一种壳聚糖-没食子酸接枝共聚物及其制法与应用

摘要

本发明属于材料科学技术领域，具体涉及一种壳聚糖‑没食子酸接枝共聚物及其制法与应用。所述制备方法至少包括以下步骤：(1)对包含没食子酸和壳聚糖的混合溶液进行低温液相放电等离子体处理，所述低温液相放电等离子体处理的放电电压为8.5～9.5kV；(2)对低温液相放电等离子体处理后的混合溶液进行后聚合反应。该方法反应过程中避免使用化学交联剂和有机溶剂，同时酚酸的接枝率较高，绿色环保、设备简单、操作方便。采用该方法制备得到壳聚糖‑没食子酸接枝共聚物具有优异的抗菌以及加速伤口愈合的能力，可作为快速止血密封剂广泛应用。

说明书

技术领域

本发明属于材料科学技术领域，具体涉及一种壳聚糖-没食子酸接枝共聚物及其制法与应用。

背景技术

多糖是由糖苷键结合的糖链，分为均一性多糖和不均一性多糖。自然界中最丰富的均一性多糖是淀粉、糖原和纤维素，常见的不均一多糖有透明质酸、硫酸软骨素等。由于多糖具有可生物降解、生物相容性、能提高机体免疫活性等许多优良的特性，目前受到了各个领域的广泛关注，将多糖和其他生物活性物质进行复合以赋予其更多的利用价值。

酚酸类化合物是一类广泛存在于植物中的次级代谢产物，具有强抗氧化性和自由基清除活性、强生物粘附性。但由于多酚化学性质活泼，在水溶液或生理溶液中不稳定，极大限制了其使用价值。

将多糖和酚酸类化合物结合制备多酚/多糖复合材料，能够使二者的优良特性得到互补，有望成为应用于食品和生物医药领域的新型复合材料。

现有技术中主要采用化学耦合法和酶催化法制备酚酸类化合物接枝的多糖，但需要使用化学交联剂和有机溶剂，造成操作复杂、污染环境，同时接枝率也不理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种环境友好、操作简便的壳聚糖-没食子酸接枝共聚物及其制法与应用。

具体来说，本发明提供了如下技术方案：

一种壳聚糖-没食子酸接枝共聚物的制备方法，至少包括以下步骤：

(1)对包含没食子酸和壳聚糖的混合溶液进行低温液相放电等离子体处理，所述低温液相放电等离子体处理的放电电压为8.5～9.5kV；

(2)对低温液相放电等离子体处理后的混合溶液进行后聚合反应。

与传统的气相放电等离子体相比，低温液相放电等离子体在放电过程中产生了大量的反应活性较高的中间体(H·，·OH，

优选的，上述的壳聚糖-没食子酸接枝共聚物的制备方法中，步骤(1)中，所述混合溶液中包含乙酸或盐酸，所述混合溶液的pH为2～4。该pH范围的溶液体系能够更好的保证没食子酸的接枝量及产物的质量百分收率。

优选的，上述的壳聚糖-没食子酸接枝共聚物的制备方法中，所述低温液相放电等离子体处理的放电时间为5～30min。

优选的，上述的壳聚糖-没食子酸接枝共聚物的制备方法中，所述没食子酸和壳聚糖的摩尔比为0.8～1.0。

优选的，上述的壳聚糖-没食子酸接枝共聚物的制备方法中，所述低温液相放电等离子体处理在无氧环境中进行。

优选的，上述的壳聚糖-没食子酸接枝共聚物的制备方法中，所述低温液相放电等离子体处理是以铜片为阴极，以钨棒为阳极。

优选的，上述的壳聚糖-没食子酸接枝共聚物的制备方法中，所述后聚合反应的温度为80～90℃，所述后聚合反应的时间为3h以上。

本发明还提供了一种壳聚糖-没食子酸接枝共聚物，其由上述的酚酸类化合物接枝多糖的方法制备得到。

本发明还提供上述壳聚糖-没食子酸接枝共聚物在制备用于促进止血和/或伤口愈合的药物中的应用。

本发明所取得的有益效果：

本发明提供的壳聚糖-没食子酸接枝共聚物的制备方法，反应过程中避免使用化学交联剂和有机溶剂，同时酚酸的接枝率较高，绿色环保、设备简单、操作方便。采用该方法制备得到的壳聚糖-没食子酸接枝共聚物，具有优异的抗菌以及加速伤口愈合的能力，可作为快速止血密封剂广泛应用。

附图说明

图1为本发明实施例1中壳聚糖(CS)表面接枝没食子酸(GA)的设计策略；其中，A为利用液相等离子体的方法合成CS-GA的过程，其中框体部分表示等离子体放电过程中所产生的活性自由基引发接枝，B为CS-GA通过迈克尔加成、席夫碱反应以及氢键相互作用等自氧化交联成水凝胶的过程。

图2为本发明实施例1中CS-GA产物在不同pH值下的紫外可见光谱图。

图3为本发明实施例1中CS-GA产物在不同油浴反应时间下的紫外可见光谱图。

图4为本发明实施例1中CS-GA产物的核磁共振氢谱；其中4-1为CS，4-2为CS-GA-1，4-3为CS-GA-2，4-4为CS-GA-3。

图5为新鲜制备的CS-GA与密闭放置一个月后的CS-GA紫外可见光谱图。

图6为本发明实施例1中CS-GA产物的傅里叶红外光谱图；其中6-1为CS，6-2为CS-GA-1，6-3为CS-GA-2，6-4为CS-GA-3。

图7为DPPH自由基清除能力的测试结果对比。

图8为还原能力的测试结果对比。

图9为循环伏安法的测试结果对比。

图10为CS-GA的力学和生物粘附性能评价；其中，(A)对各种组织和器官的可注射性和生物粘附性，(B)对活动关节的动态粘附性和可剥离性，(C)不同CS-GA水凝胶的剪切粘度比较，(D)和(E)分别为CS-GA在频率和应变扫描模式下的动态粘弹性测量，(F)通过搭接剪切试验比较CS-GA的力-位移曲线，(G)通过搭接剪切试验比较CS-GA的粘附强度，****P<0.0001。

图11为CS-GA的体外抗菌作用；其中，(A)不同材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用图片，(B)对大肠杆菌的抑菌活性的定量分析，(C)对金黄色葡萄球菌的抑菌活性的定量分析；(D)通过抑菌圈法定性表征对大肠杆菌的抑菌作用，(E)通过抑菌圈法定性表征对金黄色葡萄球菌的抑菌作用，*P<0.05，**P<0.01,****P<0.0001。

图12为CS-GA的生物相容性评价；其中，(A)L929细胞的活/死染色的共聚焦显微镜图像，比例尺，100μm；(B)使用CCK-8测定法评估由CS-GA-1，CS-GA-2，CS-GA-3和对照组的提取物处理的L929细胞的细胞毒性和细胞增殖数据，柱状图中从左到右分别是Control、CS-GA-1、CS-GA-2和CS-GA-3；(C)不同样品的溶血试验，插入的图表从左到右分别是水、CS-GA-1、CS-GA-2、CS-GA-3和生理盐水。

图13为体内伤口愈合评估；其中，(A)SD大鼠全层皮肤缺损模型的示意图；(B)第0天，第3天，第5天和第7天不同处理后伤口的照片；(C)用不同材料处理后大鼠的伤口区域，柱状图中从左到右分别是Blank、明胶、CS、CS-GA-1、CS-GA-2和CS-GA-3，以纱布覆盖伤口作为空白对照Blank；(D)H&E染色组织切片中上皮厚度的统计；(E)H&E染色的组织切片；(F)Masson染色的组织切片中胶原沉积的统计。(G)Masson染色的组织切片。

图14为CS-GA的止血效果评估；其中，(A)用CS-GA处理的SD大鼠的肝穿刺出血模型的示意图；(B)在不同实验组中处理出血肝后3分钟内的出血质量，*P<0.05，****P<0.0001，n.s.表示无显著差异。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，其中接枝率采用Folin-Ciocalteu方法测定。

以下实施例中，所用原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得，其中壳聚糖：上海麦克林生化科技有限公司，中粘度，200～400mPa·s。

实施例1

一种壳聚糖(CS)表面接枝没食子酸(GA)的制备方法：

(1)在250mL三口瓶中称取壳聚糖1g，没食子酸1.05g(PAR＝1.0)，用100mL 1％盐酸/水溶液(v/v)搅拌溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为3。通氮气(3L/min)，以铜片作为阴极，将铜片固定于三口瓶底部，以钨棒作为阳极，将钨棒浸润到液面下1cm位置处，接通电源后，在9kV放电电压、0.5A放电电流下进行放电20min(未搅拌)。放电完成后，将反应瓶转移到恒温油浴锅中85℃下继续聚合反应3h。

(2)超纯水透析(截留分子量14000Da)48h除去未接枝到壳聚糖上的没食子酸，冷冻干燥得到没食子酸/壳聚糖接枝共聚物。没食子酸的接枝率为172.6±11.1mg GA/g CS-g-GA。

分别对反应溶液的pH值、油浴反应时间、油浴反应温度、放电过程中是否搅拌、放电时间以及反应原料的投料比等实验条件进行了探究。结果如下表1：

表1不同反应条件对GA接枝率的影响

首先，我们研究了反应溶液的pH值对没食子酸接枝率的影响。从表1和图2可以看出，在9kV下持续放电5min，且在25℃下聚合反应24h后，CS上GA的接枝量随着pH的增大而逐渐升高，对应的质量百分收率逐渐降低。这可能是因为在pH相对较高的溶液中，壳聚糖的溶解度降低析出，反应瓶中出现少量沉淀，导致产物的质量百分收率降低，而接枝量提高的原因可能在于GA分子中部分酚羟基被氧化为醌后，与壳聚糖上的氨基发生了席夫碱反应。因此，为了同时保证GA的接枝量及产物的质量百分收率，优选反应溶液的pH为2.0～4.0。

从表1和图3可以看出,在9kV下持续放电5min，且在80℃下分别聚合反应1h、2h、3h后，GA的接枝量分别为27.7±4.7、48.8±7.9、60.6±11.5mg GA/g CS-GA。随着油浴聚合反应时间的延长，GA的接枝量显著增大。在9kV下持续放电5min，分别在25℃、45℃、65℃、85℃下反应3h后，GA的接枝量分别为5.4±0.6、10.9±0.4、22.3±2.2、52.8±2.7mg GA/g CS-GA，产物的质量百分收率均为40％左右。说明通过适当提高油浴聚合反应的温度，可以提高GA的接枝量。在放电过程中是否搅拌，对GA接枝量的影响并不大。

试验例1 CS-GA的表征

根据反应投料比的不同，选择表1中No1、3、5三种不同接枝量的CS-GA进行后续研究。CS-GA分别命名为CS-GA-1(CS/GA＝1:0.1)，CS-GA-2(CS/GA＝1:0.4)和CS-GA-3(CS/GA＝1:1.0)。

1、核磁共振氢谱(

核磁共振氢谱图可以直接有力地证明没食子酸在壳聚糖上的成功偶联。从图4可以看出，CS-GA在7.2ppm处的化学位移归因于没食子酸中苯环上的质子，这是壳聚糖所没有的。随着没食子酸的接枝量的增加，紫外谱图在270nm处的吸收越强，氢谱图中7.2ppm与2.0ppm处的质子峰的比值也逐渐增大，这与福林酚法的测试结果也是相符的。

2、紫外-可见光光谱分析(UV-Vis)

为了检测样品的稳定性，将新鲜制备的CS-GA样品和在室温下密封放置一个月CS-GA样品分别溶解在0.25％(w/v)的乙酸-水溶液中，得到0.5mg/mL的样品溶液。

从图5可以看出，CS-GA衍生物在270nm处存在特征吸收峰，而CS在270nm处无吸收，这归因于没食子酸结构中苯环的π-π共振。同一质量浓度下，270nm处的吸收峰强度随没食子酸接枝量的增加而依次增大。CS-GA在密封隔氧的条件下放置一个月后，三种接枝量的CS-GA的紫外光谱吸收与新鲜制备的样品吸收基本吻合，说明CS-GA在隔绝氧气的情况下可以稳定保存，这在实际生产应用中是至关重要的。

3、FT-IR

将完全干燥的CS、CS-GA海绵状样品用傅立叶变换红外光谱仪测定红外光谱，以确定CS-GA衍生物中没食子酸与壳聚糖的结合情况。

从图6可以看出，没食子酸与壳聚糖的合成反应，可能会发生在壳聚糖的C-2位和C-3、C-6位，能够分别形成新的酰胺键(-NHCO-)和酯键(-OCO-)。壳聚糖与壳聚糖没食子酸衍生物的谱图基本相似，但在某些波数处的吸收峰又有明显不同。3352cm

试验例2 CS-GA的抗氧化性和电化学性质

具备抗氧化活性的材料已被证实可通过调节活性氧的过量产生，进而对伤口愈合过程就有明显的促进作用。为了评估不同接枝量的没食子酸-壳聚糖的抗氧化能力，我们进行了DPPH自由基清除实验和还原能力实验。铁氰化钾法是基于抗氧化性物质能够将Fe

除了评价CS-GA作为抗氧化剂的性质外，我们还通过循环伏安法研究了CS-GA本身的氧化还原性。图9为循环伏安法的测试结果，由图9可知，CS-GA-2和CS-GA-3显示出两个特征的氧化还原峰，即邻亚苯基二醌的还原(0.28V)和氧化(-0.67V))多酚。

试验例3 CS-GA的体外性能评价

图10为CS-GA的力学和生物黏附性能评价，首先，CS-GA可以在生理pH值下容易地溶解在水性介质中，确保有利的可注射性和可塑性(图10A)。此外，由于其有利的还原性，CS-GA中的多酚在暴露于空气中时迅速氧化成醌，然后通过席夫碱/迈克尔加成与壳聚糖的胺共价交联，自发形成具有高机械强度的CS-GA水凝胶。CS-GA与心、肝、脾、肺、肾、骨骼、肌肉等生物组织的各种表面表现出良好的粘附性(图10A)。如图10B所示，CS-GA可以紧紧地粘在膝盖和肘部等运动关节的表面，同时可以很容易地去除而没有任何残留物，防止剥离过程中伤口和再生皮肤的二次损伤。此外，CS-GA在强烈的水流冲击下即使在至少3.0分钟内也牢固地粘附在玻璃表面上。

此外，通过旋转流变仪测量CS-GA水凝胶的动态粘弹性。如图10C所示，随着GA的接枝率的增加，CS-GA水凝胶的剪切粘度从208.5mPa·s(CS-GA-1)，474.1mPa·s(CS-GA-2)增加到1448mPa·s(CS-GA-3)，表明随着GA缀合的增加交联度更高。随着频率从0.1Hz增加到10Hz，CS-GA-3水凝胶显示出更高的G′和G”值(图10D)，CS-GA水凝胶在0.1-1000％的应变范围内表现出不变的机械模量，与GA的接枝量呈正相关(图10E)。

为了测量CS-GA的生物粘附强度，通过将各种水凝胶均匀涂覆在两片猪皮(30mm×25mm)之间的重叠区域(30mm×25mm)上来进行搭接剪切试验。随着拉力的增加，粘合剂水凝胶被拉伸，并且在拉力的临界值(即拉伸强度)下破裂。CS-GA-2和CS-GA-3(约10.0N和13.6N)具有比CS-GA-1和CS(约3.2N和1.7N)高得多的拉伸强度(图10F)。这表明气体的引入通过与这些组织中的氨基或巯基缀合(迈克尔加成或席夫碱反应)增强了与生物组织的粘合强度。根据这些力-位移曲线，它们的粘合强度分别计算为9.51±2.37kPa(CS)，19.21±1.76kPa(CS-GA-1)，60.3±2.5kPa(CS-GA-2)和84.65±1.67kPa(CS-GA-3)(图10G)，表明通过引入GA增强了生物粘附能力。

试验例4 CS-GA的抗菌性能

抗菌能力对伤口愈合和出血起重要作用。由于有利的抑菌效果，壳聚糖已被广泛用作抗生素载体材料。使用大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.A.)作为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，通过对菌落计数的方法来研究CS-GA水凝胶的抗菌功效。如图11A所示，与空白相比，CS和GA处理的培养皿中集落形成单位(CFU)的数量减少，表明对细菌增殖的明显抑制。CS-GA水凝胶显示出高度协同的抗菌效果(图11B和图11C)。如图11D和11E所示，三种水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果可以通过抑菌区的宽度来确定。对于大肠杆菌，它们的抑制区分别计算为0.65±0.28mm(CS-GA-1)，2.56±0.52mm(CS-GA-2)和6.83±1.57mm(CS-GA-3)。对于金黄色葡萄球菌，它们的抑制区分别计算为1.11±0.22mm(CS-GA-1)，3.85±1.19mm(CS-GA-2)和6.98±0.51mm(CS-GA-3)。随着没食子酸的增加，无论是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌，抑菌效果均明显改善。这可能归因于没食子酸破坏细菌细胞膜通透性的能力，导致细胞内离子的细胞外渗漏，使其不能维持噬菌体形态并因此抑制噬菌体生长。CS-GA-3显示出比CS-GA-2和CS-GA-1更显着的抑菌效果，表明没食子酸可通过升高细胞内ROS加速细胞氧化损伤，从而导致细胞死亡。

试验例5 CS-GA的生物相容性实验

伤口敷料通常与皮肤或其他结缔组织直接接触，因此保持与成纤维细胞的良好生物相容性非常重要。我们进行CCK8测定以测试CS-GA水凝胶对小鼠成纤维细胞(L929)的细胞毒性。如图12B所示，将水凝胶用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基在培养箱中浸泡24小时或48小时，用提取物处理的所有细胞显示出高活力。同样，活/死染色显示，与提取物孵育24小时后，大多数L929细胞仍然存活，几乎没有死细胞(图12A)。尽管CS-GA3组的存活率略低于其他组，但仍高于90％，这是由于CS-GA-3中没食子酸含量较高所致。这与先前的报道一致，GA以浓度依赖性方式诱导细胞凋亡。因此，CS-GA-2具有最好的生物相容性，适合进一步应用。与血液直接接触的材料需要具有良好的血液相容性，否则所产生的溶血行为将带来不可接受的风险。与阴性对照组相比，CS-GA材料表现出良好的血液相容性，尽管与盐水组相比其溶血行为较弱，但仍然可以接受(图12C)。

试验例6 CS-GA用于止血和伤口愈合

众所周知，CS和各种儿茶酚化合物可以通过其有利的止血，抗炎和成纤维细胞增殖促进伤口愈合。首先，通过全层皮肤缺损模型研究CS-GA水凝胶的伤口愈合功效。SD大鼠皮肤缺损模型，物理屏障纱布和明胶海绵(明胶)为阴性和阳性对照(图13A)。如图13B所示，CS-GA水凝胶处理的大鼠在3d，5d和7d的伤口收缩明显优于空白和明胶处理的大鼠，而CS和空白之间没有差异(图13B)。此外，由于高吸水性，CS-GA水凝胶处理的伤口保持干燥，比空白和明胶组的潮湿伤口表面更有利于伤口愈合。在第7天，空白组和CS组伤口面积分别为0.50±0.05cm

H&E染色和Masson三色染色用于研究伤口愈合过程中的炎症反应和胶原纤维重塑。空白组大鼠伤口闭合始终不完全，大量炎症细胞浸润创面7d(图13E)。与空白和明胶组相比，用CS-GA敷料处理的伤口中新形成的组织的厚度更高，这表明基于壳聚糖的敷料具有促进伤口愈合的作用(图13D)。相反，CS-GA组显示有利的血管形成，由于充足的血液供应促进伤口修复和成纤维细胞募集。特别是在CS-GA-2组中，在第7天形成了大量成熟毛囊(图13E)，表明CS-GA-2在促进伤口愈合形成正常皮肤组织方面具有明显的优势。此外，用三种CS-GA水凝胶处理的大鼠中的肉芽组织比用空白和CS处理的大鼠中的肉芽组织厚得多，表明这些CS-GA水凝胶有利于促进愈合。此外，通过Masson三色染色测量伤口愈合过程中的胶原纤维沉积(图13G)。用CS-GA-2水凝胶处理的大鼠伤口载玻片中的胶原纤维含量在第7天达到最高值，约为肉芽组织面积的46.6％，而空白，明胶，CS，CS-GA-1和CS-GA-3分别为5.4±2.5％，11.7±4.6％，6.2±2.3％，27.9±5.9％和9.0±1.2％(图13F)。这些结果表明CS-GA水凝胶，特别是CS-GA-2可以有效地促进伤口愈合和皮肤再生，表明它们可能用作伤口敷料。

伤口修复需要血液来提供能量和材料，为了便于伤口更快闭合，应迅速停止出血并防止失血过多。为了进一步评估CS-GA的止血效果，我们对肝损伤大鼠进行了出血性实验(图14A)。在体内止血试验中，六种伤口敷料中，Blank纱布组止血时间最长，失血量接近900mg。相反，CS-GA海绵在损伤部位迅速形成血凝块并吸收较少的血液(图14B)。这与广泛使用的止血材料明胶海绵类似。优异的止血性能与水凝胶吸收液体的能力密切相关。另外，粘合剂CS-GA可以在出血部位起作用而没有长期的外部压力，这是明胶海绵不具备的优异性能。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。