一种脑靶向紫杉醇脂质体配体及其制备方法及应用

摘要

本发明提供两种脑靶向脂质体配体分子CHS‑SE‑GLUCHS‑SE‑MAN及其合成方法及其载药系统，采用具有上述配体分子的载药系统，兼具“跨BBB”和“靶向脑胶质瘤”双重功能，共修饰靶向脂质体可以靶向到脑组织，避免载药后对正常细胞的损伤。

说明书

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种脑靶向脂质体配体及其制备方法以及应用。

背景技术

脑胶质瘤是由于大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的、最常见的原发性颅脑肿瘤，其治疗效果不理想，而且恶性脑胶质瘤患者的生存时间一般不超过1年。目前临床上脑胶质瘤治疗以手术为主，并结合放疗、化疗等措施综合治疗。然而手术因颅内禁区多难以彻底清除病灶，加之肿瘤浸润性生长，极易复发；放疗因剂量难以控制，易引起不可逆的颅内损伤及诱发继发性恶性肿瘤，使得化疗逐渐成为脑胶质瘤临床治疗的重要手段。目前临床可用于治疗脑胶质瘤的药物极其有限，而且开发治疗脑胶质瘤的新药常常以失败告终，其主要原因是药物难于跨越血脑屏障(blood brain barrier，BBB)进入大脑、药物入脑后分布无特异性，进而无法靶向于病变组织发挥疗效、多药耐药性等因素。因此寻找新的更加有效的抗肿瘤药物，让该药物能透过BBB，并转运至大脑病变组织，是当前治疗脑胶质瘤药物的开发迫切需要解决的关键问题。

紫杉醇(paclitaxel)是从中药红豆杉植物中分离得到的抗癌活性成分，具有独特的作用机理，能够阻止肿瘤细胞生长，是一种广谱的抗癌药。有研究证明，紫杉醇对体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞具有明显的增殖抑制作用和杀伤作用，而且不易产生耐药性，是一种很有潜力的抗胶质瘤药物，然而，紫杉醇因毒副作用大、同样存在透血脑屏障(BBB)难及入脑后分布无特异性而不能应用，因此，非常有必要开发一种高效、低毒的治疗脑胶质瘤紫杉醇类药物的新方法。

发明内容

本发明提供一种脑靶向脂质体配体分子CHS-SE-GLU，结构如下：

本发明还提供一种脑靶向脂质体配体分子CHS-SE-MAN，结构如下：

本发明还提供上述两种一种脑靶向脂质体配体分子的合成方法，具体步骤包括：

(1)以胆固醇-癸二酸单烯酯(CHS-SE)为起始原料，在生物酶区域选择性催化下，与GLU上C6-OH酯化偶联，即得脑靶向脂质材料CHS-SE-GLU；

(2)以胆固醇-癸二酸单烯酯(CHS-SE)和α-甲基-D-甘露糖苷(Methylα -D-mannopyranoside，α-Manl-OMe)为原料，在生物酶区域选择性催化下，CHS-SE 与α-Manl-OMe上C6-OH酯化偶联，即得脑胶质瘤靶向脂质材料CHS-SE-MAN；

优选地，所述生物酶选自Novozym 435、Lipase NS、Lipozyme TL IM中的一种或其组合。

优选地，所述合成温度为20℃-60℃，更优选为室温。

与化学合成方法相比，本发明针对具有刚性或环结构的底物，优化生物酶做催化剂，使合成步骤大大简化，且反应条件温和，副产物少，纯化方法简便，所用试剂毒性小，目标产物总收率能达80％以上。

本发明还提供采用上述脑靶向脂质体配体分子制备的载药系统，所述载药系统，按照质量配比，HSPC：CHS：CHS-SE-GLU或CHS-SE-MAN：DSPG-Na的比例为 30-50：10-30：0.5-2：3-5。

本发明还提供采用上述两个脑靶向脂质体配体分子制备的载药系统，所述载药系统，按照质量配比，HSPC：CHS：CHS-SE-GLU和CHS-SE-MAN：DSPG-Na的比例为30-50：10-30：0.5-2：3-5。

优选地，所述CHS-SE-GLU和CHS-SE-MAN的质量配比为1：0.5-1：2，更优选为1：1。

本发明还提供一种脑靶向紫杉醇脂质体配体分子制备的载药系统，所述载药系统，按照质量配比，HSPC：CHS：CHS-SE-GLU或CHS-SE-MAN：DSPG-Na：紫杉醇的比例为30-50：10-30：0.5-2：3-5：0.5-2。

本发明还提供采用上述两个脑靶向紫杉醇脂质体配体分子制备的载药系统，所述载药系统，按照质量配比，HSPC：CHS：CHS-SE-GLU和CHS-SE-MAN：DSPG-Na：紫杉醇的比例为30-50：10-30：0.5-2：3-5：0.5-2。

优选地，所述CHS-SE-GLU和CHS-SE-MAN的质量配比为1：0.5-1：2，更优选为1：1。

本发明首次研发兼具“跨BBB”和“靶向脑胶质瘤”双重功能的脑胶质瘤“二级靶向”的载药系统。具体来说，本发明将CHS-SE-MAN特异性靶向配体分子连接到脂质体的表面，能够增强脂质体对肿瘤细胞的选择性，进一步加入并配体分子CHS-SE-GLU，结果显示，共修饰靶向脂质体可以靶向到脑组织，避免载药后对正常细胞的损伤。

附图说明

图1 CHS-SE-MAN MS图

图2 CHS-SE-MAN 13C NMR图

图3 CHS-SE-MAN 1H NMR图

图4酶的种类对合成产率的影响

图5 C6细胞对FL-LP、FL-GLU-MAN-LP摄取率比较

图6载DiR的不同脂质体在不同时间点下的鼠体内分布(A：普通脂质体；B： CHS-SE-GLU修饰脂质体；C：CHS-SE-MAN修饰脂质体；D：CHS-SE-GLU+ CHS-SE-MAN修饰脂质体。)

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1酶促合成CHS-SE-GLU及结构表征

取具塞锥形瓶，称取1g GLU、6.6g CHS-SE，加入脱水丙酮适量溶解，置于恒温震荡器于45℃振摇30min后，加入酶适量，反应12h。待反应终止后，过滤除去酶，旋蒸得混合物，用乙酸乙酯溶解后低温重结晶，2次重结晶后减压抽滤，真空干燥得白色粉末状产物。收率约90％。反应路线如下：

产物结构经MS、NMR鉴定为目标产物，具体数据如下：MS:[M+Na]

实施例2 CHS-SE-MAN的合成及结构鉴定

取具塞锥形瓶，称取1g MAN、6.6g CHS-SE，加入脱水丙酮适量溶解，置于恒温震荡器于45℃振摇30min后，加入Novozym 435适量，反应12h。反应结束后，过滤除去Novozym435，续滤液真空旋干得产物粗品。粗品经硅胶柱层析纯化后得白色粉未，收率约92％。产物结构经MS、NMR鉴定为目标产物，具体数据如下：MS:[M+Na]

实施例3不同酶的种类对CHS-SE-GLU配体分子合成产率的影响

取3个10mL带塞小瓶中加入5mL脱水丙酮、5mg GLU、27mg CHS-SE、 200mg

实施例4葡萄糖修饰脑靶向脂质体(GLU-LP)的制备及其工艺优化

(1)葡萄糖修饰脑靶向脂质体(GLU-LP)的制备

按处方量称取HSPC、CHS、CHS-SE-GLU、DSPG-Na膜材及PTX(质量配比40： 20：1：4：1)溶于适量无水氯仿中，真空旋转蒸发除去有机溶剂，制得均匀脂膜，置真空干燥器内干燥过夜。加入一定体积的水溶液，于一定温度下水化，水化一定时间后，探头超声5min(超声时间2s，间隔时间2s，功率为300W)，高压均质(60、180MPa，各3次)，即得GLU-LP。

按上述工艺，处方中不加入PTX，其余同上，制备得空白脂质体。

(2)磷脂种类对GLU-LP的影响

固定其他条件，分别以EPC、HSPC为膜材制备GLU-LP，考察其对包封率的影响。结果输入SPSS 22.0软件分析，发现磷脂种类对包封率、Zeta电位无显著影响，对粒径显著影响(P＜0.05)。结果如下表所示，HSPC制得的脂质体包封率较EPC高，但粒度大于EPC，两者Zeta电位相似。HSPC为氢化磷脂，氧化稳定性要远优于EPC。综合考虑，选择HSPC作为膜材。

表1磷脂种类对GLU-LP的影响(

(3)药脂比对GLU-LP的影响

固定其他条件，考察不同PTX与HSPC比例(质量比)对GLU-LP的影响。结果输入SPSS22.0软件分析，显示质量比对GLU-LP包封率、粒径、Zeta电位均有显著影响(P＜0.05)。结果如下表所示，随着PTX与HSPC比例逐渐增大，包封率呈先增在后降低的趋势，说明脂质体容量饱和前，增加的PTX都包入脂质体中，包封率增大；当达到饱和后，过量的PTX会游离于脂质体外，包封率反而降低。当PTX与HSPC比例为0.1∶1，包封率最高。

表2药脂比对GLU-LP的影响(

(4)磷脂与胆固醇比例对GLU-LP的影响

固定其他条件，考察不同CHS与HSPC比例(质量比)对GLU-LP的影响。结果输入SPSS22.0软件分析，显示磷脂与胆固醇比例对GLU-LP包封率、粒径、 Zeta电位均有显著影响(P＜0.05)。结果见下表，随着CHS与HSPC比值增大时，包封率、粒度及电位先增大后减小，当其比值为0.5∶1时，包封率最高，因此确定HSPC与CHS比值为0.5∶1。

表3磷脂与胆固醇比例对GLU-LP的影响(

(5)DSPG-Na用量对GLU-LP的影响

固定其他条件，考察DSPG-Na投入量占磷脂不同质量百分比对GLU-LP的影响。结果输入SPSS 22.0软件分析，显示DSPG-Na用量对GLU-LP包封率无显著影响，对粒径、Zeta电位均有显著影响(P＜0.05)。结果见下表，DSPG-Na的加入可显著增加脂质体表面电位值，当DSPG-Na用量占磷脂质量为2.5％和5％时，包封率和粒径较好，Zeta电位绝对值都超过30mV，考虑到DSPG-Na昂贵的价格，最终确定用量为2.5％。

表4 DSPG-Na用量对GLU-LP的影响(

(6)水化时间对GLU-LP的影响

固定其他条件，考察不同水化时间对GLU-LP的影响。结果输入SPSS 22.0 软件分析，显示水化时间对GLU-LP包封率、粒径、Zeta电位均有显著影响(P ＜0.05)。结果见下表，1h水化时间包封率最高，0.5h水化时间包封率虽略低于1h，但粒度与Zeta电位优于1h，综合考虑，最终确定水化时间为0.5h。

表5水化时间对GLU-LP的影响(

(7)水化温度对GLU-LP的影响

固定其他条件，考察不同水化温度对GLU-LP的影响。结果输入SPSS 22.0 软件分析，显示水化温度对GLU-LP包封率、粒径、Zeta电位均有显著影响(P ＜0.05)。结果见表6，水化温度为60℃时，制得脂质体包封率最高，但粒径相对于40、50℃水化温度时增大约1倍；40℃时包封率虽略高于50℃，但Zeta 电位绝对值相对于50℃却降低了约10mV，说明50℃制备的脂质体更稳定，综合考虑，确定水化温度为50℃。

表6水化温度对GLU-LP的影响(

(8)GLU-LP的优化验证试验

采用HSPC作为膜材，HSPC与PTX比例为0.1∶1，CHS与HSPC比例为0.5∶ 1，DSPG-Na用量为2.5％，水化时间0.5h，水化温度50℃。采用上述工艺处方制备3批样品，测定包封率、粒径和Zeta电位，结果见下表。3次验证实验的结果基本一致，说明所确定的优化工艺合理可行，稳定可靠，重现性良好。

表7验证实验结果(

实施例5脑靶向紫杉醇脂质体包封率测定

(1)脂质体的制备：

按处方量称取HSPC、CHS、CHS-SE-GLU、DSPG-Na，PTX(比例为40：20：1： 4：1)等材料溶于适量无水氯仿中，真空旋转蒸发除去有机溶剂，制得均匀脂膜，置真空干燥器内干燥过夜。加入一定体积的水溶液真空50℃下水化30min，探头超声5min，高压均质(60 000000Pa，180 000 000Pa各3次)，即得葡萄糖化脑靶向载紫杉醇脂质体(GLU-LP)，于4℃下保存。

(2)测定条件：

色谱柱：XBridge Peptide BEH C

(3)测定方法：

(a)凝胶柱层析

取GLU-LP适量，过0.22μm微孔滤膜，精密量取滤液0.5mL加入到用空白脂质体预饱和的葡聚糖凝胶G-50柱内径1.2cm，柱高10cm)，先以纯水10mL 洗脱，续以40％的乙醇溶液洗脱，2ml/管为单位收集样品；另取适量PTX溶于 10％乙醇溶液作为游离PTX溶液，按相同方法上柱分离。将每管收集的样品真空旋干，乙醇溶解定容，高效液相法分析。以PTX的质量对相应样品的次序作图， 2～5管为脂质体包封的PTX，6～10管为游离PTX，由此可见，游离PTX与GLU-LP 可以通过葡聚糖凝胶G-50柱达到基本分离。

分别收集2～5管和6～10管洗脱液，分别合并后真空旋干，用乙醇定容至5mL，制得样品S

将上述制得样品S

(b)鱼精蛋白沉淀法

取GLU-LP溶液0.1mL于锥形离心管中，用超纯水稀释至1.1mL，混匀， 1000r·min

(c)滤膜法

称取处方量的磷脂、PTX加入超纯水5mL，探头超声，经0.22μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，测定PTX溶解度，记为C

取GLU-LP溶液，经0.22μm的微孔滤膜过滤，精密吸取续滤液0.1mL，乙醇破乳定容至1mL，制得样品S

(d)透析法

精密移取GLU-LP 0.5mL于透析袋内，两端用透析夹夹紧后，置于150mL 的0.5％的聚山梨醇酯透析液中，室温下磁力搅拌，透析12h后，完全转移透析袋内的溶液于5mL的容量瓶，乙醇定容，制得样品S

表8不同包封率测定方法测定结果(n＝4)

实施例6脑靶向脂质体的药理学研究

(1)DiR荧光脂质体制备

按一定比例称取HSPC、CHS、CHS-SE-GLU或CHS-SE-MAN、DiR(质量比40： 20：1：4)混合溶解在氯仿中，旋转蒸发除去氯仿，在茄形瓶中50℃、40rpm 旋蒸形成薄膜，加入超纯水，55℃水化1h，探头超声10min，超声处理后，高压均质机均质3次，然后依次用0.20、0.1、0.05μm微孔滤膜挤压滤过，即得 FL-MAN-LP(CHS-SE-MAN修饰)，FL-GLU-LP(CHS-SE-GLU修饰)，FL-GLU-MAN-LP (CHS-SE-GLU与CHS-SE-MAN共同修饰，(HSPC、CHS、CHS-SE-GLU、CHS-SE-MAN、DiR质量比40：20：0.5：0.5：4))，所得样品低温保存备用。

上述脂质体配方中不加CHS-SE-GLU、CHS-SE-MAN，即得普通荧光脂质体FL-LP。

(2)脑胶质瘤细胞对DiR荧光脂质体的摄取实验

(a)体外C6脑胶质瘤细胞模型的建立

C6细胞置于含有10％胎牛血清和1％(青霉素-链霉素)的DMEM培养基中培养，培养条件为5％CO2，饱和湿度90％，温度为37℃。待细胞汇合度为80％～ 90％时，用2.5mg·L

(b)C6脑胶质瘤细胞对FL-GLU-MAN-LP的摄取实验

C6细胞接种于6孔板内，待细胞融合度达80％左右且细胞形态饱满后,分别加入适量DiR荧光脂质体,用培养基调整脂质浓度为0.3μmol·mL

(3)活体成像试验

取体重约为20g，雄性KM鼠20只，分别尾静脉注射0.2mL的含DiR的普通脂质体、CHS-SE-GLU修饰脂质体、CHS-SE-MAN修饰脂质体、CHS-SE-GLU与 CHS-SE-MAN共修饰脂质体，采用异氟烷麻醉，后置于活体成像仪下观察脂质体的体内分布(channel:NIR，曝光时间1s)。KM小鼠的近红外成像结果显示 CHS-SE-GLU与CHS-SE-MAN分别修饰脂质体在脑组织的荧光强度显著强于普通脂质体组，而两种配体共同修饰的脂质体在脑组织的荧光强度最高，说明两种配体有显著的相互协同作用，结果见附图6。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。