用于检测和识别液体分散样品中的细胞外囊泡的装置和方法

摘要

用于检测液体分散样品中分散的细胞外囊泡的装置和方法，所述方法使用电子数据处理器将样品分类为存在或不存在细胞外囊泡，该方法包括使用电子数据处理器用多个细胞外囊泡液体分散样本预训练机器学习分类器，包括以下步骤：将通过调制频率调制的激光发射到每个样本上；在每个样本的预定持续时间的多个时间周期内，从由每个样本反向散射的激光捕获时间信号；对于时间周期中的每一个时间周期，从所捕获的信号计算样本DCT或小波变换系数；使用所计算的系数预训练机器学习分类器；其中，该方法进一步包括以下步骤：使用具有耦接到发射器的聚焦光学系统的激光发射器将通过调制频率调制的激光发射到样品上；在预定持续时间的多个时间周期内，使用光接收器从由样品反向散射的激光中捕获信号；对于时间周期中的每一个时间周期，从所捕获的信号计算样品DCT或小波变换系数；使用预训练的机器学习分类器将所计算的样品系数分类为存在或不存在细胞外囊泡。

说明书

技术领域

本公开涉及一种用于检测细胞外囊泡(EV)的方法和装置。

背景技术

细胞外囊泡(EV)由于其在细胞间通信中的高潜在作用以及用作诊断和健康评估的转化生物标记物，已经引起了学术界和工业界两者的越来越多的关注。术语EV描述了源自细胞的膜状囊泡，直径在30nm至1000nm之间，大多数被认为在100nm至150nm范围内。

由于它们的小尺寸和复杂性，常规技术已经努力检测和识别由不同细胞群体产生的EV。实际上，尺寸范围从100nm至150nm，使用光学装置(optical means)来检测EV是具有挑战性的，因为它远低于光衍射极限[1，2]。

目前，缺少与检测这种尺寸范围内的粒子兼容的仪器，其中，电子显微镜

使用高分辨率流式细胞仪的细胞外囊泡检测(主要是外泌体)被估计用于90％的生物来源的纳米粒子研究中[1，2]。尽管与常规方法相比，包括在这些新方法中的分辨率有改进，但是它仍然基于体积庞大且甚至更昂贵的设备(例如，需要高功率激光器，与常规方法相比，具有较小的聚焦光束的光斑尺寸)

考虑到粒子与关键的散射特性(诸如粒子尺寸、折射率、形状/几何形状、成分、含量类型(合成的、生物的)以及与周围介质的相互作用的类型)的依赖性，被粒子散射的光量被认为是用于简单粒子表征的金标准技术[3-5]。由于表达的蛋白质的类型和它们之间的细胞内负荷物差异，不同的细胞或细胞器的折光率值通常是不同的[5]。

这些文献均未教导适合于检测液体样品中的细胞外囊泡的方法或装置。公开这些事实是为了说明由本公开解决的技术问题。

[1]Steinbichler,T.，Dudás，J.，Riechelmann，H.&Skvortsova，I.The role ofexosomes in cancer metastasis.Seminars in cancer biology 44，170-181(2017).

[2]Welsh，J.，Holloway，J.，Wilkinson，J.&Enlyst，N.Extracellular vesicleflow cytometry analysis and standardization.Frontiers in Cell andDevelopmental Biology 5，78(2017).

[3]Mei，Z.，Wu，T.，Pion-Tonachini，L.，Qiao，W.，Zhao，C.，Liu，Z.，and Lo，Y.，“Applying an optical space-time coding method to enhance light scatteringsignals in microfluidic devices,”Biomicrofluidics 5(3)，034116(2011).

[4]Wu，T.，Cho，S.，Chiu，Y.，andLo，Y.，“Lab-on-a-Chip Device and System forPoint-of-Care Applications，”Handbook of Photonics for Biomedical Engineering，87-121(2017).

[5]Welsh，J.，Holloway,J.，Wilkinson，J.，and Englyst，N.，“Extracellularvesicle flow cytometry analysis and standardization,”Frontiers in cell anddevelopmental biology 5，78(2017).

发明内容

本公开的主要目的是一种用于检测液体分散样品中的细胞外囊泡(EV)的方法和装置。

所提出的方法和装置可以检测复杂的液体溶液中复杂的生物纳米粒子(例如，特定类型的癌症外泌体)的存在。所公开的方法和装置覆盖了关于在30nm与24μm之间的目标尺寸的检测范围。

本公开对于在快速和简单的实施例中区分EV的类型极其有用。

在一个特定实施例中，该装置可以被嵌入微流微芯片中以进行快速临床诊断，或者被集成在自动化食品生产系统中，以根据特定的产品标准对酵母/其他微复合物进行分类和选择。

公开了一种用于检测液体分散样品中的细胞外囊泡的装置，所述装置包括：激光发射器；耦接到发射器的聚焦光学系统；红外光接收器；以及电子数据处理器，该电子数据处理器被布置为使用机器学习分类器将样品分类为存在或不存在细胞外囊泡，该机器学习分类器已经通过以下方法使用多个细胞外囊泡液体分散样本被预训练，该方法包括：

将通过调制频率调制的激光发射到每个样本上；

在每个样本的预定持续时间的多个时间周期内，从每个样本反向散射的激光捕获时间信号；

对于时间周期中的每一个时间周期，从所捕获的信号计算样本DCT或小波变换系数；

使用所计算的系数预训练机器学习分类器；

其中，电子数据处理器被进一步布置为：

使用激光发射器将通过调制频率调制的激光发射到样品上；

在预定持续时间的多个时间周期内，使用光接收器从由样品反向散射的激光中捕获信号；

对于时间周期中的每一个时间周期，从所捕获的信号计算样品DCT或小波变换系数；

使用预训练的机器学习分类器将所计算的样品系数分类为存在或不存在细胞外囊泡。

还公开了一种用于检测液体分散样品中的细胞外囊泡的方法，所述方法使用电子数据处理器将样品分类为存在或不存在细胞外囊泡，

该方法包括使用电子数据处理器用多个细胞外囊泡液体分散样本预训练机器学习分类器，包括以下步骤：

将通过调制频率调制的激光发射到每个样本上；

在每个样本的预定持续时间的多个时间周期内，从由每个样本反向散射的激光捕获时间信号；

对于时间周期中的每一个时间周期，从所捕获的信号计算样本DCT或小波变换系数；

使用所计算的系数预训练机器学习分类器；

其中，该方法进一步包括以下步骤：

使用具有耦接到发射器的聚焦光学系统的激光发射器将通过调制频率调制的激光发射到样品上；

在预定持续时间的多个时间周期内，使用光接收器从由样品反向散射的激光中捕获信号；

对于时间周期中的每一个时间周期，从所捕获的信号计算样品DCT或小波变换系数；

使用预训练的机器学习分类器将所计算的样品系数分类为存在或不存在细胞外囊泡。

在一个实施例中，电子数据处理器被进一步布置为：如果存在细胞外囊泡，通过使用机器学习分类器将细胞外囊泡分类为多个细胞外囊泡类型类别中的一个细胞外囊泡类型类别，该机器学习分类器已经使用多个细胞外囊泡液体分散样本类型类别被预训练。

在一个实施例中，激光器是可见光激光器或红外激光器或它们的组合，尤其是红外激光器，并且接收器是可见光和红外接收器。

在一个实施例中，通过一个或多个附加调制频率进一步调制激光器。

在一个实施例中，样本调制频率和样品调制频率是相同的。

在一个实施例中，样本预定持续时间和样品预定持续时间是相同的。

在一个实施例中，通过划分比预定持续时间更长的持续时间的所捕获的时间信号来获得预定持续时间的所捕获的多个时间周期。

在一个实施例中，所划分的时间周期是重叠的时间周期。

在一个实施例中，预定时间持续时间选自1.5至2.5秒，尤其是2秒。

在一个实施例中，电子数据处理器被进一步布置为使用来自所捕获的信号的时域直方图衍生的特征或时域统计衍生的特征，尤其是以下特征：ω

在一个实施例中，聚焦光学系统是聚光透镜。

在一个实施例中，聚焦光学系统是聚光透镜，该聚光透镜是布置在光纤或波导的尖端处的聚合物聚光器。

在一个实施例中，聚焦光学系统是适于提供场梯度图案的聚焦光学系统，尤其是聚合物透镜、纤维锥、振幅或相位菲涅耳板或添加有具有一厚度的一个或多个金膜和用于等离子效应的纳米或微孔或孔阵列中的任何一种。

在一个实施例中，透镜具有与透镜的基本直径的1/3至1/4的束腰相对应的聚焦光斑。

在一个实施例中，透镜的数值孔径NA大于0.5。

在一个实施例中，透镜的基本直径为5-10μm，尤其是6-8μm。

在一个实施例中，透镜是球形的，并且长度为30-50μm，尤其是37-47μm。

在一个实施例中，透镜的曲率半径为2-5μm，尤其是2.5-3.5μm。

在一个实施例中，红外光接收器是包括400-1000nm的带宽的感光器。

在一个实施例中，变换系数的计算包括：选择变换系数的最小子集，使得通过变换来保留信号的总能量的预定百分比。

在一个实施例中，DCT变换系数的最小子集的数量从20至40中选择，或者从20、30或40中选择。

在一个实施例中，至少以至少为调制频率的五倍的采样频率来执行信号捕获。

在一个实施例中，信号捕获包括高通滤波器。

在一个实施例中，调制频率等于或高于1kHz。

在一个实施例中，细胞外囊泡在任何粒子方向上的粒子尺寸小于1μm或在30nm与30μm之间。

还公开了一种非暂时性存储介质，其包括用于实现用于检测液体分散样品中的细胞外囊泡的方法的程序指令，该程序指令包括可由电子数据处理器执行以实施所公开的实施例中任一项的方法的指令。

作为DCT或小波变换的替代，可以使用DCT和小波变换两者，或者可以使用另一时间序列降维变换，或者可以使用多个时间序列降维变换。

在一个实施例中，时间序列降维变换是离散余弦变换DCT。

在一个实施例中，时间序列降维变换是小波变换。

在一个实施例中，小波类型是哈尔(Haar)和德比契斯(Daubechies)(Db10)。

可以通过不同类型的纳米粒子对高度聚焦的电磁势的不同响应来解释本公开。然后，在不同类型的纳米结构中，两种类型的现象可能促进该不同的响应：其在液体分散体中的布朗运动模式和/或其不同的光学极化率，固有地与其微观折射率相关。因此，布朗运动模式和/或光学极化率由DCT和从反向散射光提取的小波衍生的参数暴露，该参数被所述预训练的机器学习分类器用于对细胞外囊泡进行分类。

在这种情况下，本公开使用由液体分散体中的纳米粒子的相对布朗运动(由分散体中的粒子扩散系数-仅取决于粒子尺寸的参数-决定)和对高度聚焦的电磁势的响应(取决于粒子的光学极化率)两者所导致的相长干涉和相消干涉所引起的散射强度的不同的时间依赖性波动。这两种效应的叠加允许以相同的大小区分EV，这是不可能使用基于现有技术的光散射方法。

本公开适用于示出由影响反向散射光和不同的光学极化率(或微观折射率)的液体分散样品中的纳米粒子的相对布朗运动所导致的相长干涉和相消干涉所引起的散射强度的不同的时间依赖性波动的纳米粒子或微粒子。

本公开检测和识别具有预定直径和/或折射率和/或光学极化率的纳米粒子。

本公开还适用于单个细胞，其中，该装置可以用于检测液体分散样品中的单个细胞。此外，本公开还适用于对液体分散样品中的单个细胞进行分类。这些可以被优选地被捕获以用于测量。细胞可以是个体化细胞，尤其是个体化人类细胞，或单细胞微生物。例如，具有传感能力的光纤镊子能够提供关于在测量期间稳定捕获的个体化目标粒子的有意义且特定的信息。

具体地，本公开适用于检测翻译后修饰，例如磷酸化或糖基化事件，像被认为是某些癌症中不良预后的预测标记的较短或截短的O-聚糖。这些现象通常与细胞糖基化期间不完全的聚糖合成相关联。

附图说明

以下附图提供了用于说明描述的优选实施例，并且不应被视为限制本发明的范围。

图1：根据实施例的光学设置的示意性表示。

图2：根据实施例的光学集中器的示意性表示。

图3：根据实施例的信号处理流程的示意性表示。

图4：从针对EV类型和EV类型的反向散射信号的模拟中提取的两个最重要的DCT衍生的特征的2D分布的图形表示(十字与圆圈)。

图5：考虑到包括三类粒子的实验的示例，根据如何划分数据以用于训练和测试的实施例的示意性表示，其中，“n”旨在表示评估运行次数/训练集与测试集之间的不同组合的次数。

图6：包含复杂生物纳米粒子的复杂溶液的实验的信号图。

具体实施方式

下面更详细地描述本公开。

在图1中，描绘了光学设置(100)。光学设置中包括带尾纤的980nm激光器(500mW，Lumics，参考文献LU0980M500)(105)。具有1×2拓扑结构的50/50光纤耦合器(110)用于连接两个输入-激光器(105)和光电探测器(115)(反向散射信号采集模块)。然后将光纤尖端(120)接合到光纤耦合器(110)的输出，并插入由电动微操纵器(130)控制的金属毛细管(125)中。该配置允许激光通过光纤引导到光纤尖端(120)和通过光电探测器(PDA36A-EC，Thorlabs)(115)获取反向散射信号两者。除了光电探测器之外，反向散射信号采集模块还由模数采集板(National Instruments DAQ)(135)组成，该模数采集板连接到光电探测器(115)以将所采集的信号发送到存储该信号的膝上型计算机以进行进一步处理(145)。DAQ(135)的数模输出也连接到激光器，以使用基频为1kHz的正弦信号调制其信号。将液体样品(140)装载在玻璃盖玻片上，并且将其末端具有聚光器的纤维(120)插入该样品中。

聚光器的类型在图2中示出，并且由通过导波光聚合方法制造的聚合物透镜组成。该聚光器的特点是NA＞0.5的聚光球面透镜，能够将激光束聚焦到与透镜的基本直径的约1/3至1/4的束腰相对应的高度聚焦光斑上。另外，基本直径在6-8μm(205)之间，并且曲率半径在2-3.5μm之间也是合适的解决方案。将具有聚光器的光纤尖端浸入到液体样品中，并且考虑到尖端在溶液中的不同位置采集反向散射信号。

参考图3来解释信号采集和处理。对于所有实验(I-VII)，通过连接到模数转换器(National Instruments DAQ)的光电探测器(PDA 36A-EC，Thorlabs)以5kHz的采样率采集反向散射的原始信号。在每次采集之后，原始信号都会经过处理步骤。在信号处理期间，首先使用二阶500Hz巴特沃思高通滤波器(305)对信号进行滤波，这是因为使用1kHz正弦信号调制输入照射激光，并且去除采集信号的噪声低频分量(例如，50Hz电网分量)。然后，将针对每个粒子和条件采集的整个信号划分为2秒的历元(310)。计算每个2秒信号部分的z分数以便去除噪声信号历元(315)。去除大小超过5至10之间的阈值的2秒z分数信号部分(315)。在这些步骤之后，可以获得具有2秒信号部分的数据集(具有合理的信噪比(SNR))，从而可以进行EV类型识别(320)。

从反向散射信号中提取总共54个特征(图3，325)以表征每个类别，该类别可以分为两个主要类型：时域特征和频域特征。第一组可以分为两个子集：时域统计衍生的特征和时域直方图衍生的特征。频域集也分为两组：离散余弦变换(DCT)衍生的特征和小波特征。表1中总结了所考虑的54个特征。

考虑到其在区分具有统计学意义的不同类型的合成粒子和酵母细胞方面的充分性，从每个2秒信号部分中提取以下时域统计特征：标准偏差(SD)、均方根(RMS)、偏度(Skew)、峰度(Kurt)、四分位距(IQR)、熵(E)。考虑到Nakagami分布已经被广泛用于以统计术语描述反向散射回波，主要在生物医学领域内，还考虑了概率密度函数(PDF)衍生的μ

其中，ε

其中，E

在使用小波

本公开能够检测和识别不同类型的细胞外囊泡，因为从反向散射信号中提取频率衍生的特征，这些特征对粒子的尺寸、光学极化率和微观折射率敏感。

如等式3所述，纳米粒子的运动受扩散率D和粒子对由高聚焦的电磁场施加在其上的光电势的响应两者的影响。因此，粒子位置随时间的变化性由等式3给出：

其中，k

其中，

其中，n

等式3和等式4与用于描述现有技术方法(例如，动态光散射)中纳米粒子的布朗运动的“较简单”公式形成对比，该公式仅取决于粒子在分散体内的扩散率D。这种简单的布朗运动是由粒子位置随时间的变化性(σ(t))给出的：

σ(t)＝2Dt. (5)

以及D：

其中，k

参考图4以说明使用理论模拟由具有近似相同大小的两个不同EV的群体(群体a和b)的集合散射的光的强度获得的结果。使用两个EV的群体a和b，并且其特征在于：r

分类算法用于检测液体样品中的EV，即随机森林分类器。

参考图5来解释留一出过程(Leave-One-Out procedure)(400)，其被执行以确保用于评估分类器的性能的数据属于从未参与训练的主体/实体。因此，如果数据集由来自n个主体/实体的数据组成，则将测试集划分为n个测试回合，其中，在每个回合中，将来自主体的数据用于测试，并且将来自剩余n-1个主体的数据用于分类器训练。在下一回合中，来自在前一回合中被选择用于训练的另一主体的数据子集将单独用于测试分类器。然后，基于在n个测试回合之后获得的均值来确定分类器性能。

上述方法和装置被用于若干实验中以证明其可行性和实现目标的潜力。因此，实验II、IV、V、VI和VII被设计为不使特定粒子个体化并识别它，而是检测溶液中给定类型的纳米粒子的存在，稍微修改以上基于留一出的方法。区分在涉及纳米粒子和微粒的实验期间采集的2秒信号部分的因素是它们在采集之间发生的位置。因此，在用纳米粒子的实验期间，在不同于考虑用于训练的信号部分的位置处采集用于测试的信号部分，这是一种避免过拟合效应的方式。注意，在这些情况下，由于粒子的纳米级尺寸和我们的纤维工具无法捕获粒子，因此无法使粒子个体化。

通过确定三个参数(树的数量、要采样的预测数量和最小叶大小-请参考表1)之间最合适的值组合来获得实验/问题和第n次评估运行中的每一个的最准确的分类率(图5，405)。因此，考虑到值的组合，该组合产生了训练的分类器(图5，405)。然后，在训练阶段期间，针对每次实验和评估运行，使用五重交叉验证(图5，405)确定这些参数的最有效组合。然而，训练样品被标准化。将每个特征的训练样品均值减去该特征的每个数据样品，并且然后除以对应的特征标准偏差。还必须根据该过程，使用先前获得的每个特征的训练均值和标准偏差来标准化测试输入样品。这允许在训练特征空间中映射新颖的测试特征向量。

表1：在模型优化的分类器训练阶段期间调整的参数的列表，Nr.-数量，Min.-最小

在实验II、VI和VII中使用的两种所选择的细胞系及其EV衍生自胃癌细胞系MKN45：HST6(由于ST6GalNAcl唾液酸转移酶的过度表达，经过基因修饰以在其表面呈现较短/截短的O-聚糖)和Mock(用不会诱导O-聚糖发生任何变化的空载体转染对应的对照细胞)。所提及的Mock和HST6癌细胞系仅在附着于其表面的O-聚糖(碳水化合物)上不同。

较短或截短的O-聚糖被认为是某些癌症中不良预后的预测标记。与健康状况下的细胞途径相比，这些现象通常与细胞糖基化期间不完全的聚糖合成相关联。

实验II在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以四类问题测试真核细胞的识别和分类。制备三种类型的溶液来测试所提出的单细胞识别方法。这三种类型的溶液中的两种溶液是由以下所述的不同糖基化的癌细胞-Mock和HST6-悬浮在PBS(磷酸盐缓冲液，1×)中组成的。第三溶液包含8μm聚苯乙烯(PS)合成微球也悬浮在PBS(1×)中。

实验IV以以下三类问题测试PBS中的细菌细胞的识别和分类：(1)“未捕获粒子”；(2)“捕获的嗜酸乳杆菌酸奶细菌”，以及(3)“捕获的嗜热链球菌酸奶细菌”(目标尺寸：1.5-0.6μm)。

实验VI和VII测试了产生的HST6和Mock细胞的细胞外囊泡的识别和分类。

实验VI通过所提出的方法和装置测试悬浮在PBS中的Mock衍生的外泌体和HST6衍生的外泌体；所考虑的类别：“类别1：无外来体(仅空白溶液)”；“类别2：悬浮存在Mock衍生的外泌体”和“类别3：悬浮存在HST6衍生的外泌体”。

实验VII是在具有挑战性的条件下使用补充有胎牛血清(FBS)的PBS(一种具有高浓度蛋白质、糖和脂质的复杂液体培养基)以使EV再悬浮来进行的。处理该FBS以去除天然EV。图6示出了用以下三种不同类型的样品获得的背向散射信号：具有细胞培养基的无EV的FBS(A)、补充有具有细胞培养基的Mock EV的无EV的FBS(B)以及补充有具有细胞培养基的HST6 EV的无EV的FBS(C)。

表2总结了用本公开获得的实验结果，尤其是关于通过所提出的方法和装置在细胞与EV之间的分化性能的结果。

无论何时，在本文件中使用的术语“包括”旨在表示所述特征、整数、步骤、组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、组件或其组的存在或添加。不应以任何方式将本公开视为限于所描述的实施例，并且本领域普通技术人员将预见对其修改的许多可能性。上述实施例是可组合的。以下权利要求进一步阐述了本公开的具体实施例。

表2：在三种不同情况下(实验V、VI和VII)的细胞外囊泡(EV)识别的结果

表3：考虑到暴露的垂直劈开光纤和在其末端具有聚光器的光纤的EV识别性能差异