比,选自以下组的功效参数的改善:预防或减少纤毛停滞,预防或减少罗音,预防或减少减蛋,预防或减少肾脏病变,预防或减少水样腹泻,减少体重降低,病毒载量降低,病毒脱落减少或其组合。
术语"治疗和/或预防"已在其他地方定义,其中术语"预防"和"防止"或"避免"在本申请中可互换使用。此外,“脱落”一词也已在其他地方定义。
术语“减少”、"降低"、“减轻”或“变低”是指与同一物种的非免疫对照组的对象相比,功效参数(纤毛停滞,罗音,减蛋,肾脏病变,水样腹泻,体重降低,病毒载量,病毒脱落)减少至少10%,优选至少20%,更优选至少30%,甚至更优选至少40%,甚至更优选至少50%,甚至更优选至少60%,甚至更优选至少70%,甚至更优选至少80%,甚至更优选至少90%,甚至更优选至少95%并且最优选100%。如何测量功效参数的改善是本领域技术人员的常识。
术语“病毒载量”对于本领域技术人员是众所周知的。术语病毒载量可与本文的病毒滴度互换使用。病毒载量或病毒滴度是活性病毒感染严重程度的量度,并且可以通过本领域技术人员已知的方法确定。测定可以基于对病毒蛋白的检测,如通过抗体与病毒蛋白结合并进一步检测,或者,通过扩增方法如RT-PCR检测病毒RNA。通过核酸扩增方法监测血浆中与病毒相关的病毒RNA是一个广泛使用的参数,用于评估逆转录病毒疾病的状态和进展,并评估预防和治疗干预的有效性。举例来说,病毒载量或病毒滴度可以通过估计所涉及的体液中病毒的活体数量来计算,如每毫升血浆中的RNA拷贝数。
术语"纤毛停滞"对于该领域的技术人员来说是众所周知的。气管的表面覆盖着特殊的上皮细胞,内衬着众多的,活动的,呈毛状的结构,称为纤毛。术语“纤毛停滞”包括纤毛的减少或丧失和/或纤毛活性的丧失或部分丧失。本领域技术人员无需过度劳动即可确定纤毛停滞。
术语“罗音”对于本领域技术人员来说是众所周知的。然而,术语“罗音”包括气管罗音并且是指从支气管发出的声音。本领域技术人员可以无需过度劳动确定罗音。
术语“减蛋(egg drop)”对于该领域技术人员是众所周知的。术语“减蛋”包括产蛋量减少。
在本发明的一个方面,与相同物种的未治疗对照组的对象相比,治疗或预防导致纤毛停滞的预防或减少。
在本发明的一个方面,与相同物种的未治疗对照组的对象相比,治疗或预防导致肾脏病变的预防或减少。
在本发明的一个方面,与相同物种的未处理对照组的对象相比,治疗或预防导致减蛋的预防或减少。
本发明进一步提供了用于治疗用途的如本文所述的IBV或免疫原性组合物。
本发明进一步提供了用作免疫原或疫苗的如本文所述的IBV或免疫原性组合物。
本发明还提供了用作药物的如本文所述的IBV或免疫原性组合物。
本发明进一步提供了本文所述的IBV或免疫原性组合物在制备药物中的用途。
本发明进一步提供了本文所述的IBV或免疫原性组合物在治疗和/或预防对象中的 IBV感染中的用途。
本发明进一步提供了一种免疫原性组合物,包括编码异源S(刺突)蛋白或其片段的 4/91 IBV(传染性支气管炎病毒),其中所述4/91 IBV包括核壳(N)蛋白、包膜(E)蛋白或膜糖蛋白(M),其具有如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、EU780081(SEQ ID NO57)、AGY56143(SEQ ID NO 58)、AGY56144(SEQ ID NO 59)所示氨基酸序列或与其具有至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列,并且,其中异源S蛋白或其片段选自Massachusetts、QX、Q1、Arkansas、变体2和Brazil的基因型或血清型,或选自SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16或17所示的氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一具体方面,异源S蛋白是全长刺突蛋白。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面,异源S(刺突)蛋白的片段从N端开始至少有500、750、1000或1075个氨基酸的长度。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一具体方面,异源S(刺突)蛋白的片段是刺突蛋白的胞外域。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一具体方面,IBV是减毒的。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一个具体方面,所述4/91 IBV选自CR88和793B的基因型或血清型。
本发明进一步提供了一种制备用于治疗和/或预防对象中IBV感染的免疫原性组合物的方法,所述方法包括:
a.)提供包含刺突(S)蛋白、核壳(N)蛋白、包膜(E)蛋白或膜糖蛋白(M)的4/91IBV,其具有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、AGY6140(SEQ ID NO54)、AF093793(SEQ ID NO 60)、EU914938(SEQ ID NO 55)、KM067900(SEQ ID NO 56)、EU780081(SEQ ID NO 57)、AGY56143(SEQ ID NO 58)、AGY56144(SEQ ID NO 59)所示的氨基酸序列或与其具有至少85%,88%,90%,91%,92%,93%,94%, 95%,96%,97%,98%,99%,99.2%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%, 99.95%,99.98%或99.99%的序列相同性的序列;以及
b.)提供异源S蛋白或其片段,其选自Massachusetts、QX、Q1、Arkansas、变体2 和Brazil的基因型或血清型列表,或选自SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17所示氨基酸序列或与其具有至少90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%,97%,98%,99%,99.2%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%,99.95%,99.98%或99.99%的序列相同性的序列;以及
c.)用b)所述的异源S(刺突)蛋白或其片段替换a)的4/91 IBV的刺突蛋白或其片段,以获得具有异源S蛋白或其片段的4/91 IBV;以及
d.)获得具有异源S蛋白或其片段的所述4/91 IBV;以及
e.)加入药学可接受的载体。
术语“获得”包括具有异源S蛋白或其片段的所述IBV 4/91的收获、分离、纯化和/或配制(例如完成、灭活和/或混合)。
术语“收获”是指从转染或感染的细胞或细胞系中收集或回收具有异源S蛋白或其片段的所述IBV 4/91。可以使用本领域已知的任何常规方法,例如任何分离方法。本领域中众所周知的方法包括离心或过滤,例如使用具有一定孔径的半透膜。
术语“分离”包括具有异源S蛋白或其片段的所述IBV 4/91的分离步骤。本领域技术人员已知从转染或感染的细胞或细胞系中分离的方法。这些方法包括物理和/或化学方法,包括但不限于冻融循环,超声处理等。
从分离物中"纯化"具有异源S蛋白或其片段的所述IBV 4/91的方法是本领域技术人员已知的,例如通过在《蛋白质纯化方法--一种实用方法》(E.L.V.Harris and S.Angel,eds., IRL Press at Oxford University Press)。这些方法包括但不限于通过离心和/或过滤、沉淀、尺寸排除(凝胶过滤)色谱、亲和色谱、金属螯合物色谱、离子交换色谱、共价色谱、疏水相互作用色谱等进行分离。载体可以纯化的纯形式获得,或者不含或基本上不含其他细胞材料或培养基等。在所述分离和/或纯化之后,抗原表现出至少80%,优选80%-90%,更优选90%-97%,最优选超过97%的纯度,直至没有任何污染的绝对纯形式。
根据另一方面,如本文所用的“获得”还可以包括作为最终配制过程的一部分的进一步完成步骤,如添加缓冲剂、灭活、中和步骤等。
在根据本发明制备免疫原性组合物的方法的另一个具体方面,异源S(刺突)蛋白的片段是刺突蛋白的胞外域。
在根据本发明的免疫原性组合物的另一特定方面中,所述药学上可接受的载体选自溶剂,分散介质,涂层,稳定剂,稀释剂,防腐剂,抗菌剂和抗真菌剂,等渗剂,吸附延迟剂,佐剂,免疫刺激剂及其组合。
在根据本发明制备免疫原性组合物的方法的另一具体方面,异源S蛋白是全长刺突蛋白。
在根据本发明制备免疫原性组合物的方法的另一个具体方面,4/91 IBV选自由Spain/98/328、Spain/92/35、IR-3654-VM、FR-CR88061-88、FR-85131-85、UK-1233-95、 UK/3/91、Spain/00/336、UK/4/91、UK/7/91、UK/793B/91、4/91-致病性、4/91减毒、IB4-91 和CR88组成的毒株列表。
本发明进一步涉及包含编码部分4/91 IBV(传染性支气管炎病毒)基因组的核酸的质粒,所述基因组包括异源IBV S(刺突)蛋白或其片段,所述质粒例如pUC57-S CR88rIBV H52 S供体质粒(SEQ ID NO:21)。
条款
本文还描述了以下条款:
1.编码异源IBV S(刺突)蛋白或其片段的4/91 IBV(传染性支气管炎病毒)。
2.包含编码异源S(刺突)蛋白或其片段的4/91 IBV(传染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物。
3.包含条款1的IBV(传染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物。
4.条款1至3中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中4/91 IBV具有或由其组成或包含如KF377577(SEQ ID NO 53)所示的核苷酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
5.条款1至4中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中4/91 IBV具有或由其组成或包含SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或与其具有至少90%,91%,92%,94%,95%, 96%,97%,98%,99%,99.2%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%,99.95%,99.98%或99.99%序列相同性的序列。
6.IBV或第1至5条中任一条的免疫原性组合物,其中4/91 IBV菌株具有或由其组成或包含刺突蛋白,所述刺突蛋白具有如AGY56140所示的氨基酸序列(SEQ ID NO 54) 或与其具有至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.2%, 99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%,99.95%,99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
7.条款1至6中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中4/91 IBV菌株具有或由其组成或包含刺突(S1)蛋白,所述刺突(S1)蛋白具有AF093793所示氨基酸序列(SEQ ID NO 60)或与其具有至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.2%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%,99.95%,99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
8.条款1至7中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中4/91 IBV菌株具有或由其组成或包含刺突(S1)蛋白,所述刺突(S1)蛋白具有EU914938(SEQ ID NO 55)所示氨基酸序列或与其具有至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%, 99.2%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%,99.95%,99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
9.条款1至8中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中4/91 IBV菌株具有或由其组成或包含刺突(S1)蛋白,所述刺突(S1)蛋白具有KM067900(SEQ ID NO 56)所示氨基酸序列或与其具有至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%, 99.2%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%,99.95%,99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
10.条款1至9中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中4/91 IBV株具有或由其组成或包含刺突(S)蛋白,所述刺突(S)蛋白具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或与其具有至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.2%,99.5%, 99.6%,99.7%,99.8%,99.9%,99.95%,99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
11.条款1至10中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中4/91 IBV具有或由其组成或包含核壳(N)蛋白,所述核壳(N)蛋白具有EU780081(SEQ ID NO 57)所示氨基酸序列或与其具有至少95%,96%,97%,98%,99%,99.2%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%,99.95%,99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
12.条款1至11中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中4/91 IBV具有或由其组成或包含核壳(N)蛋白,所述核壳(N)蛋白具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有至少95%,96%,97%,98%,99%,99.2%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%, 99.9%,99.95%,99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
13.条款1至12中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中4/91 IBV具有或由其组成或包含包膜(E)蛋白,所述包膜(E)蛋白具有AGY56143所示氨基酸序列(SEQ ID NO 58) 或与其具有至少85%,88%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.2%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%,99.95%,99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
14.条款1至13中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中4/91 IBV具有或由其组成或包含包膜(E)蛋白,所述包膜(E)蛋白具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或与其具有至少95%,96%,97%,98%,99%,99.2%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%, 99.95%,99.98%或99.99%序列相同性的序列。
15.条款1至14中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中4/91 IBV具有或由其组成或包含膜糖蛋白(M),所述膜糖蛋白(M)具有如AGY56144(SEQ ID NO 59)所示氨基酸序列或与其具有至少95%,96%,97%,98%,99%,99.2%,99.5%,99.6%,99.7%, 99.8%,99.9%,99.95%,99.98%或99.99%的序列相同性的序列。
16.条款1-15中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中4/91 IBV具有或由其组成或包含膜糖蛋白(M)蛋白,该蛋白具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或者与其具有至少 95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、 99.95%、99.98%或99.99%序列相同性的序列。
17.条款1-16中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中4/91 IBV选自如下毒株:Spain/98/328、Spain/92/35、IR-3654-VM、FR-CR88061-88、FR-85131-85、UK- 1233-95、UK/3/91、Spain/00/336、UK/4/91、UK/7/91、UK/793B/91、4/91-致病性、4/91 减毒、IB4-91和CR88。
18.条款1-17中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源刺突为非4/91基因型或血清型。
19.条款1-18中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S蛋白或其片段来自具有选自以下基因型或血清型的IBV:Arkansas(例如Arkansas 99),Brazil(例如BR-1,BR-2,23/2013,IBV/Brasil/351/1984),California(例如California1734/04,California99), Connecticut,Delaware(例如Delaware 98),Dutch(例如D207,D212,D274,D3128, D3896,D8880,D1466),Florida,Georgia(例如Georgia GA-07,GA-08,GA-12,GA-13), Gray,Holte,Iowa(例如Iowa 97和Iowa 69),Italy(例如Italy 02),JMK,LDT3,Maine (例如Maine 209),Massachusetts(M41,H52,H120),Pennsylvania(例如Pennsylvania 1220/98,Pennsylvania Wolg/98),PL84084,Qu(例如Qu-mv),QX(例如GB341/96), Q1,SE 17和变体2(例如IS/1494/06,IBV/Ck/EG/CU/4/2014, gammaCoV/Ck/Poland/G052/2016)。
20.条款1-19中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S蛋白或其片段来自选自如下基因型或血清型的IBV:Massachusetts,QX,Q1,Italy 02,Arkansas,Conneticut, Georgia,LDT3,PL84084,变体2或Brazil。
21.条款1-20中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S蛋白或其片段来自选自如下基因型或血清型的IBV:Massachusetts,QX,Q1,Arkansas,变体2和Brazil。
22.条款21的IBV或免疫原性组合物,其中Massachusetts毒株选自:H120,H52,Spain/98/308,IBMA5-1,SD/97/01,Spain/96/334,M41-M21883。
23.条款21的IBV或免疫原性组合物,其中QX株选自:FR-L1450T-05, FR-L1450L-05,NL-L1449T-04,NL-L1449K-04,IBV/Ck/SP/170/09,IBV/Ck/SP/79/08, IBV/Ck/SP/248/09,HBN,IBVQX,LX4,BJQ,CK/CH/LGD/03和GB341/96。
24.条款21的IBV或免疫原性组合物,其中Q1株选自:CK/CH/LDL/98I, CK/CH/LSD/08-10,J2,Q1,AR08ER22,AR08BA21和Chile-295-10。
25.条款21的IBV或免疫原性组合物,其中所述Arkansas株选自:Ark99,ArkGA,ArkDPI,AL/5364/00,ARKDPI11,AL/0803/01,AL/7149/00,ArkDPI101,AL/1221/01, AL/1793/01和AL/4614/98。
26.条款21的IBV或免疫原性组合物,其中变体2毒株选自:IS/1494/06, IBV/Ck/EG/CU/4/2014,gammaCoV/Ck/Poland/G052/2016,Eg/CLEVB-2/IBV/012, D1344/2/4/10_EG,TR8和IB VAR2-06。
27.条款21的IBV或免疫原性组合物,其中所述Brazil毒株选自BR-1,BR-2,23/2013 和IBV/Brasil/351/1984。
28.条款1-27中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S蛋白或其片段来自Massachusetts基因型或血清型。
29.条款1-28中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S蛋白或其片段来自与SEQ ID NO:6或7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%序列相同性的Massachusetts基因型或血清型,或者所述异源S蛋白或其片段包含或由 SEQ ID NO:6或7所示氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、 99.98%或99.99%序列相同性的序列组成。
30.条款1-29中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S蛋白或其片段来自与SEQ ID NO:8或9具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%序列相同性的QX基因型或血清型,或者所述异源S蛋白或其片段包含或由SEQ ID NO:8 或9所示氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列组成。
31.条款1-30中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S蛋白或其片段来自与SEQ ID NO:10或11具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%序列相同性的Q1基因型或血清型,或者所述异源S蛋白或其片段包含或由SEQ ID NO:10或11所示氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、 99.98%或99.99%的序列相同性的序列组成。
32.条款1-31中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S蛋白或其片段来自与SEQ ID NO:12或13具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%序列相同性的Arkansas基因型或血清型,或者所述异源S蛋白或其片段包含或由SEQ ID NO:12或13所示氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、 99.98%或99.99%的序列相同性的序列组成。
33.条款1-32中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S蛋白或其片段来自与SEQ ID NO:14或15具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%序列相同性的变体2基因型或血清型,或者所述异源S蛋白或其片段包含或由SEQ ID NO:14或15所示氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、 99.98%或99.99%的序列相同性的序列组成。
34.条款1-33中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S蛋白或其片段来自与SEQ ID NO:16或17具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%序列相同性的Brazil基因型或血清型,或者所述异源S蛋白或其片段包含或由SEQ ID NO:16或17所示氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、 99.98%或99.99%的序列相同性的序列组成。
35.条款1-34中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S蛋白或其片段选自SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17。
36.条款1-35中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S蛋白是全长刺突蛋白。
37.条款1-36中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S(刺突)蛋白的片段的长度为至少500、750、1000或1075个氨基酸。
38.条款1-37中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S(刺突)蛋白的片段的长度为从N末端开始至少500、750、1000或1075个氨基酸。
39.条款1-38中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S(刺突)蛋白的片段的长度为至少1000个氨基酸。
40.条款1-39中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S(刺突)蛋白是刺突蛋白的胞外域。
41.条款1-40中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换同源S蛋白或其片段。
42.条款1-41中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换天然存在的S蛋白或其片段。
43.条款1-42中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换4/91的S蛋白或其片段。
44.条款1-43中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述IBV是减毒的。
45.条款1-43中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述IBV是灭活的。
46.条款1-45中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述IBV是经遗传工程化的。
47.条款1-46中任一项的IBV或免疫原性组合物,其中所述IBV是重组IBV。
48.条款2-47中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物是疫苗。
49.条款2-48中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。
50.条款49的免疫原性组合物,其中所述药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。
51.条款2-50中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物在有需要的对象中有效治疗和/或预防由IBV引起的临床体征。
52.条款2-51中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物保护免受异源刺突蛋白的基因型或血清型的IBV毒株攻击。
53.条款2-52中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物保护免受Massachusetts、QX、Q1、Arkansas、变体2或Brazil基因型毒株攻击。
54.条款2-53中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物保护免受Massachusetts基因型毒株攻击。
55.条款2-54中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物被配制为用于单剂施用的形式。
56.条款2-55中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物是经皮下、肌内、口服、卵内、通过喷雾、通过饮用水或滴眼剂施用。
57.条款2-56中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物包含1-10log
58.条款2-57中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物包含2-5log
59.条款2-58中任一项的免疫原性组合物,其中所述免疫原性组合物包含2-4log
60.一种试剂盒,其包含条款1-59中任一项的IBV或免疫原性组合物。
61.根据条款60的试剂盒,其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防禽类疾病的说明书。
62.根据条款60的试剂盒,其中所述试剂盒进一步包括用于治疗和/或预防家禽疾病的说明书。
63.根据条款60的试剂盒,其中所述试剂盒进一步包括用于治疗和/或预防IB的说明书。
64.一种免疫对象的方法,包括给所述对象施用根据条款2-59中任一项的免疫原性组合物。
65.一种在有需要的对象中治疗或预防由IBV引起的临床体征的方法,包括给对象施用治疗有效量的条款2-59中任一项的免疫原性组合物。
66.一种与相同物种的未免疫对照组相比在有需要的对象中减少纤毛停滞的方法,所述方法包括给对象施用治疗有效量的根据条款2-59中任一项的免疫原性组合物。
67.条款2-59中任一项的免疫原性组合物,其用于免疫对象的方法,所述方法包括给对象施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
68.条款2-59中任一项的免疫原性组合物,其用于在有需要的对象中治疗或预防由 IBV导致的临床体征的方法,所述方法包括给对象施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
69.条款2-59中任一项的免疫原性组合物,其用于在有需要的对象中减少纤毛停滞的方法,所述方法包括给对象施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
70.条款64-69中任一项的方法或用途,其中所述对象是禽类。
71.条款64-70中任一项的方法或用途,其中所述对象是家禽。
72.条款64-71中任一项的方法或用途,其中所述对象选自鸡、火鸡、鹌鹑或野鸡。
73.条款64-72中任一项的方法或用途,其中所述对象是鸡。
74.条款64-73中任一项的方法或用途,其中所述免疫原性组合物施用一次。
75.条款64-73中任一项的方法或用途,其中所述免疫原性组合物施用两剂或更多剂。
76.条款64-75中任一项的方法或用途,其中所述免疫原性组合物通过皮下、肌内、口服、卵内注射、通过喷雾、通过饮用水或滴眼剂施用。
77.条款64-76中任一项的方法或用途,其中所述免疫原性组合物通过滴眼剂施用。
78.条款64-77中任一项的方法或用途,其中所述免疫原性组合物包含1-10log
79.条款64-78中任一项的方法或用途,其中所述免疫原性组合物包含2-5log
80.条款64-79中任一项的方法或用途,其中所述免疫原性组合物包含2-4log
81.条款64-80中任一项的方法或用途,其中将免疫原性组合物在对象年龄的第一周内、前三天内、前两天内或在第一天内给对象施用。
82.条款64-81中任一项的方法或用途,其中将所述免疫原性组合物在对象年龄的第一天内给对象施用。
83.条款64-82中任一项的方法或用途,其中所述方法导致与相同物种未处理对照组对象相比选自如下的功效参数得以改善:预防或减少纤毛停滞,预防或减少罗音,预防或减少减蛋,预防或减少肾脏病变,预防或减少水性腹泻,预防或减轻体重降低,降低病毒载量,减少病毒脱落或其组合。
84.条款64-83中任一项的方法或用途,其中与相同物种未处理对照组对象相比,所述治疗或预防导致预防或减少纤毛停滞。
85.条款64-84中任一项的方法或用途,其中与相同物种未处理对照组对象相比,所述治疗或预防导致预防或减少肾脏病变。
86.条款64-85中任一项的方法或用途,其中所述治疗或预防与相同物种未处理对照组对象相比导致预防或减少减蛋。
87.条款1-59中任一项的IBV或免疫原性组合物,其用于治疗用途。
88.条款1-59中任一项的IBV或免疫原性组合物,其用作免疫原或疫苗。
89.条款1-59中任一项的IBV或免疫原性组合物,其用作药物。
90.条款1-59中任一项的IBV或免疫原性组合物在生产药物中的用途。
91.条款1-59中任一项的IBV或免疫原性组合物在治疗和/或预防对象IBV感染中的用途。
92.一种免疫原性组合物,其包含编码异源S(刺突)蛋白或其片段的4/91 IBV(传染性支气管炎病毒),其中所述4/91 IBV包含核壳(N)蛋白蛋白、包膜(E)蛋白或膜糖蛋白(M),其具有或包含或由如下序列组成:如SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,EU780081(SEQ ID NO:57),AGY56143(SEQ ID NO:58),AGY56144(SEQ ID NO:59)所示的氨基酸序列或者与其具有至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%序列相同性的序列,及其中异源S蛋白或其片段选自如下基因型或血清型:Massachusetts,QX,Q1,Arkansas,变体2和Brazil,或者选自如下氨基酸序列:SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17,或者与其具有至少90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、 99.9%、99.95%、99.98%或99.99%序列相同性的序列,或者异源S蛋白或其片段包含或由以下氨基酸序列组成:SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或 17,或者与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、 99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%序列相同性的序列。
93.条款92的免疫原性组合物,其中所述异源S蛋白是全长刺突蛋白。
94.条款92或93的免疫原性组合物,其中所述异源S(刺突)蛋白的片段长度为从N末端开始至少500、750、1000或1075个氨基酸。
95.条款92-94中任一项的免疫原性组合物,其中所述异源S(刺突)蛋白的片段是所述刺突蛋白的胞外域。
96.条款92-95中任一项的免疫原性组合物,其中所述IBV是减毒的。
97.条款92-96中任一项的免疫原性组合物,其中4/91 IBV选自如下毒株: Spain/98/328、Spain/92/35、IR-3654-VM、FR-CR88061-88、FR-85131-85、UK- 1233-95、UK/3/91、Spain/00/336、UK/4/91、UK/7/91、UK/793B/91、4/91-致病性、4/91 减毒、IB4-91和CR88。
98.一种制备用于治疗和/或预防对象中IBV感染的免疫原性组合物的方法,其包括:
a.)提供包含刺突(S)蛋白、核壳(N)蛋白、包膜(E)蛋白或膜糖蛋白(M)的4/91IBV,其具有或包含或由以下氨基酸序列组成:SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,AGY6140(SEQ ID NO:54),AF093793(SEQ ID NO:60),EU914938(SEQ ID NO:55),KM067900(SEQ ID NO:56),EU780081(SEQ ID NO:57),AGY56143(SEQ ID NO:58),AGY56144(SEQ ID NO:59),或者与其具有至少95%、96%、97%、98%、99%、 99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列;及
b.)提供异源S蛋白或其片段,其选自Massachusetts、QX、Q1、Arkansas、变体2 和Brazil的基因型或血清型,或选自SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16或17所示氨基酸序列或者与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、 99.98%或99.99%的序列相同性的序列,或提供异源S蛋白或其片段,其包含或由SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17所示氨基酸序列或与其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%、 99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%、99.98%或99.99%的序列相同性的序列组成;及
c.)用b)的所述异源S(刺突)蛋白或其片段置换a)的4/91 IBV的刺突蛋白,以使4/91 IBV具有异源S蛋白或其片段;及
d.)获得具有异源S蛋白或其片段的所述4/91 IBV;及
e.)加入药物可接受的载体。
99.条款98的方法,其中所述异源S(刺突)蛋白的片段是所述刺突蛋白的胞外域。
100.条款98或99的方法,其中所述药物可接受的载体选自溶剂,分散介质,包被剂,稳定剂,稀释剂,防腐剂,抗菌和抗真菌剂,等渗剂,吸附延迟剂,佐剂,免疫刺激剂及其组合。
101.条款98或100的方法,其中所述异源S蛋白是全长刺突蛋白。
102.条款98-101中任一项的方法,其中4/91 IBV选自如下毒株:Spain/98/328、Spain/92/35、IR-3654-VM、FR-CR88061-88、FR-85131-85、UK-1233-95、UK/3/91、 Spain/00/336、UK/4/91、UK/7/91、UK/793B/91、4/91-致病性、4/91减毒、IB4-91和CR88。
附图简述
图1与重组野生型病毒CR88和H52相比,CR88 rIBV H52 S的卵内复制动力学。数据点代表每个时间点5个样本的平均值。误差线表示标准偏差。
图2纤毛停滞评分概述计算一只动物的10个环的10个单独分数的总和,在图中用一个点表示。最大纤毛停滞对应的分数为40,而没有纤毛停滞的对应分数为0。使用GraphPad Prism和常规的单向ANOVA检验计算均值和显著性(p<0.0001)。
图3肾脏组织RT-qPCR结果概述。每只禽类动物以一个数据点表示。
图4纤毛停滞评分概述计算一只动物的10个环的10个单独分数的总和,在图中用一个点表示。最大纤毛停滞对应的分数为40,而没有纤毛停滞的对应分数为0。使用GraphPad Prism和常规的单向ANOVA检验计算均值和显著性(p<0.0001)。
序列概览
SEQ ID NO:1:CR88基因组
SEQ ID NO:2:CR88 IBV刺突(S)蛋白。
SEQ ID NO:3:CR88 IBV核壳(N)蛋白。
SEQ ID NO:4:CR88 IBV包膜(E)蛋白。
SEQ ID NO:5:CR88 IBV膜糖蛋白(M)。
SEQ ID NO:6和7:来自Massachusetts基因型或血清型的异源S蛋白或其片段。
SEQ ID NO:8和9:来自QX基因型或血清型的异源S蛋白或其片段。
SEQ ID NO:10和11:来自Q1基因型或血清型的异源S蛋白或其片段。
SEQ ID NO:12和13:来自Arkansas基因型或血清型的异源S蛋白或其片段。
SEQ ID NO:14和15:来自变体2基因型或血清型的异源S蛋白或其片段。
SEQ ID NO:16和17:来自Brazil基因型或血清型的异源S蛋白或其片段。
SEQ ID NO:18:pUC57-s CR88 mIBV。
SEQ ID NO:19:IBV H52刺突蛋白核酸编码序列。
SEQ ID NO:20:IBVCR88刺突蛋白核酸编码序列。
SEQ ID NO:21:pUC57-s CR88 rIBV供体质粒。
SEQ ID NO:22:pUC57-s CR88 rIBV H52 S供体质粒。
SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:52:引物。
SEQ ID NO:53:KF377577(4/91 IBV核苷酸序列)
SEQ ID NO:54:AGY56140(4/91 IBV刺突蛋白氨基酸序列)
SEQ ID NO:55:EU914938(4/91 IBV刺突蛋白氨基酸序列)
SEQ ID NO:56:KM067900(4/91 IBV刺突蛋白氨基酸序列)
SEQ ID NO:57:EU780081(4/91 IBV刺突蛋白氨基酸序列)
SEQ ID NO:58:AGY56143(4/91 IBV E蛋白氨基酸序列)
SEQ ID NO:59:AGY56144(4/91 IBV M蛋白氨基酸序列)
SEQ ID NO:60:AF093793(4/91 IBV刺突蛋白氨基酸序列)
SEQ ID NO:61:引物
实施例
以下阐述的实施例是示例说明本发明的具体实施方案。这些实施例仅是示例,不应理解为限制本发明的范围或基本原理。
实施例1:重组IBV CR88的产生,其中CR88刺突蛋白的编码序列由异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的编码序列置换
靶向RNA重组及重组IBV的拯救
为了产生重组IBV,使用van Beurden et al.(Virol J.2017;14(1):109)所述的靶向RNA 重组方法。产生鼠源化辅助病毒(mIBV),以使得可以在细胞培养中进行IBV靶向重组。
IBV CR88鼠源化供体质粒的构建
为了产生CR88鼠源化(m)IBV供体质粒,供体序列由商业供应商合成:将CR88基因组5'UTR的497个碱基与1ab区域的3'部分(752个碱基)融合,前72个碱基编码CR88 IBV刺突蛋白,随后是MHV刺突蛋白胞外域的3753个碱基,接着是CR88 IBV刺突蛋白末端的210个碱基,及随后的序列持续直到基因组的3'末端。此外,将SacI限制位点和T7启动子序列加入至供体区域的5'末端,以及100x polyA序列,随后在3'末端加入 Not I限制位点以进行线性化。分别进行加入。在组装序列的第5634位置导入沉默的A 至C突变以产生XhoI限制位点。将合成的序列插入pUC57-simple中以产生pUC57-s CR88 mIBV供体质粒(SEQ ID NO:18)。
CR88 mIBV的拯救
将CR88 mIBV类似于H52 mIBV进行拯救(van Beurden et al.Virol J.2017;14(1):109),对所述方案进行一些改变:将病毒尿囊液原液通过超速离心进行浓缩,然后分离病毒 RNA以用于电穿孔。将18ml病毒尿囊液通过在TNE(Tris、NaCl、EDTA)缓冲液中的 2ml的20%蔗糖垫以50,000xg离心2小时。弃去上清液,将沉淀重悬于150μl TNE缓冲液中,然后用QIAamp病毒RNA mini试剂盒(Qiagen)进行RNA分离。进一步地,将鸡胚成纤维细胞(CEF)代替BHK细胞用于电穿孔(2个脉冲250V/300μF,间隔10秒),并将1.25%DMSO加入电穿孔混合物中。
IBV CR88供体质粒的构建,其中CR88刺突蛋白的编码序列由异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的编码序列置换
描述了用H52刺突蛋白置换CR88刺突蛋白的构建示例。将IBV H52刺突核酸编码序列(SEQ ID NO:19)用作模板,以在pUC57-s CR88 rIBV供体质粒(如上文关于mIBV质粒所述通过保持完整的CR88刺突蛋白序列(SEQ ID NO:21)而产生的)中置换IBV CR88 刺突蛋白核酸编码序列(SEQ ID NO:20)。将SEQ ID NO:21的碱基1657-5151置换为相应的IBV H52刺突蛋白核酸编码序列(SEQ ID NO:19)。这样产生了pUC57-s CR88 rIBV H52 S供体质粒(SEQ ID NO:22),其中IBV H52刺突蛋白由碱基1657-5145编码。为此,将H52刺突蛋白核酸编码序列和pUC57-s CR88骨架序列在两个单独的PCR反应中扩增,使用
表1:通过NEB用NEBuilder在线工具设计的Gibson组装引物,用于产生PCR产物以组装pUC57-s CR88 rIBV H52 S供体质粒(SEQ ID NO:22)。
靶向RNA重组及重组IBV的拯救
为了用异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域拯救CR88 rIBV,将LR7细胞用CR88 mIBV感染,并从NotI线性化后的pUC57-s CR88 rIBV H52 S供体质粒中产生的体外转录物电穿孔。随后,将细胞和上清注入8天龄的含胚SPF鸡蛋(VALO BioMedia)中,将其在37.5℃和60%湿度下孵育9天。收集具有死亡胚的鸡蛋尿囊液,并在8天龄的SPF鸡蛋中用于终点稀释。使用MagMAX
为了确认刺突蛋白正确插入到产生的rIBV中,使用QIAamp病毒RNA mini试剂盒分离病毒核酸,然后使用表2中列出的引物进行SuperScript III一步式RT-PCR,进行QIAquick PCR纯化和随后由供应商进行Sanger测序。
表2:确认CR88 rIBV H52 S中正确插入和刺突蛋白序列的PCR和测序引物
CR88重组IBV的产生和鉴定,其中CR88刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的编码序列由来自另一IBV基因型的刺突蛋白的编码序列置换
使用与产生CR88 rIBV H52 S所述相同的方法来产生和鉴定CR88重组IBV,其中CR88刺突蛋白编码序列(SEQ ID NO:21中的碱基1657-5151)或CR88刺突蛋白胞外域编码序列(SEQ ID NO:21中的碱基1711-4941)由表3中列出的血清型和基因型的IBV刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的编码序列置换。
表3:用于Gibson组装具有异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的H52 rIBV供体质粒的引物。
如果需要的话,将用于鉴定和鉴别重组IBV中不同刺突蛋白序列的引物调适于各自的刺突蛋白序列。
实施例2:卵内复制动力学
为八个八天龄的含胚鸡蛋接种了102 50%胚感染剂量(EID
与重组野生型病毒CR88和H52相比,CR88 rIBV H52 S的复制是通过在时间点0 为8天龄的SPF鸡蛋注射100EID
实施例3:疫苗和攻击病毒的制备
为了证实具有异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的CR88 rIBV在鸡中的效力,将等份的病毒原液解冻,在1xPBS中稀释10倍,通过将100μl每种稀释液接种到5个8天龄含胚鸡蛋中以确定50%的胚感染剂量(EID
将攻击病毒M41、QX、Q1、Ark、变体2和Brazil在10天龄的含胚SPF鸡蛋中繁殖。接种后24小时,将鸡蛋转移至4℃至少2小时。收集尿囊液,等份并储存在-80℃。如上述确定病毒效价。通过用1xPBS稀释将效价设定为10
实施例4:疫苗效力的确定
将受精的SPF鸡蛋在鸡蛋孵化器中在99.7°F和50%湿度下每小时转动一次孵育18天。在孵化的第18天,对鸡蛋进行透光检查,将受精鸡蛋转移到孵化器中,在99°F和 70%湿度下孵育直至孵出。将没有临床体征或变形的鸡随机分配为各个治疗组中,移至单独的隔离器中。至少两只鸡用作严格的阴性对照(SNC)组,将五只鸡纳入攻击对照(CC) 组,将每组至少十只鸡接种具有异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的重组IBV,随后进行攻击。将动物在符合当地和国家关于动物福利建议要求的饲养条件下饲养。光照方案调整为每天16小时光照。随意提供饲料和水。转移到隔离器后,通过滴眼剂(总体积50μl,每只眼25μl)为鸡(1天龄))接种10
对于IBV特异性RT-qPCR分析,将肾脏组织切片加热至室温,然后转移至单独的2ml Precellys管中,分别填充培养基和PBS。用
表5:气管环中纤毛停滞评分
实施例5:编码异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的重组IBV 4/91的效力
本项研究的目的是证明用编码异源刺突蛋白或其片段的重组IBV CR88(4/91基因型和血清型)进行疫苗接种能够赋予抵抗刺突蛋白同源攻击毒株攻击的保护作用。
研究分析了编码IBV H52(Mass基因型)刺突蛋白胞外域的重组IBV CR88(4/91基因型)是否能够赋予抵抗强毒性M41毒株(Mass基因型)攻击的保护作用,其被认为是编码的IBV H52刺突蛋白的同源攻击物,是IBV CR88骨架的异源攻击物。每天观察所有鸡的临床体征。接种或攻击后无临床体征记录。在1天龄时用CR88 rIBV H52 S和H52 rIBV 野生型接种的反向滴定确定在接种后第21天应用M41攻击病毒的效价分别为10
表5:在接种后28天和攻击后7天的纤毛停滞保护作用评分概览。通过将每组各只鸡的总得分相加,然后将组总分除以动物数量,计算出每组平均纤毛停滞得分(最高得分为40,最低得分为0)。如果10个环中有不少于9个显示出正常的纤毛活动性,则认为该动物没有受到影响。
严格阴性对照组的所有动物均表现出正常的纤毛运动,而攻击对照组的所有动物的纤毛停滞均为阳性。相反,接种CR88 rIBV H52 S或H52 rIBV野生型病毒的动物中有93%受保护。此外,与攻击对照组动物相比,接种CR88 rIBV H52 S的动物肾脏的病毒载量降低(图3)。
此外,分析了编码IBV QX刺突蛋白的重组IBV CR88是否能够赋予针对强毒D388QX毒株攻击的保护作用,认为其是编码的IBV QX刺突蛋白的同源攻击物,及是IBV CR88骨架的异源攻击物。每天观察所有鸡的临床体征。接种或攻击后无临床体征记录。在1天龄时用CR88 rIBV QX S和QX疫苗接种的反向滴定法确定在接种后21天应用 D388 QX攻击病毒的效价分别超过10
表6:在接种后28天和攻击后7天纤毛停滞保护作用评分概览。通过将每组各只鸡的总得分相加,然后将组总分除以动物数量,计算出每组平均纤毛停滞得分(最高得分为40,最低得分为0)。如果10个环中有不少于9个显示出正常的纤毛活动性,则认为该动物没有受到影响。
严格阴性对照组的所有动物均表现出正常的纤毛运动,而攻击对照组的所有动物的纤毛停滞均为阳性。相反,接种CR88 rIBV QX S或QX疫苗的动物100%受保护。
其他具有异源刺突蛋白或刺突蛋白胞外域的CR88 rIBV也获得了相似的结果。
这个结果突显了IBV H52作为有效的骨架产生具有异源刺突蛋白的重组IBV的适用性,特别是当与现有技术中IBV Beaudette骨架的数据相比时示出极佳结果。
序列表
<110> 勃林格殷格翰动物保健有限公司
<120> 具有异源刺突蛋白的4/91 IBV疫苗
<130> 01-3343
<160> 61
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27659
<212> DNA
<213> 禽类传染性支气管炎病毒
<400> 1
acttaagtgt gatataaata tatatcatac atactagcct tgtgctagat ttccaactta 60
acaaaacgga cttaaatacc tacagttggt ccctataggt gttccattgc agtgcacttt 120
agtgccctgg atggcacctg gccacctgtc aggtttttgt tattaaaata atattgttgc 180
tggtatcact gcttgttttg ccgtgtctca ctttatacat ccgttgcttg ggctacctag 240
tatccagcgt cctactggcg ttgtggtcgg ttcgagtgcg aagaacctct ggttcatcta 300
gcggtacgcg ggtgtgtgga agtagcgctt cagacgtacc ggttctgttg cgtgaaatac 360
ggggtcacct ccccccacat acctctaagg gcttttgagc ctagcgttgg gctacgttct 420
cgcacaaggt cggctatacg gcgtttgtag ggggtagtgc caaacaaccc ctgaggtgac 480
aggttctggt ggtgtttagt gagcagacat acaatagaca gtgacaacat ggcttcaagc 540
ctaaaacagg gagtatctcc caaaccaagg gatgtcattc ttgttgccaa agacattccc 600
gaacaactcc gtgacgcttt gtttttctat acgtcacata aacccaagga ttacgctgaa 660
gcctttgccc ttaggcagaa gtttgaccgt aatctgcaga ctgggaagca gtttaaattt 720
gaaactgtgt gtggtctctt cctcttgaag ggagttgaca aaataacacc tggtgtccca 780
gcaaaagttt taaaagccag ttctaagttg gcagatttag aaggcatttt tggtgtctct 840
ccttttgcac ggaagtaccg tgatctgttg aaaacagcat gccagtggtc tcttacagta 900
gatacactgg atgctcgtgc acaaactctt gatgaaattt ttaaccccac tgaaatactt 960
tggcttcagg tggctgcaaa aattcaagtt tcagctatgg caatgcgcag gcttgttgga 1020
gaagtaactg caaaagtcat ggatgctctt ggctctaatt tgagtgctct ttttcaaatt 1080
gttagagaac aaatagtcag aatctttcaa aaggcactgg ctatttttga agatgtgagt 1140
gaattaccac agcgtattgc agcacttaag atggcctttg ccaagattgc taagtcaatt 1200
actgttgtgg ttgtggaaag aactctagtt gttagagagt tcgcaggaac ttgtcttgca 1260
agcatcaatg gtgctgttgc aaaattcttc gaagaacttc caaatggctt tatgggttct 1320
aaaattttca caacattggc cttctttaaa gaagcagctg tgaaaattgt ggaaaatata 1380
ccaaatgcac caagaggtac tagaggtttt gaggtcgttg gcaatgccaa aggtacacaa 1440
gttattgtgc gtggcatgcg aaatgactta acgctgcttg accaaaaagc tgacattcct 1500
gttgagaaag aaggttggtc tgcaattttt gaaggacatc tttgctatgt ctttaagagc 1560
ggtgaccgtt tttatgcggc acctctttct ggaaattttg cattgcatga tgtacattgt 1620
tgtgagcgtg ttgtctgtct gtctgatggt gtaacaccgg agataaatga tggactcatt 1680
ctagcagcaa tttattcatc tgttagtgtt tcagaactcg tggcagcact taaaaagggc 1740
gaaccattta agttcttggg gcataaattt gtgtacgcga aggacgcagc agtgtcgttt 1800
actttagcga aggctgccac tattgcagat gtactgaagc tgtttcaatc agctcgtgtg 1860
caagcggaag atgtgtggtc tgcatttact gaaaagtctt ttaatttctg gaaactcgca 1920
tatggaaaag tgcgtaatct tgaagaagtt gtgaagactc atttttgtaa agctcaaatg 1980
tcacttatcg ttctagtagc agtgcttgga gaaggtgttt ggcatattgc ttctcaggtc 2040
atctacaaat taggtggtct ttttactaaa gttgttgact tttgtgaaaa acactggaaa 2100
ggtttttgtg tacagttgaa gaaggctaag ctcattgtga ctgaaaatct ttgtgttctt 2160
aagggagtgg cacagcattg ttttcaacta ttgctggatg caatacattc tttgtatatg 2220
agttttaaga agtgtgcact tggtagaatt catggagact tactcttctg gaaagggggt 2280
gtacacaaaa ttgttcaaga tggcgatgaa gtttggtttg acgccattga tagtattgat 2340
gttgaagatc tgggtgttgt caaagaaaaa cctatagatt ttgaggtttg tgatgacgta 2400
acacttccag aaaatcaacc cggtcatatg gttcaaatcg aggatgacgg aaagaactat 2460
atgttcttcc gcttcaaaaa ggatgagaat atttattata caccaatgtc tcaacttggt 2520
gcaattaatg tagtttgcaa agcaggcggc aaaaccgtta cctttggaga cattacagtg 2580
aaagaaatac cgccacctga tgtcgtgcct attaaggtta gcatagagtg ttgtggtgag 2640
ccatggaata caatcttcaa gaaagcttat aaagagccca ttgaagttga gacagacctc 2700
acagttgaac aattgctctc tgtgatttat gagaaaatgt gtgacgacct caaactgttt 2760
ccagaggcac ctgagcctcc accatttgag aatgttgccc ttgttgataa gaacggtaaa 2820
gatttggatt gcataaaatc atgccacctt atctaccgtg attgtgagag cgatgatgac 2880
atcgaggaag aagatgctga agagtgtgac accgattcag ctgatgctga agcatgtgac 2940
acagcctcag agtgtgaaga agaggacgag gatactaaag tgttggctct tatacaagac 3000
ccagcaagta ataaataccc tcttccactt gatgatgatt atagcgtcta taatggatgt 3060
attgttcata gagacgctct tgatgtagtg aatctaccat ctggcgaaga aacttttgtt 3120
gttaataact gttttgaggg agctattaaa ccactcccac agaaagttat tgatgttcta 3180
ggtgactggg gcgaggctgt tgatgcacaa gaacaattgt gtcaacagga atctacccaa 3240
gtcacacttg agaaaccagt tgagggtcct actggtattt gtcacgtaat ggctgaacaa 3300
gctgttgttg atgaacagga ggtagtttct gtatttgaag aaaagtctga ggttattgtt 3360
tacacacctg cagatctgga agttgttaaa gaaacagcag gagaacttga tgagttcatt 3420
ctcatctttg atgtccctaa agaagaagtt gtgtctcaag agaaagataa gccacaggtt 3480
gagcaagagc ctactcaagt tgttaaacca caacgtgaga agaaggctaa aaagttcaga 3540
gttaaaccat ctacatgtga aaagcccaaa tttttggagt acaaaacatg tgtgggtgat 3600
ctgactgttg taattgctaa ggcattggat gagtttaaag agttctgcat tgtaaacgct 3660
gcaaatgaac atatgtctca tggtggtggc gttgcgaaag caattgcaga cttctgtgga 3720
cctgattttg tggaatattg tgaggcctat gttaagaaac atgggccaca acagagactt 3780
gttacacctt cgtttgtcaa gggcattcaa tgtgtgaaca atgttgtggg acctcgtcat 3840
ggagacagca acttgcgtga gaaactcgtt gttgcttaca agaatgttct tgtggatggc 3900
gtcttcaact atgtagtgcc agttctctct tcagggattt ttggtgtgga ttttaaaatg 3960
tcaatagacg caatgcgtga agcctttgat ggttgcgaca tacgcatcct tttgttttct 4020
ctgagtcaag aacacatcga ctattttgat gtaacttgca agcagaagac aatttatctt 4080
acggaggatg gtgttaaata ccgctccgtt gttgtaaaac ctggcgactc attgagtcaa 4140
tttggacagg tttttgctaa aaataaggca gtctttacag ctgatgatgt tgaggataaa 4200
gaaatcctct tcgttcctac tactgacaag actgttcttg attattatca tttagatgcg 4260
caaaagtatg tgatatattt acaagctctt gcgcagaaat gggatgttca atatagggac 4320
aattttattg cattagagtg gcgtgatgga aattgctggg ttagttcagc aatagtgctc 4380
cttcaggctg ctaaggtaaa gtttagaggt tttcttgcag aagcatgggc taagtttttg 4440
ggtggtgatc ccactgattt tgtggcctgg tgttatgcaa gttgcaatgc taaagttggt 4500
gagttttcag atgctaattg gctcttggct aatctggcag aacattttga tgcagattac 4560
acgaatgcac ttcttaagaa gcgcgtatca tgtaactgcg gtgttaagag ttatgagctt 4620
aggggtcttg aagcttgcat tcaaccagta agggcaccta accttctaca ttttaagaca 4680
caatattcaa attgcccaac ctgtggcgca aatagtacgg atgaagtaat agaagcttca 4740
ttaccttact tattgctctt tgctaccgat ggtcctgcta cagttgattg tgatgaaaat 4800
gctgtaggga ctgttgtttt cattgggtct actaatagtg gacactgtta tacacaagcc 4860
atgggtaagg cttttgataa tcttgctaaa gatagaaaat ttggaaagaa gtcgccttac 4920
attacagcaa tgtacacacg cttctccctt aagagtgaaa accctttgcc tgtcaagcag 4980
agccagggta aaactaaagt agtaaaagaa gatgtttcta atctagcaac aagttcaaaa 5040
gtcagttttg atgatcttac tgactttgag cagtggtatg atagcaacat ctatgaaagt 5100
cttaaagtgc aggaaacgcc tgataattct gatgggtatg tgtcatttac aacaaaagaa 5160
gattctaagt tgccactgac acttaaagtt agaggtatta aatcagttgt tgattttagg 5220
tcgaaggatg gtttcactta caaattaata cctgatattg atgaaaattc aaaagcacca 5280
atttactatc cagtcttgga ctctattagt cttaaggcaa tatgggtgga aggtggtgct 5340
aattttgttg ttgggcatcc aaattattat agtaaatctc tccgcattcc tactttttgg 5400
gaaagtgcag agagttttgt taaaatgggt gataaagttg atggtgtaac tatgggcctt 5460
tggcgtgcag agcatcttaa caaacctaat cttgagaaaa ttttcaacat tgctaagaaa 5520
gctattgttg gatctagtgt tgttactacg caatgtggta aagtaattag taaggcggct 5580
acattcattg ctgataaaat aggtgggggt gtagttcgca acattataga tagaattaag 5640
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attaccatag cataaatttt atgacttggt ttgaagatgg cagtattaaa acatgttatc 19500
cacagcttca atcagcgtgg acatgtggtt ataatatgcc tgaactttat aaagtccaga 19560
attgcgttat ggaaccttgc aacattccta actatggtgt tggaataacg ttgccaagtg 19620
gtattatgat gaatgtagca aagtatacac aactttgtca atatctttcg aaaacaacaa 19680
tgtgtgtgcc gcataatatg cgagtaatgc attttggagc aggaagtgac aaaggagtgg 19740
ccccaggtag cgctgttctt aggcagtggc ttcccgaagg tacactcctt gtcgataatg 19800
atattgtaga ttatgtatct gatgcacatg tctctgtgct ttcagattgc aataaatgta 19860
aaacagagca caagtttgat cttgtgatat ctgatatgta tacagataat gattcaaaga 19920
gaaagcatga aggcgttgta gccaataacg gcaatgatga cgtcttcata tacctttcaa 19980
actttcttcg taacaattta gctctgggag gcagttttgc cgtaaaagta acagagacaa 20040
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tttctgagta gttttgtgta taaaccatct gattttatgt atgggtcata ccacccacat 21360
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actgaagcaa ctgctaatta tagttatcta gcagatggtg gtttagctat tttagatacc 21780
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actaacggaa cacgtcgctc tagacgttct gttactggga atgttacaaa ttgcccttat 22020
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gaattagaac agtttgtggc gcctttattc aatgttactg agcatgtgct catacctgat 22140
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atttgccttc agtatgtttg tggtaattct attgaatgca gaaagttgtt tcagcagtat 22260
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ataccttttg ctacacaact gcaggccaga attaaccatt tgggtattac taattctctt 22740
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cagtctaata ggtattcatt ttgtggtaat ggtagacatg ttctaaccat accacagaat 23160
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tatattaaat ggccttggta tgtgtggctt gccattgcat tccttaccat tatttttatt 23700
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<212> PRT
<213> 禽类传染性支气管炎病毒
<400> 2
Met Leu Asp Lys Pro Leu Leu Leu Val Thr Leu Trp Tyr Ala Leu Cys
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Ser Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Asn Thr Tyr Val Tyr Tyr Tyr Gln Ser
20 25 30
Ala Phe Arg Pro Gly Pro Gly Trp His Leu Tyr Gly Gly Ala Tyr Ala
35 40 45
Val Asp Arg Val Phe Asn Glu Thr Asn Asn Ala Gly Ser Ala Ser Asp
50 55 60
Cys Thr Ala Gly Thr Phe Tyr Glu Ser His Asn Ile Ser Ala Ser Ser
65 70 75 80
Val Ala Met Thr Val Pro His Asn Gly Met Ser Trp Ser Ala Ser Gln
85 90 95
Phe Cys Thr Ala His Cys Asn Phe Ser Asp Phe Thr Val Phe Val Thr
100 105 110
His Cys Phe Lys Asn Gln Leu Gly Ser Cys Pro Leu Thr Gly Met Ile
115 120 125
Pro Gln Asn His Ile Arg Ile Ser Ala Met Arg Asp Gly Val Leu Phe
130 135 140
Tyr Asn Leu Thr Val Ser Val Ser Lys Tyr Pro Arg Phe Lys Ser Leu
145 150 155 160
Gln Cys Val Ser Asn Ser Thr Ser Val Tyr Val Asn Gly Asp Leu Val
165 170 175
Phe Thr Ser Asn Glu Thr Ser Tyr Val Thr Gly Ala Gly Val Tyr Phe
180 185 190
Lys Ser Gly Gly Pro Val Thr Tyr Lys Val Met Lys Glu Val Lys Ala
195 200 205
Leu Ala Tyr Phe Ile Asn Gly Thr Ala Gln Glu Val Ile Leu Cys Asp
210 215 220
Asn Ser Pro Arg Gly Leu Leu Ala Cys Gln Tyr Asn Thr Gly Asn Phe
225 230 235 240
Ser Asp Gly Phe Tyr Pro Phe Thr Asn His Ser Leu Val Lys Asp Arg
245 250 255
Phe Ile Val Tyr Arg Glu Ser Ser Thr Asn Thr Thr Leu Lys Leu Thr
260 265 270
Asn Phe Ser Phe Thr Asn Val Ser Asn Ala Ser Pro Asn Ser Gly Gly
275 280 285
Val Asp Thr Phe Gln Leu Tyr Gln Thr Ser Thr Ala Gln Asp Gly Tyr
290 295 300
Tyr Asn Phe Asn Leu Ser Phe Leu Ser Ser Phe Val Tyr Lys Pro Ser
305 310 315 320
Asp Phe Met Tyr Gly Ser Tyr His Pro His Cys Lys Phe Arg Pro Glu
325 330 335
Asn Ile Asn Asn Gly Leu Trp Phe Asn Ser Leu Ser Val Ser Leu Thr
340 345 350
Tyr Gly Pro Ile Gln Gly Gly Cys Lys Gln Ser Val Phe Ser Asn Arg
355 360 365
Ala Thr Cys Cys Tyr Ala Tyr Ser Tyr Gln Gly Pro Ser Arg Cys Lys
370 375 380
Gly Val Tyr Arg Gly Glu Leu Thr Gln Tyr Phe Glu Cys Gly Leu Leu
385 390 395 400
Val Tyr Val Thr Lys Ser Asp Gly Ser Arg Ile Gln Thr Arg Ser Glu
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Pro Leu Val Leu Thr Gln Tyr Asn Tyr Asn Asn Ile Thr Leu Asn Lys
420 425 430
Cys Val Glu Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Val Gly Gln Gly Phe Ile Thr
435 440 445
Asn Val Thr Glu Ala Thr Ala Asn Tyr Ser Tyr Leu Ala Asp Gly Gly
450 455 460
Leu Ala Ile Leu Asp Thr Ser Gly Ala Ile Asp Ile Phe Val Val Gln
465 470 475 480
Gly Ala Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr Lys Val Asn Pro Cys Glu Asp Val
485 490 495
Asn Gln Gln Phe Val Val Ser Gly Gly Asn Leu Val Gly Ile Leu Thr
500 505 510
Ser His Asn Glu Thr Gly Ser Glu Ser Ile Glu Asn Gln Phe Tyr Ile
515 520 525
Lys Leu Thr Asn Gly Thr Arg Arg Ser Arg Arg Ser Val Thr Gly Asn
530 535 540
Val Thr Asn Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Gly Lys Phe Cys Ile Lys Pro
545 550 555 560
Asp Gly Ser Leu Ser Ile Ile Val Pro Gln Glu Leu Glu Gln Phe Val
565 570 575
Ala Pro Leu Phe Asn Val Thr Glu His Val Leu Ile Pro Asp Ser Phe
580 585 590
Asn Leu Thr Val Thr Asp Glu Tyr Ile Gln Thr Arg Met Asp Lys Val
595 600 605
Gln Ile Ile Cys Leu Gln Tyr Val Cys Gly Asn Ser Ile Glu Cys Arg
610 615 620
Lys Leu Phe Gln Gln Tyr Gly Pro Val Cys Asp Asn Ile Leu Ser Val
625 630 635 640
Val Asn Gly Val Gly Gln Arg Glu Asp Met Glu Leu Leu Ser Phe Tyr
645 650 655
Ser Ser Thr Lys Pro Ser Gly Tyr Asn Thr Pro Ile Phe Asn Asn Val
660 665 670
Ser Thr Gly Asp Phe Asn Ile Ser Leu Leu Leu Thr Pro Pro Asn Ser
675 680 685
Pro Thr Gly Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Thr Ser Val Glu
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Ser Val Gly Leu Pro Thr Asp Glu Glu Tyr Lys Lys Cys Thr Ala Gly
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Pro Leu Gly Phe Val Lys Asp Leu Val Cys Ala Arg Glu Tyr Asn Gly
725 730 735
Leu Leu Val Leu Pro Pro Ile Ile Thr Ala Glu Met Gln Thr Met Tyr
740 745 750
Thr Ser Ser Leu Val Ala Ser Met Ala Leu Gly Gly Ile Thr Ala Ala
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Gly Ala Ile Pro Phe Ala Thr Gln Leu Gln Ala Arg Ile Asn His Leu
770 775 780
Gly Ile Thr Asn Ser Leu Leu Leu Lys Asn Gln Glu Lys Ile Ala Ala
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Ser Phe Asn Lys Ala Ile Gly His Met Gln Glu Gly Phe Lys Ser Thr
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Ser Ser Val Ile Gln Asp Ile Tyr Gln Gln Leu Asp Ala Ile Gln Ala
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Val Leu Ala Ser Ala Lys Gln Ala Glu Tyr His Arg Val Ser Gln Gln
885 890 895
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Asn Arg Tyr Ser Phe Cys Gly Asn Gly Arg His Val Leu Thr Ile Pro
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<213> 禽类传染性支气管炎病毒
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100 105 110
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130 135 140
Ser Asp Gly Gly Pro Asp Gly Asn Phe Arg Trp Asp Phe Ile Pro Ile
145 150 155 160
Asn Arg Gly Arg Ser Gly Arg Ser Thr Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ser
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Ser Arg Ala Pro Ser Arg Glu Gly Ser Arg Gly Arg Arg Ser Gly Val
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Asp Gln Cys Val Asp Gly Val Gly Thr Arg Pro Lys Asp Asp Glu Ser
325 330 335
Arg Pro Lys Ser Arg Pro Asn Ser Arg Pro Ala Thr Arg Gly Asn Ser
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<212> PRT
<213> 禽类传染性支气管炎病毒
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Trp Tyr Thr Trp Val Val Val Pro Gly Ala Lys Gly Thr Ala Phe Val
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<211> 224
<212> PRT
<213> 禽类传染性支气管炎病毒
<400> 5
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Leu Phe Lys Glu Tyr Asn Leu Phe Val Thr Ala Phe Leu Leu Phe Leu
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35 40 45
Ile Leu Lys Met Ile Val Leu Trp Cys Phe Trp Pro Leu Asn Ile Ala
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<400> 6
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Ala Tyr Phe Val Asn Gly Thr Ala Gln Asp Val Val Leu Cys Asp Asn
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Ile Val Tyr Arg Glu Ser Ser Val Asn Thr Thr Leu Ala Leu Thr Asn
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Phe Cys Thr Ala His Cys Asn Phe Thr Asn Ile Val Val Phe Val Thr
100 105 110
His Cys Tyr Lys Ser Gly Ser Thr Val Cys Pro Leu Thr Gly Leu Ile
115 120 125
Pro Gln Asn His Ile Arg Ile Ser Ala Met Lys Gln Gly Asn Asn Gly
130 135 140
Pro Ser Gly Leu Phe Tyr Asn Leu Thr Val Pro Val Thr Lys Tyr Ser
145 150 155 160
Lys Phe Lys Ser Leu Gln Cys Val Asn Asn Gln Thr Ser Val Tyr Leu
165 170 175
Asn Gly Asp Leu Val Phe Thr Ser Asn Glu Thr Lys Asp Val Ser Gly
180 185 190
Ala Gly Val Tyr Phe Lys Ala Gly Gly Pro Ile Thr Tyr Lys Val Met
195 200 205
Arg Glu Val Lys Ala Leu Ala Tyr Phe Val Asn Gly Thr Ala His Asp
210 215 220
Val Ile Leu Cys Asp Gly Ser Pro Arg Gly Leu Leu Ala Cys Gln Tyr
225 230 235 240
Asn Thr Gly Lys Phe Ser Asp Gly Phe Tyr Pro Phe Thr Asn Asp Thr
245 250 255
Leu Val Lys Glu Lys Phe Ile Val Tyr Arg Glu Asn Ser Val Asn Thr
260 265 270
Thr Leu Thr Leu Thr Asn Phe Thr Phe Tyr Asn Glu Ser Asn Ala Leu
275 280 285
Pro Asn Asn Gly Gly Val Asp Thr Ile Gln Leu Tyr Gln Thr His Thr
290 295 300
Ala Gln Ser Gly Tyr Tyr Asn Phe Asn Phe Ser Phe Leu Ser Ser Phe
305 310 315 320
Gln Tyr Val Glu Ser Asn Phe Met Tyr Gly Ser Tyr His Pro Lys Cys
325 330 335
Gly Phe Arg Pro Glu Ser Ile Asn Asn Gly Leu Trp Phe Asn Ser Leu
340 345 350
Ser Val Ser Leu Ala Tyr Gly Pro Leu Gln Gly Gly Cys Lys Gln Ser
355 360 365
Val Phe His Gly Arg Ala Thr Cys Cys Tyr Ala Tyr Ser Tyr Asn Gly
370 375 380
Pro Thr Leu Cys Lys Gly Val Tyr Ser Gly Glu Leu Thr Arg Ser Tyr
385 390 395 400
Gln Cys Gly Leu Leu Val Phe Val Thr Lys Ser Asp Gly Ser Arg Ile
405 410 415
Gln Thr Ser Thr Lys Pro Ile Val Leu Thr Gln His Asn Tyr Asn Asn
420 425 430
Ile Thr Leu Asp Arg Cys Val Glu Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Val Gly
435 440 445
Gln Gly Phe Ile Thr Asn Val Thr Glu Ser Ala Ala Ala Phe Asn Tyr
450 455 460
Leu Glu Asp Gly Gly Leu Ala Ile Leu Asp Thr Ser Gly Ala Ile Asp
465 470 475 480
Ile Phe Val Val Gln Gly Glu Tyr Gly Phe Asn Tyr Tyr Lys Val Asn
485 490 495
Pro Cys Glu Asp Val Asn Gln Gln Phe Val Val Ser Gly Gly Asn Leu
500 505 510
Val Gly Ile Leu Thr Ser Ile Asn Gln Thr Gly Ser Gln Ser Ile Glu
515 520 525
Asn Gln Phe Tyr Val Lys Leu Thr Asn Gly Ser Arg Arg Ser Arg Arg
530 535 540
Ser Val Ser Glu Asn Val Thr Ser Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Gly Lys
545 550 555 560
Phe Cys Ile Lys Pro Asp Gly Ser Leu Ser Thr Ile Val Pro Lys Glu
565 570 575
Leu Glu Gln Phe Val Ala Pro Leu Leu Asn Val Thr Glu His Val Leu
580 585 590
Ile Pro Asp Ser Phe Asn Leu Thr Val Thr Asp Glu Tyr Ile Gln Thr
595 600 605
Arg Met Asp Lys Val Gln Ile Asn Cys Leu Gln Tyr Val Cys Gly Asn
610 615 620
Ser Phe Glu Cys Arg Lys Leu Phe Gln Gln Tyr Gly Pro Val Cys Asp
625 630 635 640
Asn Ile Leu Ser Val Val Asn Ser Val Gly Gln Lys Glu Asp Met Glu
645 650 655
Leu Leu Ser Phe Tyr Ser Ser Thr Lys Pro Ser Gly Ile Ser Gln Pro
660 665 670
Leu Phe Asn Asn Phe Ser Thr Gly Asp Phe Asn Ile Ser Leu Leu Leu
675 680 685
Thr Ser Pro Ser Ser Pro Ser Gly Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu
690 695 700
Phe Thr Ser Val Glu Ser Val Gly Leu Pro Thr Asp Glu Ala Tyr Lys
705 710 715 720
Lys Cys Thr Ser Gly Pro Leu Gly Phe Val Lys Asp Leu Val Cys Ala
725 730 735
Arg Glu Tyr Asn Gly Leu Leu Val Leu Pro Pro Ile Ile Thr Ala Glu
740 745 750
Met Gln Thr Met Tyr Thr Ser Ser Leu Val Ala Ser Met Ala Leu Gly
755 760 765
Gly Ile Thr Ala Ala Gly Ala Ile Pro Phe Ala Thr Gln Leu Gln Ala
770 775 780
Arg Ile Asn His Leu Gly Ile Thr Gln Ser Leu Leu Met Lys Asn Gln
785 790 795 800
Glu Lys Ile Ala Ala Ser Phe Asn Arg Ala Ile Gly His Met Gln Glu
805 810 815
Gly Phe Lys Ser Thr Ser Leu Ala Leu Gln Gln Ile Gln Asp Val Val
820 825 830
Asn Lys Gln Ser Ala Ile Leu Thr Glu Thr Met Ala Ser Leu Asn Lys
835 840 845
Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Gln Asp Ile Tyr Gln Gln Leu
850 855 860
Asp Val Ile Gln Ala Asp Ala Gln Val Asp Arg Ile Ile Thr Gly Arg
865 870 875 880
Leu Ser Ser Leu Ser Val Leu Ala Ser Ala Lys Gln Ser Glu Tyr Ile
885 890 895
Ala Val Ser Gln Gln Arg Ala Leu Ala Thr Gln Lys Ile Asn Glu Cys
900 905 910
Val Lys Ser Gln Ser Thr Arg Tyr Ser Phe Cys Gly Asn Gly Arg His
915 920 925
Val Leu Thr Ile Pro Gln Asn Ala Pro Asn Gly Ile Val Phe Ile His
930 935 940
Phe Thr Tyr Thr Pro Glu Ser Phe Val Asn Val Thr Ala Ile Val Gly
945 950 955 960
Phe Cys Val Lys Pro Pro Asn Ala Ser His Tyr Ala Ile Val Pro Val
965 970 975
Asn Gly Arg Gly Ile Phe Ile Gln Val Asn Gly Thr Tyr Tyr Ile Thr
980 985 990
Ser Arg Asp Met Tyr Met Pro Arg Asn Ile Thr Ala Gly Asp Ile Val
995 1000 1005
Thr Leu Thr Ser Cys Gln Ala Asn Tyr Val Ser Val Asn Lys Thr
1010 1015 1020
Val Ile Ser Thr Phe Val Glu Asp Asp Asp Phe Asp Phe Asp Asp
1025 1030 1035
Glu Leu Ser Lys Trp Trp Asn Asp Thr Lys His Glu Leu Pro Asp
1040 1045 1050
Phe Asp Glu Phe Asn Tyr Thr Ile Pro Val Leu Asn Ile Ser Asn
1055 1060 1065
Glu Ile Asp Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Gly Leu Asn Asp Ser
1070 1075 1080
Leu Ile Asp Leu Glu Thr Leu Ser Ile Leu Lys Thr Tyr Ile Lys
1085 1090 1095
Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Ala Ile Phe Phe Ala Ile Val Ile
1100 1105 1110
Phe Ile Leu Ile Ile Gly Trp Val Phe Phe Met Thr Gly Cys Cys
1115 1120 1125
Gly Cys Cys Cys Gly Cys Phe Gly Ile Ile Pro Leu Met Asn Lys
1130 1135 1140
Cys Gly Lys Lys Ser Ser Tyr Tyr Thr Thr Phe Asp Asn Asp Val
1145 1150 1155
Val Thr Glu Gln Tyr Arg Pro Lys Lys Ser Val
1160 1165
<210> 17
<211> 1082
<212> PRT
<213> 禽类传染性支气管炎病毒
<400> 17
Ser Leu Tyr Asn Asn Asp Ser Tyr Val Tyr Tyr Tyr Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Arg Pro Phe Asn Gly Trp His Leu His Gly Gly Ala Tyr Ala Val Val
20 25 30
Asn Val Ser Gln Glu Thr Ala Asn Ala Gly Ser Ser Pro Ser Cys Thr
35 40 45
Ala Gly Ala Ile Tyr Trp Ser Lys Asn Phe Thr Ala Ser Ser Val Ala
50 55 60
Met Thr Ala Pro Leu Gln Gly Met Gln Trp Ser Thr Ile Gln Phe Cys
65 70 75 80
Thr Ala His Cys Asn Phe Thr Asn Ile Val Val Phe Val Thr His Cys
85 90 95
Tyr Lys Ser Gly Ser Thr Val Cys Pro Leu Thr Gly Leu Ile Pro Gln
100 105 110
Asn His Ile Arg Ile Ser Ala Met Lys Gln Gly Asn Asn Gly Pro Ser
115 120 125
Gly Leu Phe Tyr Asn Leu Thr Val Pro Val Thr Lys Tyr Ser Lys Phe
130 135 140
Lys Ser Leu Gln Cys Val Asn Asn Gln Thr Ser Val Tyr Leu Asn Gly
145 150 155 160
Asp Leu Val Phe Thr Ser Asn Glu Thr Lys Asp Val Ser Gly Ala Gly
165 170 175
Val Tyr Phe Lys Ala Gly Gly Pro Ile Thr Tyr Lys Val Met Arg Glu
180 185 190
Val Lys Ala Leu Ala Tyr Phe Val Asn Gly Thr Ala His Asp Val Ile
195 200 205
Leu Cys Asp Gly Ser Pro Arg Gly Leu Leu Ala Cys Gln Tyr Asn Thr
210 215 220
Gly Lys Phe Ser Asp Gly Phe Tyr Pro Phe Thr Asn Asp Thr Leu Val
225 230 235 240
Lys Glu Lys Phe Ile Val Tyr Arg Glu Asn Ser Val Asn Thr Thr Leu
245 250 255
Thr Leu Thr Asn Phe Thr Phe Tyr Asn Glu Ser Asn Ala Leu Pro Asn
260 265 270
Asn Gly Gly Val Asp Thr Ile Gln Leu Tyr Gln Thr His Thr Ala Gln
275 280 285
Ser Gly Tyr Tyr Asn Phe Asn Phe Ser Phe Leu Ser Ser Phe Gln Tyr
290 295 300
Val Glu Ser Asn Phe Met Tyr Gly Ser Tyr His Pro Lys Cys Gly Phe
305 310 315 320
Arg Pro Glu Ser Ile Asn Asn Gly Leu Trp Phe Asn Ser Leu Ser Val
325 330 335
Ser Leu Ala Tyr Gly Pro Leu Gln Gly Gly Cys Lys Gln Ser Val Phe
340 345 350
His Gly Arg Ala Thr Cys Cys Tyr Ala Tyr Ser Tyr Asn Gly Pro Thr
355 360 365
Leu Cys Lys Gly Val Tyr Ser Gly Glu Leu Thr Arg Ser Tyr Gln Cys
370 375 380
Gly Leu Leu Val Phe Val Thr Lys Ser Asp Gly Ser Arg Ile Gln Thr
385 390 395 400
Ser Thr Lys Pro Ile Val Leu Thr Gln His Asn Tyr Asn Asn Ile Thr
405 410 415
Leu Asp Arg Cys Val Glu Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Val Gly Gln Gly
420 425 430
Phe Ile Thr Asn Val Thr Glu Ser Ala Ala Ala Phe Asn Tyr Leu Glu
435 440 445
Asp Gly Gly Leu Ala Ile Leu Asp Thr Ser Gly Ala Ile Asp Ile Phe
450 455 460
Val Val Gln Gly Glu Tyr Gly Phe Asn Tyr Tyr Lys Val Asn Pro Cys
465 470 475 480
Glu Asp Val Asn Gln Gln Phe Val Val Ser Gly Gly Asn Leu Val Gly
485 490 495
Ile Leu Thr Ser Ile Asn Gln Thr Gly Ser Gln Ser Ile Glu Asn Gln
500 505 510
Phe Tyr Val Lys Leu Thr Asn Gly Ser Arg Arg Ser Arg Arg Ser Val
515 520 525
Ser Glu Asn Val Thr Ser Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Gly Lys Phe Cys
530 535 540
Ile Lys Pro Asp Gly Ser Leu Ser Thr Ile Val Pro Lys Glu Leu Glu
545 550 555 560
Gln Phe Val Ala Pro Leu Leu Asn Val Thr Glu His Val Leu Ile Pro
565 570 575
Asp Ser Phe Asn Leu Thr Val Thr Asp Glu Tyr Ile Gln Thr Arg Met
580 585 590
Asp Lys Val Gln Ile Asn Cys Leu Gln Tyr Val Cys Gly Asn Ser Phe
595 600 605
Glu Cys Arg Lys Leu Phe Gln Gln Tyr Gly Pro Val Cys Asp Asn Ile
610 615 620
Leu Ser Val Val Asn Ser Val Gly Gln Lys Glu Asp Met Glu Leu Leu
625 630 635 640
Ser Phe Tyr Ser Ser Thr Lys Pro Ser Gly Ile Ser Gln Pro Leu Phe
645 650 655
Asn Asn Phe Ser Thr Gly Asp Phe Asn Ile Ser Leu Leu Leu Thr Ser
660 665 670
Pro Ser Ser Pro Ser Gly Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Thr
675 680 685
Ser Val Glu Ser Val Gly Leu Pro Thr Asp Glu Ala Tyr Lys Lys Cys
690 695 700
Thr Ser Gly Pro Leu Gly Phe Val Lys Asp Leu Val Cys Ala Arg Glu
705 710 715 720
Tyr Asn Gly Leu Leu Val Leu Pro Pro Ile Ile Thr Ala Glu Met Gln
725 730 735
Thr Met Tyr Thr Ser Ser Leu Val Ala Ser Met Ala Leu Gly Gly Ile
740 745 750
Thr Ala Ala Gly Ala Ile Pro Phe Ala Thr Gln Leu Gln Ala Arg Ile
755 760 765
Asn His Leu Gly Ile Thr Gln Ser Leu Leu Met Lys Asn Gln Glu Lys
770 775 780
Ile Ala Ala Ser Phe Asn Arg Ala Ile Gly His Met Gln Glu Gly Phe
785 790 795 800
Lys Ser Thr Ser Leu Ala Leu Gln Gln Ile Gln Asp Val Val Asn Lys
805 810 815
Gln Ser Ala Ile Leu Thr Glu Thr Met Ala Ser Leu Asn Lys Asn Phe
820 825 830
Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Gln Asp Ile Tyr Gln Gln Leu Asp Val
835 840 845
Ile Gln Ala Asp Ala Gln Val Asp Arg Ile Ile Thr Gly Arg Leu Ser
850 855 860
Ser Leu Ser Val Leu Ala Ser Ala Lys Gln Ser Glu Tyr Ile Ala Val
865 870 875 880
Ser Gln Gln Arg Ala Leu Ala Thr Gln Lys Ile Asn Glu Cys Val Lys
885 890 895
Ser Gln Ser Thr Arg Tyr Ser Phe Cys Gly Asn Gly Arg His Val Leu
900 905 910
Thr Ile Pro Gln Asn Ala Pro Asn Gly Ile Val Phe Ile His Phe Thr
915 920 925
Tyr Thr Pro Glu Ser Phe Val Asn Val Thr Ala Ile Val Gly Phe Cys
930 935 940
Val Lys Pro Pro Asn Ala Ser His Tyr Ala Ile Val Pro Val Asn Gly
945 950 955 960
Arg Gly Ile Phe Ile Gln Val Asn Gly Thr Tyr Tyr Ile Thr Ser Arg
965 970 975
Asp Met Tyr Met Pro Arg Asn Ile Thr Ala Gly Asp Ile Val Thr Leu
980 985 990
Thr Ser Cys Gln Ala Asn Tyr Val Ser Val Asn Lys Thr Val Ile Ser
995 1000 1005
Thr Phe Val Glu Asp Asp Asp Phe Asp Phe Asp Asp Glu Leu Ser
1010 1015 1020
Lys Trp Trp Asn Asp Thr Lys His Glu Leu Pro Asp Phe Asp Glu
1025 1030 1035
Phe Asn Tyr Thr Ile Pro Val Leu Asn Ile Ser Asn Glu Ile Asp
1040 1045 1050
Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Gly Leu Asn Asp Ser Leu Ile Asp
1055 1060 1065
Leu Glu Thr Leu Ser Ile Leu Lys Thr Tyr Ile Lys Trp Pro
1070 1075 1080
<210> 18
<211> 11860
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有IBV的质粒
<400> 18
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ggagatcggt acttcgcgaa 420
tgcgtcgaga tgagctctaa tacgactcac tatagggact taagtgtgat ataaatatat 480
atcatacata ctagccttgt gctagatttc caacttaaca aaacggactt aaatacctac 540
agttggtccc tataggtgtt ccattgcagt gcactttagt gccctggatg gcacctggcc 600
acctgtcagg tttttgttat taaaataata ttgttgctgg tatcactgct tgttttgccg 660
tgtctcactt tatacatccg ttgcttgggc tacctagtat ccagcgtcct actggcgttg 720
tggtcggttc gagtgcgaag aacctctggt tcatctagcg gtacgcgggt gtgtggaagt 780
agcgcttcag acgtaccggt tctgttgcgt gaaatacggg gtcacctccc cccacatacc 840
tctaagggct tttgagccta gcgttgggct acgttctcgc acaaggtcgg ctatacggcg 900
tttgtagggg gtagtgccaa acaacccctg aggtgacagg ttctggtggt gtttcgaaaa 960
caacaatgtg tgtgccgcat aatatgcgag taatgcattt tggagcagga agtgacaaag 1020
gagtggcccc aggtagcgct gttcttaggc agtggcttcc cgaaggtaca ctccttgtcg 1080
ataatgatat tgtagattat gtatctgatg cacatgtctc tgtgctttca gattgcaata 1140
aatgtaaaac agagcacaag tttgatcttg tgatatctga tatgtataca gataatgatt 1200
caaagagaaa gcatgaaggc gttgtagcca ataacggcaa tgatgacgtc ttcatatacc 1260
tttcaaactt tcttcgtaac aatttagctc tgggaggcag ttttgccgta aaagtaacag 1320
agacaagttg gcatgagagt ttatatgaca ttgcacagga ttgtgcatgg tggacaatgt 1380
tttgtacagc agtgaatgct tcttcgtcag aagcattctt gattggtgtt aattatttgg 1440
gtgcaagtga aaaggttaga gttagtggta aaaccctgca cgcaaattat atattttgga 1500
ggaattgtaa ttatttacaa acttcagcct atagtatatt tgacgttgct aagtttgatt 1560
tgaaattaaa agcaacgcca gttgtgaatt tgaaaactga acaaaagaca gacttagtct 1620
ttaatttaat taagtgtggt aagttactgg taagagatgt tggacaaacc gcttttacta 1680
gtgactcttt ggtatgcact atgtagtgct ttgctctatg ataataatta tattggtgat 1740
tttagatgta tccagcttgt gaactcaaac ggtgctaatg ttagtgctcc aagcattagc 1800
actgagaccg ttgaagtttc acaaggcctg gggacatatt atgtgttaga tcgagtttat 1860
ttaaatgcca cattattgct tactggttac tacccggtcg atggttctaa gtttagaaac 1920
ctcgctctta cgggaactaa ctcagttagc ttgtcgtggt ttcaaccacc ctatttaagt 1980
cagtttaatg atggcatatt tgcgaaggtg cagaacctta agacaagtac gccatcaggt 2040
gcaactgcat attttcctac tatagttata ggtagtttgt ttggctatac ttcctatacc 2100
gttgtaatag agccatataa tggtgttata atggcctcag tgtgccagta taccatttgt 2160
cagttacctt acactgattg taagcctaac actaatggta ataagcttat agggttttgg 2220
cacacggatg taaaaccccc aatttgtgtg ttaaagcgaa atttcacgct taatgttaat 2280
gctgatgcat tttattttca tttttaccaa catggtggta ctttttatgc gtactatgcg 2340
gataaaccct ccgctactac gtttttgttt agtgtatata ttggcgatat tttaacacag 2400
tattatgtgt tacctttcat ctgcaaccca acagctggta gcacttttgc tccgcgctat 2460
tgggttacac ctttggttaa gcgccaatat ttgtttaatt tcaaccagaa gggtgtcatt 2520
actagtgctg ttgattgtgc tagtagttat accagtgaaa taaaatgtaa gacccagagc 2580
atgttaccta gcactggtgt ctatgagtta tccggttata cggtccaacc agttggagtt 2640
gtataccggc gtgttgctaa cctcccagct tgtaatatag aggagtggct tactgctagg 2700
tcagtcccct cccctctcaa ctgggagcgt aagacttttc agaattgtaa ttttaattta 2760
agcagcctgt tacgttatgt tcaggctgag agtttgtttt gtaataatat cgatgcttcc 2820
aaagtgtatg gcaggtgctt tggtagtatt tcagttgata agtttgctgt accccgaagt 2880
aggcaagttg atttacagct tggtaactct ggatttctgc agactgctaa ttataagatt 2940
gatacagctg ccacttcgtg tcagctgcat tacaccttgc ctaagaataa tgtcaccata 3000
aacaaccata acccctcgtc ttggaatagg aggtatggct ttaatgatgc tggcgtcttt 3060
ggcaaaaacc aacatgacgt tgtttacgct cagcaatgtt ttactgtaag atctagttat 3120
tgcccgtgtg ctcaaccgga catagttagc ccttgcacta ctcagactaa gcctaagtct 3180
gcttttgtta atgtgggtga ccattgtgaa ggcttaggtg ttttagaaga taattgtggc 3240
aatgctgatc cacataaggg ttgtatctgt gccaacaatt catttattgg atggtcacat 3300
gatacctgcc ttgttaatga tcgctgccaa atttttgcta atatattgtt aaatggcatt 3360
aatagtggta ccacatgttc cacagatttg cagttgccta atactgaagt ggttactggc 3420
atttgtgtca aatatgacct ctacggtatt actggacaag gtgtttttaa agaggttaag 3480
gctgactatt ataatagctg gcaaaccctt ctgtatgatg ttaatggtaa tttgaatggt 3540
tttcgtgatc ttaccactaa caagacttat acgataagga gctgttatag tggccgtgtt 3600
tctgctgcat ttcataaaga tgcacccgaa ccggctctgc tctatcgtaa tataaattgt 3660
agctatgttt ttagcaataa tatttcccgt gaggagaacc cacttaatta ctttgatagt 3720
tatttgggtt gtgttgttaa tgctgataac cgcacggatg aggcgcttcc taattgtgat 3780
ctccgtatgg gtgctggctt atgcgttgat tattcaaaat cacgcagggc tcaccgatca 3840
gtttctactg gctatcggtt aactacattt gagccataca ctccgatgtt agttaatgat 3900
agtgtccaat ccgttgatgg attatatgag atgcaaatac caaccaattt tactattggg 3960
caccatgagg agttcattca aactagatct ccaaaggtga ctatagattg tgctgcattt 4020
gtctgtggtg ataacactgc atgcaggcag cagttggttg agtatggctc tttctgtgtt 4080
aatgttaatg ccattcttaa tgaggttaat aacctcttgg ataatatgca actacaagtt 4140
gctagtgcat taatgcaggg tgttactata agttcgagac tgccagacgg catctcaggc 4200
cctatagatg acattaattt tagtcctcta cttggatgca taggttcaac atgtgctgaa 4260
gacggcaatg gacctagtgc aatccgaggg cgttctgcta tagaggattt gttatttgac 4320
aaggtcaaat tatctgatgt tggctttgtc gaggcttata ataattgcac cggtggtcaa 4380
gaagttcgtg acctcctttg tgtacaatct tttaatggca tcaaagtatt acctcctgtg 4440
ttgtcagaga gtcagatctc tggctacaca accggtgcta ctgcggcagc tatgttccca 4500
ccgtggtcag cagctgccgg tgtgccattt agtttaagtg ttcaatatag aattaatggt 4560
ttaggtgtca ctatgaatgt gcttagtgag aaccaaaaga tgattgctag tgcttttaac 4620
aatgcgctgg gtgctatcca ggatgggttt gatgcaacca attctgcttt aggtaagatc 4680
cagtccgttg ttaatgcaaa tgctgaagca ctcaataact tactaaatca actttctaac 4740
aggtttggtg ctattagtgc ttctttacaa gaaattctaa ctcggcttga ggctgtagaa 4800
gcaaaagccc agatagatcg tcttattaat ggcaggttaa ctgcacttaa tgcgtatata 4860
tccaagcaac ttagtgatag tacgcttatt aaagttagtg ctgctcaggc catagaaaag 4920
gtcaatgagt gcgttaagag ccaaaccacg cgtattaatt tctgtggcaa tggtaatcat 4980
atattatctc ttgtccagaa tgcgccttat ggcttatatt ttatacactt cagctatgtg 5040
ccaatatcct ttacaaccgc aaatgtgagt cctggacttt gcatttctgg tgatagagga 5100
ttagcaccta aagctggata ttttgttcaa gatgatggag aatggaagtt cacaggcagt 5160
tcatattact accctgaacc cattacagat aaaaacagtg tcattatgag tagttgcgca 5220
gtaaactaca caaaggcacc tgaagttttc ttgaacactt caatacctaa tccacccgac 5280
tttaaggagg agttagataa atggtttaag aatcagacgt ctattgcgcc tgatttatct 5340
ctcgatttcg agaagttaaa tgttactttg ctggacctga cgtatgagat gaacaggatt 5400
caggatgcaa ttaagaagtt aaatgagagc tacatcaacc tcaaggaagt tggcacatat 5460
gaaatgtatg tgaaatggcc ttggtatgtg tggcttgcca ttgcattcct taccattatt 5520
tttattctgg tactttgttg gatatttttc atgaccggtt gttgcggttg ttgttgtgga 5580
tgctttggta tcataccgtt aatgagtaag tgtggtaaga aatcttctta ctacacgact 5640
tttgataatg atgtggtaac ttaacaatac agacctaaaa agtctgttta atgattaaaa 5700
gtcccacatc ttttctaata ttattaattc ttctttggtg taaacttgca ttaagttgtt 5760
ttaaagagtg tgttataaca ctccagcaac tagtacaaat tttactccaa attattaata 5820
gtaacttaca atctagactt ctgctttggc acagtctaga ctaatgttag attttgaagc 5880
aattattgaa actggtcagc aaataactca acaaattagt ttctatttac agcatatttc 5940
aagggtgcta agtactgaat tatttgaccc ctttgaagtt tgtgtttaca gaggaggtaa 6000
ttgttgggag ttagagtcag ctgacgagtt ttcaggtgat gacgaatata ttgagtagat 6060
cgctcgagga gaacggaagt tttctaacag cggtttacgt gtttttagga tttttagcac 6120
tttatctact aggtagagcg cttcaagctt ttgtacaagc ggctgacgct tgttgtcttt 6180
tttggtatac atgggtagta gttcctggag ccaagggcac agcctttgtt tataatcata 6240
catatggtaa aaaacttaac aaaccggagt tagaaacggt tattgttaac gaatttccaa 6300
aaaacggttg gaaatatgga taataccatc aattgtactc ttggtactga acaagcagtt 6360
cagcttttta aggaatataa tctgtttgta actgcattcc tgttgttttt aaccatacta 6420
cttcagtatg gatacgcaac taggagcaag gttatttaca tactgaaaat gatagtgtta 6480
tggtgctttt ggccccttaa cattgcagta ggtgtaatct catgtatata cccaccaaac 6540
acaggaggtc ttgtcgcagc gataattctt acagtgtttg cgtgtctttc ttttataggt 6600
tattggatcc agagtattag actttttaag cggtgcaggt catggtggtc atttaacccc 6660
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cagtggcttg ctaaatgtga accagaccac ttgcctagag atatatttgt atgcacaccg 6840
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 9540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagcggccg catcggatgc cgggaccgac 9600
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<210> 19
<211> 3489
<212> DNA
<213> 禽类传染性支气管炎病毒
<400> 19
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tctgtttaa 3489
<210> 20
<211> 3495
<212> DNA
<213> 禽类传染性支气管炎病毒
<400> 20
atgttggaca aaccgctttt actagtgact ctttggtatg cactatgtag tgctttgctc 60
tatgataata atacttacgt ttactactac caaagtgcct ttaggcctgg tccaggttgg 120
cacctatatg ggggtgctta tgcagtagat agggttttta atgaaaccaa caatgcaggc 180
agtgcatctg attgcactgc tggtactttt tatgaaagcc ataatatttc tgcttcttct 240
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attgaatgca gaaagttgtt tcagcagtat ggacctgttt gtgataatat attgtctgtt 1920
gtaaatggtg taggtcaaag agaggatatg gaacttttaa gtttctattc ttctactaaa 1980
cctagtggtt acaatacacc aatttttaat aatgttagca ctggtgactt taatatttcg 2040
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tcctttaata aggccatcgg tcatatgcag gaagggttta aaagtacttc tctagcatta 2460
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gctattcagg cagatgctca ggttgatcgt cttattacag gtagactctc ttcactatct 2640
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ggtagacatg ttctaaccat accacagaat gcacccaatg gcatagtgtt tatacacttt 2820
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ggttgttgcg gttgttgttg tggatgcttt ggtatcatac cgttaatgag taagtgtggt 3420
aagaaatctt cttactacac gacttttgat aatgatgtgg taacttaaca atacagacct 3480
aaaaagtctg tttaa 3495
<210> 21
<211> 11320
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有IBV的质粒
<400> 21
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ggagatcggt acttcgcgaa 420
tgcgtcgaga tgagctctaa tacgactcac tatagggact taagtgtgat ataaatatat 480
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acctgtcagg tttttgttat taaaataata ttgttgctgg tatcactgct tgttttgccg 660
tgtctcactt tatacatccg ttgcttgggc tacctagtat ccagcgtcct actggcgttg 720
tggtcggttc gagtgcgaag aacctctggt tcatctagcg gtacgcgggt gtgtggaagt 780
agcgcttcag acgtaccggt tctgttgcgt gaaatacggg gtcacctccc cccacatacc 840
tctaagggct tttgagccta gcgttgggct acgttctcgc acaaggtcgg ctatacggcg 900
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caacaatgtg tgtgccgcat aatatgcgag taatgcattt tggagcagga agtgacaaag 1020
gagtggcccc aggtagcgct gttcttaggc agtggcttcc cgaaggtaca ctccttgtcg 1080
ataatgatat tgtagattat gtatctgatg cacatgtctc tgtgctttca gattgcaata 1140
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gtgcaagtga aaaggttaga gttagtggta aaaccctgca cgcaaattat atattttgga 1500
ggaattgtaa ttatttacaa acttcagcct atagtatatt tgacgttgct aagtttgatt 1560
tgaaattaaa agcaacgcca gttgtgaatt tgaaaactga acaaaagaca gacttagtct 1620
ttaatttaat taagtgtggt aagttactgg taagagatgt tggacaaacc gcttttacta 1680
gtgactcttt ggtatgcact atgtagtgct ttgctctatg ataataatac ttacgtttac 1740
tactaccaaa gtgcctttag gcctggtcca ggttggcacc tatatggggg tgcttatgca 1800
gtagataggg tttttaatga aaccaacaat gcaggcagtg catctgattg cactgctggt 1860
actttttatg aaagccataa tatttctgct tcttctgtag ccatgacagt accacataat 1920
ggtatgtctt ggtcagcttc acaattttgt acagctcatt gtaacttctc agactttaca 1980
gtgttcgtta cgcattgttt taaaaatcaa ctcggtagtt gtcccttgac aggtatgatt 2040
cctcagaatc atattcgtat ttctgctatg agagatggag ttttgtttta taacttaaca 2100
gttagcgtat ctaaataccc tagatttaaa tcgcttcaat gtgttagcaa ttctacatct 2160
gtctatgtaa atggtgacct tgttttcact tctaatgaaa cttcttacgt tacgggtgca 2220
ggcgtttatt ttaaaagtgg tgggcctgta acttataaag ttatgaaaga agttaaagcc 2280
ctagcctact ttattaatgg taccgcacaa gaggttattt tatgtgataa ctcacctaga 2340
ggtttgcttg catgtcagta taacactggt aatttttcag atggattcta cccttttact 2400
aatcattctt tagttaagga taggtttatt gtatatcgag aaagtagcac taacactact 2460
ttaaagttaa ctaatttcag ttttactaat gtaagtaatg cttctcctaa ttcaggtggc 2520
gttgatactt tccaattata tcaaacaagt actgctcagg atggttatta taattttaat 2580
ttatcatttc tgagtagttt tgtgtataaa ccatctgatt ttatgtatgg gtcataccac 2640
ccacattgta agtttagacc agagaatatt aataatggct tatggtttaa ttcattatct 2700
gtgtcactta cttacggacc cattcaaggt ggttgtaagc aatctgtttt tagtaataga 2760
gcaacttgtt gctatgctta ttcttatcaa gggcctagta gatgtaaggg tgtttataga 2820
ggggagctaa cgcaatactt tgaatgtgga cttctagttt acgtaactaa gagtgatggc 2880
tctcgtatac aaactagaag tgaaccactg gtgttaactc aatataatta taacaacatt 2940
actttaaata agtgtgttga gtataatata tatggtaggg ttggtcaagg ttttattact 3000
aatgtaactg aagcaactgc taattatagt tatctagcag atggtggttt agctatttta 3060
gatacctcag gagccataga catatttgtt gttcaaggtg catatggtct taattattat 3120
aaggttaatc cctgtgaaga tgttaaccaa cagtttgtag tgtctggtgg caacttagtt 3180
ggcattctta catctcataa tgaaacaggt tctgaatcta ttgagaacca gttttacatc 3240
aaactcacta acggaacacg tcgctctaga cgttctgtta ctgggaatgt tacaaattgc 3300
ccttatgtta gttatggcaa gttttgtata aaaccagatg gttctttatc tataatagta 3360
ccacaagaat tagaacagtt tgtggcgcct ttattcaatg ttactgagca tgtgctcata 3420
cctgatagtt ttaatttaac tgtcacagat gagtacatac aaactcgtat ggataaggtt 3480
caaattattt gccttcagta tgtttgtggt aattctattg aatgcagaaa gttgtttcag 3540
cagtatggac ctgtttgtga taatatattg tctgttgtaa atggtgtagg tcaaagagag 3600
gatatggaac ttttaagttt ctattcttct actaaaccta gtggttacaa tacaccaatt 3660
tttaataatg ttagcactgg tgactttaat atttcgctcc tactaacacc acctaatagt 3720
cctactgggc gctcttttat tgaagatctt ctctttacaa gtgtagaatc tgttggatta 3780
ccaactgatg aagagtataa aaagtgtaca gcaggacctt taggttttgt taaagacctt 3840
gtttgtgcta gagagtataa tggtttgctc gttctgcctc ctattattac tgcggaaatg 3900
caaaccatgt atactagttc tttagtagcc tctatggctt taggtggcat tactgcagct 3960
ggtgctatac cttttgctac acaactgcag gccagaatta accatttggg tattactaat 4020
tctcttttgt tgaaaaacca agaaaaaatt gctgcttcct ttaataaggc catcggtcat 4080
atgcaggaag ggtttaaaag tacttctcta gcattacaac agattcaaga tgttgttaat 4140
aaacagagtt ctattcttac agagactatg caatcactta ataaaaattt tggtgctatt 4200
tcctctgtaa ttcaagacat ttaccagcaa ctagatgcta ttcaggcaga tgctcaggtt 4260
gatcgtctta ttacaggtag actctcttca ctatctgttt tagcttctgc taaacaggca 4320
gagtatcata gagtgtcaca acagcgtgag ttggccactc agaaaattaa tgagtgtgtt 4380
aagtctcagt ctaataggta ttcattttgt ggtaatggta gacatgttct aaccatacca 4440
cagaatgcac ccaatggcat agtgtttata cactttacat acactccaga gagttttgtt 4500
aatgttacgg caatagtagg gttttgcgta aacccagcta atgctagtca ttatgcaata 4560
gtgcctgtta atggcagggg tgtttttata gaagttaatg gtagttacta tatcactgct 4620
cgtgatatgt atatgccaag agatattact gcaggagaca tagtcacttt gacttcttgt 4680
caagcaaact atgttaatgt aaataaaacc gtcattaaca cttttgtgga agatgacgat 4740
tttgattttt atgatgaatt gtcaaaatgg tggaatgata ctaagcatga gctaccagat 4800
tttgatgaat tcaattatac cgttccagtt ttaaatatta gtaatgaaat tgacagaatt 4860
caacaggtta ttcagggatt aaatgattcc ctaatagacc ttgaaacact ctcaattctc 4920
aaaacttata ttaaatggcc ttggtatgtg tggcttgcca ttgcattcct taccattatt 4980
tttattctgg tactttgttg gatatttttc atgaccggtt gttgcggttg ttgttgtgga 5040
tgctttggta tcataccgtt aatgagtaag tgtggtaaga aatcttctta ctacacgact 5100
tttgataatg atgtggtaac ttaacaatac agacctaaaa agtctgttta atgattaaaa 5160
gtcccacatc ttttctaata ttattaattc ttctttggtg taaacttgca ttaagttgtt 5220
ttaaagagtg tgttataaca ctccagcaac tagtacaaat tttactccaa attattaata 5280
gtaacttaca atctagactt ctgctttggc acagtctaga ctaatgttag attttgaagc 5340
aattattgaa actggtcagc aaataactca acaaattagt ttctatttac agcatatttc 5400
aagggtgcta agtactgaat tatttgaccc ctttgaagtt tgtgtttaca gaggaggtaa 5460
ttgttgggag ttagagtcag ctgacgagtt ttcaggtgat gacgaatata ttgagtagat 5520
cgctcgagga gaacggaagt tttctaacag cggtttacgt gtttttagga tttttagcac 5580
tttatctact aggtagagcg cttcaagctt ttgtacaagc ggctgacgct tgttgtcttt 5640
tttggtatac atgggtagta gttcctggag ccaagggcac agcctttgtt tataatcata 5700
catatggtaa aaaacttaac aaaccggagt tagaaacggt tattgttaac gaatttccaa 5760
aaaacggttg gaaatatgga taataccatc aattgtactc ttggtactga acaagcagtt 5820
cagcttttta aggaatataa tctgtttgta actgcattcc tgttgttttt aaccatacta 5880
cttcagtatg gatacgcaac taggagcaag gttatttaca tactgaaaat gatagtgtta 5940
tggtgctttt ggccccttaa cattgcagta ggtgtaatct catgtatata cccaccaaac 6000
acaggaggtc ttgtcgcagc gataattctt acagtgtttg cgtgtctttc ttttataggt 6060
tattggatcc agagtattag actttttaag cggtgcaggt catggtggtc atttaacccc 6120
gaatctaatg ccgtaggttc aatactccta actaatggtc aacaatgtaa ttttgctata 6180
gagagtgtgc cgatggtgct ttctcctatt ataaagaatg gtgctcttta ttgcgagggt 6240
cagtggcttg ctaaatgtga accagaccac ttgcctagag atatatttgt atgcacaccg 6300
gatagacgta atatctatcg tatggtgcaa aaatatactg gtgaccaaag cggaagtaag 6360
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gtgtcagcag taggaggtag tctttacaca taaatgtgtg tgtgtagaga gtatttaaaa 6480
ttattctttg acagtgcctc cgttttaaga gcgcggaaga gtattatttt tgaggatatt 6540
aatataaatc ctctttgttt catactctcc tttcaggagt tattatttaa aaaacagttt 6600
ttccactctt ttgtgccaaa aacaattgtt gttaatggtg taacctttca ggtagacaat 6660
ggaaaagtct actacgaagg aagaccaatt ttccaaaaag gttgttgtag tttgtggtcc 6720
aattataaga aagattagaa taattaaacc acctacaaca cttattttta caaatggcgt 6780
tttaggttac aaacgcttaa caaatacgga tgatgaaatg gctgactagt tttggaagag 6840
ctttcatctc ctgttataaa tccctattac taactcaatt aagagtatta gataggttaa 6900
ttttagatca cggacccaag cgcacattaa cgtgtgctag gcgagtgctt ttagttcaat 6960
tagatttagt ttataggttg gcttatacgc ccacccaatc gctggtatga ataatagtaa 7020
agataatcct tttcgcggag caatagcaag aaaagcgcga atttatctga gaggaggatt 7080
agattgtgtt tactttctta acaaagcagg acaagcagag ccttgtcccg cgtgtacctc 7140
cctagtattc caagggaaaa cttgtgagga acactattat aataacaatc ttttgtcatg 7200
gcaagcggta aggcaactgg aaagacagac gccccagcgc cagtcatcaa actaggagga 7260
ccaaagccac ctaaagttgg ttcttctgga aatgcatcat ggtttcaacc gataaaggcc 7320
aagaagctaa attcacctgt gcctaaattt gacggtagtg gtgttcctga aaatgaaaat 7380
ctcaagtcaa gccagcaaca tggatactgg agacgccaac acaggtttaa gcctggcaaa 7440
ggtggaagaa aaccagtccc tgatgcttgg tacttttact acactggaac aggaccggcc 7500
gccgacctga attggggtga aactcaagat ggtatagtgt gggttgctgc aaagggtgct 7560
gatactaaat ctagatcaaa ccagggtaca agggatcctg ataagtttga ccaataccca 7620
ctacgattct cagatggagg accggatggt aatttccgtt gggacttcat accaataaat 7680
cgtggtagga gtgggagatc aacagcagct tcatcagcag catctagtag agcaccatct 7740
cgtgaggggt cacgtggacg tagaagcgga gttgaagatg atcttatagc tcgcgcagca 7800
aagattatac aggaccagca aaagaagggt gcgcgcatta ccaaggctaa ggctgatgaa 7860
atggctcatc gccgctattg caagcgcact atcccacctg gttataaggt tgagcaagta 7920
tttggtcccc gtactaaagg taaggaagga aattttggtg atgacaagat gaatgaggaa 7980
ggtgttaagg atgggcgtgt tacggcaatg ctcaacctag tccctagcag tcatgcttgt 8040
ctttttggaa gtagggtgac gcccaaactg cagccagatg gtcttcacct gagatttgaa 8100
tttactactg tggtgtcacg tgatgatccg cagtttgata attatgtgaa aatttgtgat 8160
cagtgtgtcg atggtgtagg gacgcgtcca aaggacgatg aatcgagacc aaagtcacgc 8220
ccaaattcaa gacctgcaac tagaggaaat tctccagcgc cgagacaaca gcgcccaaag 8280
aaggagaaaa agcccaagaa gcaggatgat gaagtagata aggcattgac ctcagatgag 8340
gagaggaaca atgcacagct ggaatttgat gatgaaccca aggtgattaa ctggggggac 8400
tctgcactag gtgaaaatga actttgatta acataatgga cttgctgcat ttgctgtcac 8460
attttgttaa atattatttt tgtgttttac tatcaattat tacaggtatt gattgtgatt 8520
atgttcaata cttaagcttc ttctggttgc tttttgcttg ttgtattgtt gctgtgcttt 8580
ttattattgt gattctcatt agtttgcttt atcgtagaaa ttcaatagta agagttaagg 8640
aagataggca tgtagcttag cacctacatg tctatcgcca gggaaatgtc taatctgtct 8700
acttagtagc ctggaaacga acggtagacc cttagatttt aatttagttt aatttttagt 8760
ttagtttaag ttagtttaga gtaggtataa agatgccagt gccggggcca cgcgtagtac 8820
gaccgagggt acagcactag gacgcccact aggggaagag ctaaatttta gtttaagtta 8880
agtttaattg gctaaatata gttaaaattt ataggctagt atagagttag agcaaaaaaa 8940
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 9000
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagcggccg catcggatgc cgggaccgac 9060
gagtgcagag gcgtgcaagc gagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga 9120
aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 9180
tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 9240
cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 9300
ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 9360
cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 9420
ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 9480
aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 9540
cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 9600
cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 9660
gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 9720
tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 9780
cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 9840
ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 9900
gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 9960
gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 10020
accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 10080
ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 10140
tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 10200
aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 10260
taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 10320
gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 10380
agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 10440
cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 10500
tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 10560
gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 10620
agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 10680
gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 10740
atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 10800
gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 10860
tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 10920
atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 10980
agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 11040
gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 11100
cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 11160
tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 11220
ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca 11280
ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 11320
<210> 22
<211> 11314
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有IBV的质粒
<400> 22
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ggagatcggt acttcgcgaa 420
tgcgtcgaga tgagctctaa tacgactcac tatagggact taagtgtgat ataaatatat 480
atcatacata ctagccttgt gctagatttc caacttaaca aaacggactt aaatacctac 540
agttggtccc tataggtgtt ccattgcagt gcactttagt gccctggatg gcacctggcc 600
acctgtcagg tttttgttat taaaataata ttgttgctgg tatcactgct tgttttgccg 660
tgtctcactt tatacatccg ttgcttgggc tacctagtat ccagcgtcct actggcgttg 720
tggtcggttc gagtgcgaag aacctctggt tcatctagcg gtacgcgggt gtgtggaagt 780
agcgcttcag acgtaccggt tctgttgcgt gaaatacggg gtcacctccc cccacatacc 840
tctaagggct tttgagccta gcgttgggct acgttctcgc acaaggtcgg ctatacggcg 900
tttgtagggg gtagtgccaa acaacccctg aggtgacagg ttctggtggt gtttcgaaaa 960
caacaatgtg tgtgccgcat aatatgcgag taatgcattt tggagcagga agtgacaaag 1020
gagtggcccc aggtagcgct gttcttaggc agtggcttcc cgaaggtaca ctccttgtcg 1080
ataatgatat tgtagattat gtatctgatg cacatgtctc tgtgctttca gattgcaata 1140
aatgtaaaac agagcacaag tttgatcttg tgatatctga tatgtataca gataatgatt 1200
caaagagaaa gcatgaaggc gttgtagcca ataacggcaa tgatgacgtc ttcatatacc 1260
tttcaaactt tcttcgtaac aatttagctc tgggaggcag ttttgccgta aaagtaacag 1320
agacaagttg gcatgagagt ttatatgaca ttgcacagga ttgtgcatgg tggacaatgt 1380
tttgtacagc agtgaatgct tcttcgtcag aagcattctt gattggtgtt aattatttgg 1440
gtgcaagtga aaaggttaga gttagtggta aaaccctgca cgcaaattat atattttgga 1500
ggaattgtaa ttatttacaa acttcagcct atagtatatt tgacgttgct aagtttgatt 1560
tgaaattaaa agcaacgcca gttgtgaatt tgaaaactga acaaaagaca gacttagtct 1620
ttaatttaat taagtgtggt aagttactgg taagagatgt tggtaacacc tcttttacta 1680
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tactaccaaa gtgccttcag accacctgat ggttggcatt tacatggggg tgcgtatgcg 1800
gttgttaata tttctagtga atctaataat gcaggctctt catctgggtg tactgttggt 1860
attattcatg gtggtcgtgt tgttaatgct tcttctatag ctatgacggc accgtcatca 1920
ggtatggctt ggtctagcag tcagttttgt actgcatact gtaacttttc agatactaca 1980
gtgtttgtta cacattgtta taaacatggt gggtgtccta taactggcat gcttcaacag 2040
cattctatac gtgtttctgc tatgaaaaat ggccagcttt tctataattt aacagttagt 2100
gtagctaagt accctacttt taaatcattt cagtgtgtta ataatttaac atccgtatat 2160
ttaaatggtg atcttgttta cacctctaat gagaccacag atgttacatc tgcaggtgtt 2220
tattttaaag ctggtggacc tataacttat aaagttatga gagaagttag agccctggct 2280
tattttgtta atggtactgc acaagatgtt attttgtgtg atgggtcacc tagaggcttg 2340
ttagcatgcc agtataatac tggcaatttt tcagatggct tttatccttt tactaatagt 2400
agtttagtta agcagaagtt tattgtctat cgtgaaaata gtgttaatac tacttttacg 2460
ttacacaatt tcacttttca taatgagact ggcgccaacc caaatcctag tggtgtccag 2520
aatattcaaa cttaccaaac acaaacagct cagagtggtt attataattt taatttttcc 2580
tttctgagta gttttgttta taaggagtct aattttatgt atggatctta tcacccaagt 2640
tgtaatttta gactagaaac tattaataat ggtttgtggt ttaattcact ttcagttagt 2700
attgcttacg gtcctcttca aggtggttgc aagcaatctg tctttagtgg tagagcaacc 2760
tgttgttatg cttactcata tggaggtcct ttgctgtgta aaggtgttta ttcaggtgag 2820
ttagatcata attttgaatg tggactgtta gtttatgtta ctaagagcgg tggctctcgt 2880
atacaaacag ccactgaacc gccagttata actcaacaca attataataa tattacttta 2940
aatacttgtg ttgattataa tatatatggc agaactggcc agggttttat tactaatgta 3000
accgactcag ctgttagtta taattatcta gcagacgcag gtttggctat tttagataca 3060
tctggttcca tagacatctt tgtcgtacaa agtgaatatg gtcttaatta ttataaggtt 3120
aacccttgcg aagatgtcaa ccagcagttt gtagtttctg gtggtaaatt agtaggtatt 3180
cttacttcac gtaatgagac tggttcccag cttcttgaga atcagtttta catcaaaatc 3240
actaatggaa cacgtcgttt tagacgttct attactgaaa gtgttgaaaa ttgcccttat 3300
gttagttatg gtaagttttg tataaaacct gatggcagta ttgccacaat agtaccaaaa 3360
cagttagaac agtttgtggc acctttactt aatgttactg aaaatgtgct catacctaac 3420
agttttaatt taactgttac agatgagtac atacaaactc ggatggataa ggtccaaatt 3480
aattgcctgc agtatatttg tggcaattct ctggagtgca gaaatttgtt tcaacaatat 3540
ggtcctgttt gcgacaacat attgtctgta gtaaatagtg ttggtcaaaa agaagatatg 3600
gaacttttga atttctattc ttctactaag ccggctggtt ttaatacacc agttcttagt 3660
aatgttagca ctggtgagtt taatattact ctttttttaa caacgcctag tagtcctaga 3720
aggcgttctt ttattgaaga ccttctattt acaagtgttg aatctgttgg attaccaaca 3780
gatgacgcat acaaaaattg cactgcaggt cctttaggct ttctgaaaga ccttgcatgt 3840
gctcgtgaat ataatggttt gcttgtgttg cctcctatta taacagcaga aatgcaaact 3900
ttgtatacaa gctctctagt agcttctatg gcttttggtg gtattactgc agctggtgct 3960
ataccttttg ccacacaact gcaggctaga attaatcact tgggtattac ccagtcactt 4020
cttttgaaga atcaagaaaa aattgctgct tcctttaata aggccatcgg tcatatgcag 4080
gaaggtttta gaagtacatc tttagcatta caacaaattc aagatgttgt taataagcag 4140
agtgctattc ttactgagac tatggcatca cttaataaaa attttggtgc catttcttct 4200
gtgattcaag aaatctacca gcaacttgac gccatacaag caaatgctca agtggatcgt 4260
cttataactg gtagattgtc atcactttct gttttagcat ctgctaagca ggcggagtat 4320
attagagtgt cacaacagcg tgagttagct actcagaaga ttaatgagtg tgttaagtca 4380
cagtccatta ggtactcctt ttgtggtaat ggacgacatg ttttaaccat accgcaaaat 4440
gcacctaatg gtatagtgtt tatacacttt tcttacactc cagatagttt tgttaatgtt 4500
actgcaatag tgggtttttg tgtaaagcca gctaatgcta gtcagtatgc aatagtaccc 4560
gctaatggta ggggtatttt tatacaagtt aatggtagtt actacatcac tgcacgagat 4620
atgtatatgc caagagctat tactgcagga gatatagtta cgcttacttc ttgtcaagca 4680
aattatgtaa gtgtaaataa gaccgtcatt actacattcg tagacaatga tgattttgat 4740
tttaatgacg aattgtcaaa atggtggaat gatactaagc atgagctacc agactttgac 4800
aaattcaatt acacagtacc tatacttgac attgatagtg aaattgatcg tattcaaggc 4860
gttatacagg gtcttaatga ctctctaata gaccttgaaa aactttcaat actcaaaact 4920
tatattaagt ggccttggta tgtgtggcta gccatagctt ttgccactat tatcttcatc 4980
ttaatattag gatgggtttt cttcatgact gggtgttgtg gttgttgttg tggatgcttt 5040
ggcattatgc ctctaatgag taagtgtggt aagaaatctt cttattacac gacttttgat 5100
aacgatgtgg taactgaaca atacagacct aaaaagtctg tttaatgatt aaaagtccca 5160
catcttttct aatattatta attcttcttt ggtgtaaact tgcattaagt tgttttaaag 5220
agtgtgttat aacactccag caactagtac aaattttact ccaaattatt aatagtaact 5280
tacaatctag acttctgctt tggcacagtc tagactaatg ttagattttg aagcaattat 5340
tgaaactggt cagcaaataa ctcaacaaat tagtttctat ttacagcata tttcaagggt 5400
gctaagtact gaattatttg acccctttga agtttgtgtt tacagaggag gtaattgttg 5460
ggagttagag tcagctgacg agttttcagg tgatgacgaa tatattgagt agatcgctcg 5520
aggagaacgg aagttttcta acagcggttt acgtgttttt aggattttta gcactttatc 5580
tactaggtag agcgcttcaa gcttttgtac aagcggctga cgcttgttgt cttttttggt 5640
atacatgggt agtagttcct ggagccaagg gcacagcctt tgtttataat catacatatg 5700
gtaaaaaact taacaaaccg gagttagaaa cggttattgt taacgaattt ccaaaaaacg 5760
gttggaaata tggataatac catcaattgt actcttggta ctgaacaagc agttcagctt 5820
tttaaggaat ataatctgtt tgtaactgca ttcctgttgt ttttaaccat actacttcag 5880
tatggatacg caactaggag caaggttatt tacatactga aaatgatagt gttatggtgc 5940
ttttggcccc ttaacattgc agtaggtgta atctcatgta tatacccacc aaacacagga 6000
ggtcttgtcg cagcgataat tcttacagtg tttgcgtgtc tttcttttat aggttattgg 6060
atccagagta ttagactttt taagcggtgc aggtcatggt ggtcatttaa ccccgaatct 6120
aatgccgtag gttcaatact cctaactaat ggtcaacaat gtaattttgc tatagagagt 6180
gtgccgatgg tgctttctcc tattataaag aatggtgctc tttattgcga gggtcagtgg 6240
cttgctaaat gtgaaccaga ccacttgcct agagatatat ttgtatgcac accggataga 6300
cgtaatatct atcgtatggt gcaaaaatat actggtgacc aaagcggaag taagaaaagg 6360
tttgccacat ttgtctatgc aaagcagtca gtagatactg gcgagctaga aagtgtgtca 6420
gcagtaggag gtagtcttta cacataaatg tgtgtgtgta gagagtattt aaaattattc 6480
tttgacagtg cctccgtttt aagagcgcgg aagagtatta tttttgagga tattaatata 6540
aatcctcttt gtttcatact ctcctttcag gagttattat ttaaaaaaca gtttttccac 6600
tcttttgtgc caaaaacaat tgttgttaat ggtgtaacct ttcaggtaga caatggaaaa 6660
gtctactacg aaggaagacc aattttccaa aaaggttgtt gtagtttgtg gtccaattat 6720
aagaaagatt agaataatta aaccacctac aacacttatt tttacaaatg gcgttttagg 6780
ttacaaacgc ttaacaaata cggatgatga aatggctgac tagttttgga agagctttca 6840
tctcctgtta taaatcccta ttactaactc aattaagagt attagatagg ttaattttag 6900
atcacggacc caagcgcaca ttaacgtgtg ctaggcgagt gcttttagtt caattagatt 6960
tagtttatag gttggcttat acgcccaccc aatcgctggt atgaataata gtaaagataa 7020
tccttttcgc ggagcaatag caagaaaagc gcgaatttat ctgagaggag gattagattg 7080
tgtttacttt cttaacaaag caggacaagc agagccttgt cccgcgtgta cctccctagt 7140
attccaaggg aaaacttgtg aggaacacta ttataataac aatcttttgt catggcaagc 7200
ggtaaggcaa ctggaaagac agacgcccca gcgccagtca tcaaactagg aggaccaaag 7260
ccacctaaag ttggttcttc tggaaatgca tcatggtttc aaccgataaa ggccaagaag 7320
ctaaattcac ctgtgcctaa atttgacggt agtggtgttc ctgaaaatga aaatctcaag 7380
tcaagccagc aacatggata ctggagacgc caacacaggt ttaagcctgg caaaggtgga 7440
agaaaaccag tccctgatgc ttggtacttt tactacactg gaacaggacc ggccgccgac 7500
ctgaattggg gtgaaactca agatggtata gtgtgggttg ctgcaaaggg tgctgatact 7560
aaatctagat caaaccaggg tacaagggat cctgataagt ttgaccaata cccactacga 7620
ttctcagatg gaggaccgga tggtaatttc cgttgggact tcataccaat aaatcgtggt 7680
aggagtggga gatcaacagc agcttcatca gcagcatcta gtagagcacc atctcgtgag 7740
gggtcacgtg gacgtagaag cggagttgaa gatgatctta tagctcgcgc agcaaagatt 7800
atacaggacc agcaaaagaa gggtgcgcgc attaccaagg ctaaggctga tgaaatggct 7860
catcgccgct attgcaagcg cactatccca cctggttata aggttgagca agtatttggt 7920
ccccgtacta aaggtaagga aggaaatttt ggtgatgaca agatgaatga ggaaggtgtt 7980
aaggatgggc gtgttacggc aatgctcaac ctagtcccta gcagtcatgc ttgtcttttt 8040
ggaagtaggg tgacgcccaa actgcagcca gatggtcttc acctgagatt tgaatttact 8100
actgtggtgt cacgtgatga tccgcagttt gataattatg tgaaaatttg tgatcagtgt 8160
gtcgatggtg tagggacgcg tccaaaggac gatgaatcga gaccaaagtc acgcccaaat 8220
tcaagacctg caactagagg aaattctcca gcgccgagac aacagcgccc aaagaaggag 8280
aaaaagccca agaagcagga tgatgaagta gataaggcat tgacctcaga tgaggagagg 8340
aacaatgcac agctggaatt tgatgatgaa cccaaggtga ttaactgggg ggactctgca 8400
ctaggtgaaa atgaactttg attaacataa tggacttgct gcatttgctg tcacattttg 8460
ttaaatatta tttttgtgtt ttactatcaa ttattacagg tattgattgt gattatgttc 8520
aatacttaag cttcttctgg ttgctttttg cttgttgtat tgttgctgtg ctttttatta 8580
ttgtgattct cattagtttg ctttatcgta gaaattcaat agtaagagtt aaggaagata 8640
ggcatgtagc ttagcaccta catgtctatc gccagggaaa tgtctaatct gtctacttag 8700
tagcctggaa acgaacggta gacccttaga ttttaattta gtttaatttt tagtttagtt 8760
taagttagtt tagagtaggt ataaagatgc cagtgccggg gccacgcgta gtacgaccga 8820
gggtacagca ctaggacgcc cactagggga agagctaaat tttagtttaa gttaagttta 8880
attggctaaa tatagttaaa atttataggc tagtatagag ttagagcaaa aaaaaaaaaa 8940
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 9000
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagcg gccgcatcgg atgccgggac cgacgagtgc 9060
agaggcgtgc aagcgagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 9120
tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 9180
gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 9240
ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 9300
cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 9360
cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 9420
aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 9480
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 9540
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 9600
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 9660
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 9720
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 9780
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 9840
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 9900
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 9960
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 10020
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 10080
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 10140
taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 10200
aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 10260
tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 10320
tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 10380
gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 10440
gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 10500
aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 10560
gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 10620
ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 10680
tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 10740
atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 10800
ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 10860
ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 10920
ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 10980
atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 11040
gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 11100
tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 11160
ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 11220
acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 11280
tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 11314
<210> 23
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
tgattaaaag tcccacatct tttctaatat tattaattct tctttgg 47
<210> 24
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
ctcttaccag taacttacca cacttaatta aattaaagac taagtc 46
<210> 25
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
aagtgtggta agttactggt aagagatgtt ggtaacacct cttttac 47
<210> 26
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
agaaaagatg tgggactttt aatcattaaa cagacttttt aggtctg 47
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
caggattgtg catggtggac 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
agaaaaccta aaggtcctgc 20
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
taaatggtga tcttgttt 18
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
tttgtatacg agagccatca 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
ttgccttcag tatgtttgtg 20
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
ctgcgacaag acctcctg 18
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
tgctgcttcc tttaataag 19
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
cgctgttgtg acactctatg 20
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
tggccttggt atgtgtgg 18
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
agcactacat agtgcatac 19
<210> 37
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
tctttggtat gcactatgta gtgctgcttt gtatgactcg agttc 45
<210> 38
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
tggcaagcca cacataccaa ggccacttaa tataagtttt gagtattgaa agtttttc 58
<210> 39
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
aagtgtggta agttactggt aagagatgtt ggtgaagtca ctg 43
<210> 40
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
tctttggtat gcactatgta gtgctaattt gtttgattct gataataatt atg 53
<210> 41
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
tggcaagcca cacataccaa ggccacttaa tataagtttt aattattgaa agttcttc 58
<210> 42
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
aagtgtggta agttactggt aagagatgtt ggggaagtca ctg 43
<210> 43
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
tctttggtat gcactatgta gtgctgcttt gtttgataat aatgaaac 48
<210> 44
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
tggcaagcca cacataccaa ggccatttaa tataagtctt gagtattgaa ag 52
<210> 45
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
gtctgtattg ttaagttacc acatcgttat c 31
<210> 46
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
tctttggtat gcactatgta gtgctaattt atatgacaac gaatcttttg 50
<210> 47
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
tggcaagcca cacataccaa ggccacttaa tataagtttt gagtattgaa ag 52
<210> 48
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
gtctgtattg ttaagttacc acatcattat caaaag 36
<210> 49
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
tctttggtat gcactatgta gtgctgctct gtttgataat aatcag 46
<210> 50
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
aagtgtggta agttactggt aagagatgtt ggttcaacct cttttac 47
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
tctttggtat gcactatgta gtgcttcttt gtacaataat gatagctatg 50
<210> 52
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
tggcaagcca cacataccaa ggccatttaa tataagtttt taaaatagaa agtgtttc 58
<210> 53
<211> 27618
<212> DNA
<213> 禽类传染性支气管炎病毒
<400> 53
acttaagtgt gatataaata tatatcatac atactagcct tgcgctagat ttccaactta 60
acaaaacgga cttaaatacc tacagctggt ccccataggt gttccattgc agtgcacttt 120
agtgccctgg atggcacctg gccacctgtc aggtttttgt tgttaaaata tcattgttgc 180
tggtatcact gcttgttttg ccgtgtctca ctttatacat ccgttgcttg ggctacctag 240
tgtccagcgt cctacgggcg ccgtggctgg tccgagtgcg aagaacctct ggttcatcta 300
gcggtacgcg ggtgtgtgga agtagcgctt cagacgtatc ggttctgttg cgtgaaatac 360
ggggtcacct ccccccacat acctctaagg gcttttgagc ctagcgttgg gctacgttct 420
cgcacaaggt cggttatacg acgtttgtag ggggtagtgc cgaacaaccc ctgaggtgac 480
aggttctggt ggtgtttagt gagcagacat acaatagaca gtgacaacat ggcttcaagc 540
ctaaaacagg gagtatctcc caaaccaagg gatgtcattc ttgttgccaa agacattccc 600
gaacaattat gtgacgcttt gtttttctat acgtcacatg accccaagga ttacgctgat 660
gcttttgcca ttaggcagaa gtttgaccgt aaccttcaga ctgggaagca gtttaaactt 720
gaaactgtgt gtggtctctt cctcttgaag ggagttgaca aaataacacc tggtgtccca 780
gcaaaagtct taaaagccac ctctaagctg gctgatttgg aagacatctt tggtgtctct 840
cctcttgcac gtaaatatcg tgatttgttg aagacagcat gccagtggtc tctcactgtg 900
gaaacactgg atgctcgtgc gcaaactctt gatgaaatct ttgacccaac tgaaatactt 960
tggcttcagg tagcttcaaa gatccaggtt tcagctatgg caatgcgcag acttgttgga 1020
gaagtaactg caagagtcat ggaatctcta ggttcaaatt tgagcgttct ttttcaagtt 1080
gttaaagaac aaatagtcag aatctttgaa aaggcactgg ctatttttga gagtgtgaat 1140
gatttaccac agcgtattgc agcactaaaa atggcttttg ccaagtgtgc gaaatcaatt 1200
acagttgtgg ttgttggaaa gactcttctt gttaaagagt ttgctggaac ttgtcttgca 1260
agcattaatg gtgctattgc aaaggttttt gaagaactgc caactggctt tatgggtgcc 1320
aaaattttca caacacttgc cttctttaaa gaagcagctg tgaaaattgt ggaaaatata 1380
ccaaatgcac caagaggtac tagaggtttt gaagtcgttg gtaacgccaa gggaacgcaa 1440
gttgttgtgc gtggcatgcg aaatgattta actctgctcg accaaaaagc tgacattcct 1500
gttgagaaag aaggttggtc tgcaattctt gaaggacatc tgtgttatgt ctttaagagt 1560
ggtgatcgtt tttatgcggc acctctttct gggaattttg cattgcatga tgtgcattgt 1620
tgtgagcgtg ttgtctgtct gtctgatggt gtaacaccag agataaatga tggactcatt 1680
ctagcagcaa tctattcatc ttttagtgtc tcagaactcg tggcagcact taaaaagggt 1740
gaaccattca agttcttggg tcataaattt gtgtatgcga aggatgcagc agtctctttc 1800
actcttgcaa aagcagccac tattgcagat gtactgaagc tgtttcaatc agctcgtgtg 1860
caaatagaag atgtgtggtc tgcatttact gaaaagtctt ttaatttctg gaaattcgca 1920
tatggaaaag tgcgtaatct tgaagaagtt gtgaagactc atttttgtaa agctcaaatg 1980
tcaattatta ttctagcagc agtgcttggc gaaggcattt ggcatcttgt ttcacaggtc 2040
atctataaag taggtggtct ttttactaga gtcgttgact tttgtgaaaa acactggaag 2100
ggtttctgtg cacaacttaa aaaggctaag ctcgttgtca cagaaacttt ttgtgttctt 2160
aagggagtgg cacagcattg ttttcaacta ttgctggatg caatacattc tttgtatatg 2220
agttttaaga agtgtgcact tggtagaatt catggagact tactcttctg gaaagggggt 2280
gtacacaaaa ttgttcaaga tggcgatgaa gtttggtttg acgccattga tagtattgat 2340
gttgaagatc tgggtgttgt ccaagaaaaa cccatagatt ttgaggtttg tgaagacgta 2400
acacttccag aaaatcaacc tggtcatatg gttcaaatcg aggatgacgg aaagaactat 2460
atgttcttcc gcttcaaaag ggatgagaac atctactata caccaatgtc tcaacttggt 2520
gcaattaatg tagtttgcaa agcaggcggt aaaaccgtta cctttggaga caccattgtg 2580
aaagaaatac cgccacctga tgttgtgcct attaaggtta gcatagagtg ttgtggtgaa 2640
ccatggaata caatcttcaa gaaagcttat aaagagccca ttgaagttga aactgacctc 2700
acagtagaac aattgctctc tgtgatctat gagaaaatgt gcgacgacct caaattgttt 2760
ccagaggcac cagagccacc gccatttgag aatgtcgcac ttgttgataa aaacggtaaa 2820
gacttggatt gcataaaatc atgccatctt atctaccgtg attatgagag tgatgatgac 2880
atcgaggaag aagatgctga ggagtgtgat actgatttag aatgtgaaga agaggatgag 2940
gatactaaag tgttggctct tatacaagac cctgcaagta ataaataccc tcttcctctt 3000
gatgatgatt atagcgtctt taatggatgt attgtacata aggacgctct tgacgtcgta 3060
aatctaccat ctggtgaaga aacctttgtt gtcaacaact gctttgaggg agctgtaaaa 3120
ccactgcctc agaaagttgt tgatgttcta ggtgactggg gtgaggctgt tgatgcgcaa 3180
gagcaaattg cacaaactac ttcagaggaa acccctatca gtagtttgga ggcaactatt 3240
gagcaagttg ttgttgagga acagaaaata atttctgttg ttgaagaaga acagcaggtg 3300
gcggtctaca cacctgcaga cctacaagtt gttgaagaaa cactagatga gtttattctt 3360
attgctgatg tttccacaga agaaattgtg cctcatgaag agaaggagtc acagattgaa 3420
caggagccta ttcaagttgt taaatcacaa cgtgaaaaga aggctaaaaa gttcaaggtt 3480
aaatctacta catgtgagaa acccaaattt ttggagtaca caacatgtgt gggtggccta 3540
acggtagtga ttgccaaagc attggatgag tttaaagagt tctgcattgt aaatgctgct 3600
aatgagcata tgtctcacgg tggcggcgtt gctaaggcaa ttgcggactt ttgtggacct 3660
gattttgtgg agtattgtga ggactatgtt aagaaacatg ggcctcaaca aagacttgtc 3720
acaccttcat ttgtcaaagg cattcaatgt gtgaacaatg ttgtaggacc tcgccatgga 3780
gacagtaact tgcatgataa gcttgttgct gcttacaaga atgttcttgt agatggtgtt 3840
gtcaattatg ttgtgccagt cctctcatca ggaatttttg gtgttgattt taagatgtct 3900
atagacgcta tgcgcaaggc ttttgaaggt tgcgacatac gcgttcttct tttctccttg 3960
tctcaagaac acatcgatta tttcgatgtt acttgtaaac agaagacaat ttatcttaca 4020
gaggacggtg ttaaataccg ctctgctact gtgaaaccag gtgactcttt gagtcaattt 4080
ggaccggttt ttgctagaaa caagacagtc tttacagcag acgatgttga ggacaaagaa 4140
attctcttca ttcctactac tgacaagact gtcctcgaat attatggttt ggatgcgcaa 4200
aagtatgtaa tatacttgca aactcttgca cagaagtgga atgtccaata tagggacaat 4260
tttgttatac ttgagtggcg tgatggaaat tgctggatta atgcagcagt agtgctcctt 4320
caagctgcta agattaggtt taaaggtttt cttgcagaag catgggcaca acttttgggt 4380
ggagacccaa ctgattttgt agcctggtgc tatgcaagtt gcaatgctaa tgttggtgag 4440
ttttcagatg ctaattggct tcttgctaat ttggcagaat actttgatgc tgattacacg 4500
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tacacaaatt gtacagtgtg tgatgcaaat agtgtggatg aggtggtaga agcctcacta 4680
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gtagggaatg ttgttttcat tggctctact aacagtggcc attgttatac acaagccatt 4800
ggtaaggctt ttgacaatct tgctaaagat agaaaatttg gaaagaagtc tccttacatt 4860
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agtaaaggaa aaactaaagt tgtaaaagag gatgtttcta atcttgccac tagttctaaa 4980
gtcagttttg ataatcttac tgattttgaa cagtggtatg atagtaacat ctacgagtgt 5040
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gattctaagt tgccattgac gcttaaagtt agaggtatta gatcagttgt tgattttaaa 5160
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gtatactacc ctgtcttaga tgctattagt cttaaggcaa tatgggttga aggtactgca 5280
aattttcttg ttggtcatcc aaactactat agtaaatctc ttcgcattcc cactttttgg 5340
gaaaatgcag agagctttgt taaaatagga gaaaaagttg atggtgtgac tactggtctt 5400
tggcgtgcag aacaccttaa taaacctaac ttggagagaa ttttcaacat tgctaagaaa 5460
gcaattgttg ggaccagtgt tgttactaca caatgtggta aattacttag taaagcagct 5520
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ggtctttgtg gattcacacg tgggcatttt gaaagaaaat tgtctccaca attcataaaa 5640
acacttatat tcttcttctt ttattttgta aaggctagtg ctaagagtgt cgccactagt 5700
tataagcgtg tgttatgtaa ggtggtcttt actacgctat ttatattatg gtttatgtac 5760
acaagtaaac cagtaatttt tactggaata cgtatattag actttttatt tgaaggttct 5820
gtctgtggtc cttataatga ctatggtaaa gatacttttg atgtactacg ctattgtgaa 5880
gatgatttta cttgtcgtgt gtgtttacat gacagggatt cactacactt atataagcat 5940
gcttatagcg tagaacaatt ttataaaagt gcagtttctg gcattagttt taattggaat 6000
tggctttatt tggtctttct aattttattt gttaagccag tagcgggttt tgttattatt 6060
tgctattgtg ttaagtattt ggtactgagt tcaactgtat tacaaactgg tgtaggtttt 6120
ctagattggt ttgttcagac agttttcact cactttaatt tcatgggtgc agggttttat 6180
ttctggctct tttataagat atacatacag gttcatcata tactgtattg taaggatata 6240
acatgtgaag tgtgcaagaa ggttgtacgc agcaataggc aagaggttag cgttgtagtt 6300
ggtggacgca agcaaatagt gcatgtctac actaactcag gctataattt ttgtaagaga 6360
cataactggt attgtagaaa ttgtgatgag tatggtcatc aaaacacatt tatgtctccc 6420
gaagttgctg gcgagctctc cgataagctt aagcgtcatg ttaaacctac agcatatgct 6480
taccacgttg tggatgatgc gtgcgtagtt gatggttttg ttaatttaaa atacaaagct 6540
gcaattcctg gcaaggatag tgcatctcct gccgttaagt gttttagtgt tacagatttc 6600
ttgaagaaag ctgtttttct taaggaagca ttgaaatgtg aacaaatatc caatgatagt 6660
tttatagtgt gtaatacaca gagtgcgcat gcattagagg aagcaaaaaa tgctgccatc 6720
tattatgcgc aatgtctgtg taagccaata cttatacttg accaggcact ttatgagcaa 6780
ttagtagtgg aacctgtgtc taagtgtgtt gtagacaagg tgtgtagcat tttgtccaat 6840
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ctttctgtta ctaaagacga agaagctgta gatatggcta tcttctgtca taaccatgat 6960
gttgaataca ctactgatgg ttttactaat gtgataccat cttatggtgt agacactgat 7020
aggttgacac ctcgtgatag aggattttta ataaatgcgg atgcttctgt tgctaattta 7080
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gcaggtggtg tcactagtga tacttttaaa tggttgaaaa gctgttttaa gtggctattt 7320
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agttttgttc accccatgta tgatgtaaac tctacactgc atgttgaagg ttttaaagtt 7440
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actgctgtta tagatggtga tgggacagta gctgctggtg ttcctggttt tgtatcatgg 7620
gttttggatg gtgctatgtt tgtacatatg acacagactg agagaaaacc gtggtacatt 7680
cctacttggt ttaatagaga aattgtaggt tacactcagg attcaattat tactgagggt 7740
agtttttata catctatagc tttattttca gctagatgtt tgtacctgac agccagcaat 7800
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agtattattc ctcatagggt ttacttccaa ccaaatggtg ttaggcttat agttcctcaa 7920
caaatatttc acacaccata catagtaaag tttgtatcag acagctattg tagaggtagt 7980
gtatgtgaat atactaaacc aggttactgt gtatcattaa actcccaatg ggttttgttt 8040
aatgatgaat acacaagtaa gccaggcgtg ttttgtggtt ctactgttag agaacttatg 8100
tttaatatgg ttagtacatt tttcacaggt gtcaacccta atatttatat gcagctagca 8160
attatgtttt tgatactagt tgttgttgta ttaatttttg caatggtcat aaagtttcaa 8220
ggtgttttta aagcttatgc aaccgttgtg tttacaataa tgttagtttg ggttattaat 8280
gcatttgttt tgtgtgtaca tagttataat agtgttttag ctgttgtatt actagtactt 8340
tattgttatg cctcattggt aacaagccgc aatacttcta ttataatgca ttgctggctt 8400
gtcttcactt ttggtttaat agtacccacg tggctggctt gtgtttattt agggtttatt 8460
ctctatatgt atacaccact atttttctgg tgttatggta ctactaaaaa tactcgtaaa 8520
ctgtatgatg gcaacgagtt tgttggtagt tatgatcttg ctgcgaagag cacttttgtt 8580
attcgtggtt ctgaatttgt taagcttacg aatgagatag gtgataaatt tgaagcttac 8640
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attgtgtata caccaccacg ttactctatt ggtgttagta gattacaggc tggttttaag 8820
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ttgattttac aaactgctgt cgctaatgct gaaactccaa agtataagtt tattaaagca 9120
aattgtggtg atagttttac catagcttgc tcttatggtg gtacggtagt aggactttac 9180
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tctgttggtt ttaatataga aaagggtgta gttaatttct tctatatgca ccatcttgag 9300
ttgcctaatg cattacacac aggaactgac ctaacgggag agttctatgg tggttatgtg 9360
gatgaagagg ttgcacaaag ggtgccacca gataatttag ttactaacaa tattgtagca 9420
tggctttatg ccgcaattat tagtgttaaa gagagtagtt tctcattgcc taaatggttg 9480
gagagtacta cagttactgt tgatgattat aataagtggg ctggtgataa tggttttaca 9540
ccgtttgcta ctagtactgc cattactaaa ttaagtgcta ttacgggagt ggatgtttgt 9600
aaactccttc gcactattat ggcaaaaagt tgtcaatggg gtagtaaccc cattttaggc 9660
caatataatt ttgaagatga attgacacct gagtctgttt ttaaccagat aggcggtgtt 9720
agattacagt cttcgtttgt aagaaaagct acatcttggt tttggagtag atgtatttta 9780
gcttgtttct tatttgtgtt gtgtgctatt gtcttattta cggcagtgcc acttaggtat 9840
tatgtacatg cagctgttat tttgttagca gctgtattct ttatttcttt tactgttaag 9900
catgttatgg cttatatgga cactttccta ttgccgacat tgcttacagt cattattgga 9960
gtttgtgctg aagtaccttt catctacaat actctaatta gtaggatagt tgtctttgtt 10020
agtcaatggt atgatcctgt agtctttgat actatggtac catggatgtt cttgccacta 10080
gtgttgtaca cagcatttaa gtgtgtgcag ggttgctata gtgtgaattc tttcaatact 10140
tctttgctag tactgtacca gttcttgaag ttaggctttg ttatttatgc ctcttctagc 10200
acgctggcag catacacaga aggtaattgg gatttatttt ttgaattagt tcacactact 10260
gtgttggcta atgttagtag taattcctta ataggtttgt ttgtgttcaa gttagctaag 10320
tggatgttgt attattgtaa tgctacatac tttaataatt atgtgctaat ggctgtcatt 10380
attaatggct ttggttggct cttcacttgt tactttggag tttattggtg gattaataag 10440
gtttttggtt taaccttagg taaatatgaa ttcaaagttt cagtagacca atataggtat 10500
atgtgtcttc ataagataaa tccgcctaaa actgtgtggg aagttttttc gacaaatata 10560
cttatacaag gaattggtgg tgatcgtgtg ttgcctattg ctacagttca atctaaattg 10620
agtgatataa agtgtacaac tgttgtttta atgcagcttt tgactaagct taatgttgaa 10680
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tctactattg atttgagtga gtattgtgat gatatactta agaggtcaac tgttttacag 10860
tcagttactc aagagttctc acacataccc tcttatgctg aatatgaaag agctaagaat 10920
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ctagctactg ttccaattgt ttgtagtaat aagcttaccc ttgtaatacc agatccagaa 11280
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gacactgtta ttgatgctga tggcacagaa ttacatccta cttctacagg tagtggattg 11400
acatactgtg taagtggtga caatatagcg tggcctttaa aggttagctt aactagaaat 11460
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tatacaaata ttagtggtaa ttcagttgta gctgctatta cttcttcaag tccaaatctg 11640
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tgtaagtttg gtatgaaagt gggtgataag gttgaggttg tttacctgta ttttataaaa 11760
aatacaaggt ctattgttag gggtatggta cttggtgcta tatccaatgt tgttgtttta 11820
cagtctaaag ggcacgagac agaggaagta gatgctgttg gtattctttc actttgttca 11880
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ggtaactgtg ttaaaatgtt gacagttcat aatggtagtg gttttgctat aacatcaaag 12000
ccaagtccaa ctcctgatca agattcttat ggaggagctt ctgtgtgtct cttttgtaga 12060
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gtgactctta ttttgtggtt aaacaaacca cccctagtaa ttatgaacat gagaaagctt 12540
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ccttgaggca ttttgaccca aaggactgcg aagttcttaa agaaatactt gtcacttatg 12720
gttgtataga agattatcac cctaagtggt ttgaagataa taaggattgg tacgacccaa 12780
tagaaaaccc aaaatattat gccatgttgg ctaaaatggg gcctattgta cgtcgtgctt 12840
tattgaatgc tattgagttc ggaaacctta tggttgaaaa aggttatgtt ggtgttgtta 12900
cactagataa ccaagatctt aatggtaaat tttatgactt tggtgatttt cagaaaacgg 12960
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gtgaaacaag tctgcagggt acaggtttgt ttaaaatttg caacaaagaa tttagtggtg 16920
ttcaccctgc ttatgcggtc acaactaaag ctcttgctgc aacctacaaa gttaatgaag 16980
aacttgcagc ccttgttaat gtggaagctg gttcagaaat aacatataaa catctcattt 17040
ctcttcttgg gtttaagatg agtgttagtg ttgaaggttg tcacaacatg tttattacac 17100
gtgatgaggc aattcgcaat gtaagaggtt gggtaggttt cgatgtggaa gctacacatg 17160
cctgtggtac taacattggt actaacctcc cttttcaagt gggcttctcg acaggtgcag 17220
attttgtagt cacacctgag ggacttgtag acacttcaat aggcaataat tttgagcctg 17280
tgaattctaa agcacctcca ggtgaacaat ttaatcactt gagagcttta tttaagagtg 17340
ctaaaccttg gcatgttata agaccaagga tagtgcaaat gttagcagat aacctatgca 17400
atgtttcaga ttgtgtagtg tttgtcacgt ggtgtcatgg tctagaacta actaccctgc 17460
gctattttgt taaaataggc aaggaacaaa tttgttcatg tggttctaga gctacgacct 17520
ttaattctcg cactcaaact tatgcttgtt ggaggcattg tttgggtttt gattttgtct 17580
ataacccact cttagtggat atccaacaat ggggttactc aggtaatctg cagtttaatc 17640
atgacttgca ctgtaatgtg catggacacg cgcatgtggc atctgcagat gctattatga 17700
cgcgttgtct tgcagttaac aatgcatttt gtcaagatgt taactgggat ttaacatacc 17760
ctcatattgc aaatgaggat gaagttaatt ctagttgtag atatttacag cgcatgtatc 17820
tcaatgcatg tgttgatgct cttaaagtta atgttgtcta tgacataggc aaccctaaag 17880
gcattaaatg tgttaggcgt ggggatgtca ctttcagatt ctatgataag aatccaatag 17940
tacccaacgt caagcagttt gagtatgact ataatcagca caaagataag tttgctgatg 18000
gtctttgtat gttttggaat tgtaatgtgg gttgttatcc tgataattct ttggtttgta 18060
ggtatgacac acgaaatttg agtgtgttta acctaccagg ttgtaatggt ggtagccttt 18120
atgtcaacaa acatgcattc cacacaccta aatttgagcg caatagcttc cgtaatttga 18180
aagctatgcc attctttttc tatgactcgt caccgtgtga caccattcaa atagatggtg 18240
ttgcacagga tcttgtgtca ctagctacaa aagactgtat cacaaaatgc aacataggcg 18300
gcgccgtttg taaaaagcac gcgcaaatgt atgcagagtt cgtgacatct tataatgcag 18360
ctgttacggc tggctttact ttttgggtta ctaataattt taacccatac aatttgtgga 18420
aaagtttctc agctctccag tccattgaca acattgctta taatatgtat aagggtggcc 18480
attatgatgc tattgcagga gaaatgccca ctatagtaac tggagataaa gtttttgtta 18540
ttgatcaagg tgtagaaaag gcagttttcg ttaatcaaac aactctgcct acatctgtgg 18600
catttgaatt gtatgcgaag agaaatattc gcacactgcc aaacaatcgt attttgaaag 18660
gccttggtgt agatgtgacc catggttttg taatttggga ttatgcaaac caagtaccat 18720
tgtatcgtaa tactgttaaa gtgtgtgtat acacagatat cgagccaaat ggcctaacgg 18780
ttctgtatga tgatagatat ggtgattacc agtcttttct tgctgctgat aatgctgttc 18840
tagtttctac acagtgttat aagcggtact catatgtaga aataccatca gatcttcttg 18900
tccagaatgg tatgtcatta aaagatgggg cgaatctgta tgtttataag cgtgttaatg 18960
gtgcgtttgt tacgctacct aacacgctaa atacacaggg tcgcagttat gaaacttttg 19020
aaactcgtag tgacgttgag cgggattttc tcgccatgtc agaagaagac tttgtagaaa 19080
agtatggtaa agacctaggt ctacaacaca tactatatgg tgaagttgat aatcctcaat 19140
taggcggttt acacactgtt ataggtatgt atagactttt acgtgcgaat aaattgaacg 19200
caaagtctgt cactaattca gattctgatg tcatgcaaaa ttattttgta ttggcagaaa 19260
atggttccta taagcaggtc tgcaccgtag tggacttgtt gcttgatgac ttcttagaac 19320
ttcttagaaa catactcaag gagtatggtg ctaacaagtc taaagttgta acagtgtcaa 19380
ttgattacca tagcataaat tttatgacgt ggtttgataa tggcagtatt aaaacgtgtt 19440
atccgcagct tcaatctgca tggacgtgtg gttataatat gcctgagctc tataaagttc 19500
agaattgtgt tatggaacct tgcaatattc caaactatgg tgttggaata acgttgccaa 19560
gtggtattat gatgaatgtt gcaaagtaca cacaactttg ccaatatctt tctaaaacaa 19620
caatgtgtgt accgcataat atgcgagtta tgcattttgg agtaggtagt gacaaaggag 19680
tagcgccagg tagtactgtt cttaaacagt ggcttcctga aggaacactc ctcgttgaca 19740
atgatattgt agattatgtg tctgatgcac atgtttctgt gctttcagat tgcaataaat 19800
ataagacaga tcacaagttt gatcttgtga tatctgatat gtatacagat aatgattcta 19860
agagaaagca tgaaggcatg gtagccaata atggtaatga tgacgtcttc atataccttt 19920
ccaacttcct tcgtaacaat ttggctctgg gtggcagttt tgctgtgaaa ttaacagaga 19980
caagttggca cgagaattta tatgacattg cacaggactg tgcatggtgg acaatgtttt 20040
gtacagcggt taatgcttct tcctcggagg catttctgat tggtgttaat tacttgggtg 20100
caagtaaaaa ggttaaagtt agtggaaaaa cactgcacgc aaattatata ttttggagga 20160
attgtaatta tttacaaacc tctgcttata gtgtatttga cgttgcaaag tttgaattaa 20220
aactaaaagc aacgccagtt gttaatttga aaactgaaca aaagacagac ttagtcttta 20280
atttaattaa gtgtggtaag ttactggtaa gagatgttgg gcaaaccgct tttactagtg 20340
actctttggt atgcactatg tagtgctttg ctttatgata aaaatactta cgtttactac 20400
taccaaagtg cctttaggcc tggtcaaggt tggcatctac atgggggtgc ttatgcagta 20460
gataaggttt ttaatggaac caacaatgca gtcagtgtat ctgattgcac tgctggtact 20520
ttttatgaaa gctataatat ttctgctgct tctgtagcca tgacagtacc acctgctggt 20580
atgtcttggt cagttgcaca gttttgtaca gctcattgta acttctcaga ctttacagtg 20640
tttgttacgc attgttttaa aagtcaacaa ggtagttgtc cattgacagg tatgattcct 20700
cagaatcata ttcgtatttc tgctatgaga tctggatttt tgttttataa tttaacagtt 20760
agcgtatcta aataccctaa atttaaatcg cttcaatgtg ttggcaattc tacatctgtc 20820
tatttaaatg gtgatcttgt tttcactcct aatgaaacaa ctcacgttac gggtgcaggc 20880
gtttatttta aaagtggtgg gcctgtaact tataaagtta tgaaagaagt taaagcccta 20940
gcctacttta ttaatggtac cgcacaagag gttattttat gtgataactc acctagaggt 21000
ttgcttgcat gtcagtataa cactggtaat ttttcagatg gattctaccc ttttactaat 21060
tcttctttag ttaaggatag gtttattgta tatcgagaaa gtagcactaa cactacttta 21120
gagttaacta atttcacttt tactaatgta agtaatgctt ctcctaattc aggtggcgtt 21180
gatactttcc aattatatca aacacatact gctcaggatg gttattataa ttttaattta 21240
tcatttctga gtagttttgt gtataaacca tctgatttta tgtatgggtc ataccaccca 21300
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tcacttactt acggacccat tcaaggtggt tgtaagcaat ctgtttttag taataaagca 21420
acttgttgct atgcttattc ttaccgaggt cctactagat gtaagggtgt ttatagaggg 21480
gagctaacgc aatactttga atgtggactt ctagtttatg taactaagag tgatggctct 21540
cgtatacaaa ctagaagtga accactggtg ttaactcaat ataattataa caacattact 21600
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gtaactgaag caactgctaa ttatagttat ctagcagatg gtggtttagc tattttagat 21720
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attcttacat ctcataatga aacagattct gaatttattg agaaccagtt ttacatcaaa 21900
ctcactaacg gaacacgtcg ctctagacgt tctgttactg ggaatgttac aaattgccct 21960
tatgttagtt atggcaagtt ttgtataaaa ccagatggtt ctttatttat aatagtacca 22020
caagagttag aacagtttgt ggcgccttta ctcaatgtta ctgagcatgt gctcatacct 22080
gatagtttta atttaactgt cacagatgag tacatacaaa ctcgtatgga taaggttcaa 22140
attaattgcc ttcagtatgt ttgtggtaat tctattgaat gcagaaagtt gtttcagcag 22200
tatggacctg tttgtgataa tatattgtct gttgtaaatg gtgtaggtca aagagaggat 22260
atggaacttt taagtttcta ttcgtctact aaacctagtg gttacaatac accaattttt 22320
aataatgtta gcactggtga ctttaatatt tctctcttac taacaccacc taatagtcct 22380
actgggcgct cttttattga agatcttctt tttacaagtg tagaatctgt tggattacca 22440
actgatgaag agtataaaaa gtgtacagca ggacctttag gttttgttaa ggaccttgtt 22500
tgtgctagag agtataatgg cttgcttgtg ttgcctccta ttattactgc agacatgcaa 22560
actatgtata ctagctcttt agtagcctct atggctttag gtggcattac tgcagctggt 22620
gctatacctt ttgctacaca actgcaggcc agaattaacc atttgggtat tactaattct 22680
cttttgttga aaaatcaaga aaaaattgct gcttccttta ataaggccat cggtcatatg 22740
caggaagggt ttaaaagtac ttctctagca ttacaacaga ttcaagatgt tgttaataaa 22800
cagagttcta ttcttacaga gactatgcaa tcacttaata aaaattttgg tgctatttcc 22860
tccgtacttc aagacattta ccagcaactt gatgctattc aggcagatgc tcaggttgat 22920
cgtcttatta caggtagact ttcttcacta tctgttttag cttctgctaa acaggcagag 22980
tatcatagag tgtcacaaca gcgtgagttg gccactcaga aaattaatga gtgtgttaag 23040
tctcagtcta ataggtattc attttgtggt aatggaagac atgttttaac cataccacaa 23100
aatgcaccta atggtatagt gtttatacac tttacttata ctccagagag ttttgttaat 23160
gttactgcaa tagtgggttt ttgtgtaaat ccagctaatg ccagtcagta tgcaatagtg 23220
cccgttaata acagaggtat ttttattcaa gttaatggta gttactacat cactgcacgt 23280
gatatgtata tgccaagaga cattacagca ggagacatag ttatgcttac ttcttgtcaa 23340
gcaaattatg taagtgtaaa taagactgtc attactacat ttgtagataa tgatgacttt 23400
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gacgaattca attatacagt accagtatta aatattagta atgaaattga cagaattcaa 23520
gaagttattc agggattaaa tgactcccta atagatcttg aaacactctc aattcttaaa 23580
acttatatta agtggccttg gtatgtgtgg cttgccatag cttttgccat tattatcttc 23640
atcctaatct taggatgggt tttcttcatg actggttgtt gtggttgttg ttgtgggtgc 23700
ttcggcatta ttcctttaat gagtaagtgt ggtaaaaaat cttcttacta cacgactttt 23760
gataatgatg tggtaactga acaatacaga cctaaaaagt ctgtttaatg attcaaagtc 23820
ccacatcttt tctaatagta ttaattcttc tttggtgtaa acttgcatta agctgtttta 23880
aagagtgtgt tataacactc cagcaactaa tacaagtttt actccaaatt attaatagta 23940
acttacagtc tagacttctg ctttggcaca gtctagacta atgttagatt ttgaagcaat 24000
tattgaaact ggtcagcaaa taattcaaca aatcagtttc aatttacagc acatttcaag 24060
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tagaggaaaa tggaagtttt ctaacagcgg tttacgtgtt ttgtgcattt gtagcacttt 24240
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tttgaggata ttaatataaa ccctctttgc ttcatactct cttttcagga gttattattt 25260
aaaaaacagt ttttccactc ttttgtgcca aaaacagttt gtgttaatgg ggtgtccttc 25320
caagtagaca atggaaaagt ctattacgaa ggaaaaccaa ttttccaaaa aggttgttgt 25380
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tagataggtt aaatttagag cacggaccaa accgcgtttt aacgtgtagt aggcgagtgc 25620
ttttagttca attagattta gtttataggt tggcttgtac gcccacccaa tcgctggtat 25680
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cgcgtgcacc tctctagtat tccacgggaa aacttgtgag gcgcacataa ataataataa 25860
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gaaaatgaaa acttaaaatc aagccagcag cacggatact ggagacgcca acaccggtat 26100
aaaccaggta aaggcggaag aaaaccagtt ccagatgctt ggtactttta ttacactgga 26160
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gctaaaggtg ctgatactaa atctagatct aaccagggta caagagatcc tgataagttt 26280
gaccaatacc cactgcgatt ctcagacggg ggaccggatg gtaacttccg ttgggatttc 26340
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acctcagatg aagagaggaa caatgcacag ctcgagtttg atgatgaacc caaagtgatt 27060
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atttgctgtc acattttgtt aaatactatt ttgttgcttt cctatcaatt attacaggca 27180
ttgattgtga ttatgtgcaa tatttaagct acttttggtt gctttttgct tgttgtattg 27240
ttgctgtgct ttttattatt gtgattctca ttagtttgct ttatcgtaga agtgcaatag 27300
taagagttaa ggaagatagg catgtagctt gattacctac atgtctatcg ccagggaaat 27360
gtctaatctg tctacttagt agcctggaaa cgaacggtag acccttagat tttaatttag 27420
tttaattttt agtttagttt aagttagttt agagtaggta taaagaagcc agtgccgggg 27480
ccacgcggag tacgatcgag ggtacagcac taggacgccc actaggggaa gagctaaatt 27540
ttagtttaag ttaagtttaa ttggctaagt atagttaaaa tttataggct agtatagagt 27600
tagagcaaaa aaaaaaaa 27618
<210> 54
<211> 1164
<212> PRT
<213> 禽类传染性支气管炎病毒
<400> 54
Met Leu Gly Lys Pro Leu Leu Leu Val Thr Leu Trp Tyr Ala Leu Cys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Leu Tyr Asp Lys Asn Thr Tyr Val Tyr Tyr Tyr Gln Ser
20 25 30
Ala Phe Arg Pro Gly Gln Gly Trp His Leu His Gly Gly Ala Tyr Ala
35 40 45
Val Asp Lys Val Phe Asn Gly Thr Asn Asn Ala Val Ser Val Ser Asp
50 55 60
Cys Thr Ala Gly Thr Phe Tyr Glu Ser Tyr Asn Ile Ser Ala Ala Ser
65 70 75 80
Val Ala Met Thr Val Pro Pro Ala Gly Met Ser Trp Ser Val Ala Gln
85 90 95
Phe Cys Thr Ala His Cys Asn Phe Ser Asp Phe Thr Val Phe Val Thr
100 105 110
His Cys Phe Lys Ser Gln Gln Gly Ser Cys Pro Leu Thr Gly Met Ile
115 120 125
Pro Gln Asn His Ile Arg Ile Ser Ala Met Arg Ser Gly Phe Leu Phe
130 135 140
Tyr Asn Leu Thr Val Ser Val Ser Lys Tyr Pro Lys Phe Lys Ser Leu
145 150 155 160
Gln Cys Val Gly Asn Ser Thr Ser Val Tyr Leu Asn Gly Asp Leu Val
165 170 175
Phe Thr Pro Asn Glu Thr Thr His Val Thr Gly Ala Gly Val Tyr Phe
180 185 190
Lys Ser Gly Gly Pro Val Thr Tyr Lys Val Met Lys Glu Val Lys Ala
195 200 205
Leu Ala Tyr Phe Ile Asn Gly Thr Ala Gln Glu Val Ile Leu Cys Asp
210 215 220
Asn Ser Pro Arg Gly Leu Leu Ala Cys Gln Tyr Asn Thr Gly Asn Phe
225 230 235 240
Ser Asp Gly Phe Tyr Pro Phe Thr Asn Ser Ser Leu Val Lys Asp Arg
245 250 255
Phe Ile Val Tyr Arg Glu Ser Ser Thr Asn Thr Thr Leu Glu Leu Thr
260 265 270
Asn Phe Thr Phe Thr Asn Val Ser Asn Ala Ser Pro Asn Ser Gly Gly
275 280 285
Val Asp Thr Phe Gln Leu Tyr Gln Thr His Thr Ala Gln Asp Gly Tyr
290 295 300
Tyr Asn Phe Asn Leu Ser Phe Leu Ser Ser Phe Val Tyr Lys Pro Ser
305 310 315 320
Asp Phe Met Tyr Gly Ser Tyr His Pro Asn Cys Asn Phe Arg Pro Glu
325 330 335
Asn Ile Asn Asn Gly Leu Trp Phe Asn Ser Leu Ser Val Ser Leu Thr
340 345 350
Tyr Gly Pro Ile Gln Gly Gly Cys Lys Gln Ser Val Phe Ser Asn Lys
355 360 365
Ala Thr Cys Cys Tyr Ala Tyr Ser Tyr Arg Gly Pro Thr Arg Cys Lys
370 375 380
Gly Val Tyr Arg Gly Glu Leu Thr Gln Tyr Phe Glu Cys Gly Leu Leu
385 390 395 400
Val Tyr Val Thr Lys Ser Asp Gly Ser Arg Ile Gln Thr Arg Ser Glu
405 410 415
Pro Leu Val Leu Thr Gln Tyr Asn Tyr Asn Asn Ile Thr Leu Asn Lys
420 425 430
Cys Val Glu Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Val Gly Gln Gly Phe Ile Thr
435 440 445
Asn Val Thr Glu Ala Thr Ala Asn Tyr Ser Tyr Leu Ala Asp Gly Gly
450 455 460
Leu Ala Ile Leu Asp Thr Ser Gly Ala Ile Asp Ile Phe Val Val Arg
465 470 475 480
Gly Ala Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr Lys Val Asn Pro Cys Glu Asp Val
485 490 495
Asn Gln Gln Phe Val Val Ser Gly Gly Asn Leu Val Gly Ile Leu Thr
500 505 510
Ser His Asn Glu Thr Asp Ser Glu Phe Ile Glu Asn Gln Phe Tyr Ile
515 520 525
Lys Leu Thr Asn Gly Thr Arg Arg Ser Arg Arg Ser Val Thr Gly Asn
530 535 540
Val Thr Asn Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Gly Lys Phe Cys Ile Lys Pro
545 550 555 560
Asp Gly Ser Leu Phe Ile Ile Val Pro Gln Glu Leu Glu Gln Phe Val
565 570 575
Ala Pro Leu Leu Asn Val Thr Glu His Val Leu Ile Pro Asp Ser Phe
580 585 590
Asn Leu Thr Val Thr Asp Glu Tyr Ile Gln Thr Arg Met Asp Lys Val
595 600 605
Gln Ile Asn Cys Leu Gln Tyr Val Cys Gly Asn Ser Ile Glu Cys Arg
610 615 620
Lys Leu Phe Gln Gln Tyr Gly Pro Val Cys Asp Asn Ile Leu Ser Val
625 630 635 640
Val Asn Gly Val Gly Gln Arg Glu Asp Met Glu Leu Leu Ser Phe Tyr
645 650 655
Ser Ser Thr Lys Pro Ser Gly Tyr Asn Thr Pro Ile Phe Asn Asn Val
660 665 670
Ser Thr Gly Asp Phe Asn Ile Ser Leu Leu Leu Thr Pro Pro Asn Ser
675 680 685
Pro Thr Gly Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Thr Ser Val Glu
690 695 700
Ser Val Gly Leu Pro Thr Asp Glu Glu Tyr Lys Lys Cys Thr Ala Gly
705 710 715 720
Pro Leu Gly Phe Val Lys Asp Leu Val Cys Ala Arg Glu Tyr Asn Gly
725 730 735
Leu Leu Val Leu Pro Pro Ile Ile Thr Ala Asp Met Gln Thr Met Tyr
740 745 750
Thr Ser Ser Leu Val Ala Ser Met Ala Leu Gly Gly Ile Thr Ala Ala
755 760 765
Gly Ala Ile Pro Phe Ala Thr Gln Leu Gln Ala Arg Ile Asn His Leu
770 775 780
Gly Ile Thr Asn Ser Leu Leu Leu Lys Asn Gln Glu Lys Ile Ala Ala
785 790 795 800
Ser Phe Asn Lys Ala Ile Gly His Met Gln Glu Gly Phe Lys Ser Thr
805 810 815
Ser Leu Ala Leu Gln Gln Ile Gln Asp Val Val Asn Lys Gln Ser Ser
820 825 830
Ile Leu Thr Glu Thr Met Gln Ser Leu Asn Lys Asn Phe Gly Ala Ile
835 840 845
Ser Ser Val Leu Gln Asp Ile Tyr Gln Gln Leu Asp Ala Ile Gln Ala
850 855 860
Asp Ala Gln Val Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ser Leu Ser
865 870 875 880
Val Leu Ala Ser Ala Lys Gln Ala Glu Tyr His Arg Val Ser Gln Gln
885 890 895
Arg Glu Leu Ala Thr Gln Lys Ile Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser
900 905 910
Asn Arg Tyr Ser Phe Cys Gly Asn Gly Arg His Val Leu Thr Ile Pro
915 920 925
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Glu Ser Phe Val Asn Val Thr Ala Ile Val Gly Phe Cys Val Asn Pro
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Ala Asn Ala Ser Gln Tyr Ala Ile Val Pro Val Asn Asn Arg Gly Ile
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Phe Ile Gln Val Asn Gly Ser Tyr Tyr Ile Thr Ala Arg Asp Met Tyr
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<211> 588
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<213> 禽类传染性支气管炎病毒
<400> 55
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<400> 56
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<400> 57
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
ggtaacttaa caatacagac ctaaaaagtc tg 32
机译: 4/91 IBV疫苗,带有杂种刺突蛋白
机译: 4/91 IBV疫苗,带有杂种刺突蛋白
机译: 4/91 IBV疫苗与异源穗蛋白