促进猪幼崽生长并改善其肠道的益生菌制剂及其制备方法

摘要

本发明公开了促进猪幼崽生长并改善其肠道的益生菌制剂及其制备方法，包括以下原材料：商业复合益生菌产品EBS与自主复合益生菌EC，所述商业复合益生菌产品EBS包括粪肠球菌Enterococcus faecium S1、枯草芽孢Bacillus subtilis 45与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1，所述自主复合益生菌EC包括粪肠球菌Enterococcus faecium YS01与丁酸梭菌Clostridium butyricum YS08。本发明所述的促进猪幼崽生长并改善其肠道的益生菌制剂及其制备方法，在断奶仔猪的日粮中添加含产细菌素屎肠球菌、丁酸梭菌的复合益生菌制剂，测定其对于改善仔猪的生长性能、断奶腹泻、肠道形态、血常规及血清生化指标的影响，并与商业菌株进行比较，可作为抗生素替代物，添加在日粮中改善仔猪生产性能和缓解断奶腹泻和肠道损伤等问题，带来更好的使用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及动物养殖领域，特别涉及促进猪幼崽生长并改善其肠道的益生菌制剂及其制备方法。

背景技术

益生菌制剂尤其是复合制剂作为添加剂用于动物生产安全无害，目前已经有很多已经作为抗生素的替代物应用于商业化养殖，肠道微生物群和细菌代谢物可以改善微生物群组成：预防与治疗肠道菌群失调抑制病原菌入侵和黏附于肠道，保持或增强肠道屏障作用，保持和恢复肠道健康，促进肠道免疫等。很多研究表明，在日粮中补充屎肠球菌可以降低断奶仔猪肠道内容物pH，可以抑制沙门氏菌和大肠杆菌等潜在病原体的数量，丁酸梭菌类的益生菌在肠道内生长具有多种有效的酶促效应，且可以产生丁酸，可用于治疗畜禽的消化不良、腹泻等，并有一定的促生长作用，酵母菌类可改善断奶仔猪的生长性能，并且改变肠道菌群和提高免疫性能等。乳酸菌类可以显著提高仔猪生长性能，调节肠道菌群，并且通过产生短链脂肪酸如乙酸等有益于健康的代谢物，作用于肠道组织，调节免疫等，随着科技的不断发展，人们对于益生菌制剂的制造工艺要求也越来越高。

现有的断奶仔猪的日粮在使用时存在一定的弊端，不能很好的改善仔猪的生长性能，容易出现断奶腹泻、肠道形态、血常规及血清生化指标的影响，不利于人们的使用，给人们的使用过程带来了一定的不利影响，为此，我们提出促进猪幼崽生长并改善其肠道的益生菌制剂及其制备方法。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了促进猪幼崽生长并改善其肠道的益生菌制剂及其制备方法，在断奶仔猪的日粮中添加含产细菌素屎肠球菌、丁酸梭菌的复合益生菌制剂，测定其对于改善仔猪的生长性能、断奶腹泻、肠道形态、血常规及血清生化指标的影响，并与商业菌株进行比较，可作为抗生素替代物，添加在日粮中改善仔猪生产性能和缓解断奶腹泻和肠道损伤等问题，可以有效解决背景技术中的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：促进猪幼崽生长并改善其肠道的益生菌制剂，包括以下原材料：商业复合益生菌产品EBS与自主复合益生菌EC，所述商业复合益生菌产品EBS包括粪肠球菌Enterococcus faecium S1、枯草芽孢Bacillus subtilis 45与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1，所述自主复合益生菌EC包括粪肠球菌Enterococcus faecium YS01与丁酸梭菌Clostridium butyricum YS08。

作为一种优选的技术方案，所述益生菌制剂以乳清粉作为载体混入日粮中，添加量为1g益生菌复合制剂/kg基础日粮。

作为一种优选的技术方案，所述商业复合益生菌产品EBS与自主复合益生菌EC可以作为控制断奶腹泻的有效添加剂，所述益生菌复合物补充断奶仔猪的日粮提高了ADG、ADFI和FCR，ADG为平均每日体重增量，ADFI为每日进食量，FCR为饲料转化率。

促进猪幼崽生长并改善其肠道的益生菌制剂的制备方法，其特征在于：包括以下操作步骤：

S1：挑选一定数量的菌株，所述菌株采用不同的类型，菌株主要存在于发酵肉制品、乳制品等多种食品中，其中，发酵肉制品是产细菌素菌株的重要来源之一；

S2：选择不同的培养基，所述培养基主要包括屎肠球菌Enterococcus faeciumYS01培养基与丁酸梭菌Clostridium butyricum YS08培养基，不同的菌株接种于对应的培养基中；

S3：在适宜条件对菌株进行培养，将菌株培养到约1011CFU/ml，然后用发酵罐扩大培养，在室温下对菌株进行离心操作，收集菌体；

S4：在手机的菌体内部加入冻干保护剂，用冻干机冻干72h获得菌粉，测定其活菌数；

S5：将其存活的菌体以一定的比例与乳清粉混合，得到不同的益生菌复合制剂；

作为一种优选的技术方案，所述一升屎肠球菌EnterococcusfaeciumYS01培养基中包含蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖40g、酵母浸粉5g、柠檬酸氢二铵2g、无水乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、吐温801mL、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g，pH为6.8。

作为一种优选的技术方案，所述一升丁酸梭菌ClostridiumbutyricumYS08培养基包含蛋白胨10g、牛肉粉10g、酵母粉3g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、醋酸钠3g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、琼脂0.5g，pH为6.8。

作为一种优选的技术方案，所述S3步骤中进行离心操作的速度为4000rpm，离心的时间为15min。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了促进猪幼崽生长并改善其肠道的益生菌制剂及其制备方法，具备以下有益效果：该促进猪幼崽生长并改善其肠道的益生菌制剂及其制备方法，在断奶仔猪的日粮中添加含产细菌素屎肠球菌、丁酸梭菌的复合益生菌制剂，测定其对于改善仔猪的生长性能、断奶腹泻、肠道形态、血常规及血清生化指标的影响，并与商业菌株进行比较，可作为抗生素替代物，添加在日粮中改善仔猪生产性能和缓解断奶腹泻和肠道损伤等问题，通过测定在日粮中添加不同的益生菌复合制剂，测定断奶仔猪的生长性能和肠道健康状况，实验结果表明，益生菌复合制剂对于改善断奶仔猪的生长性能有重要作用，日粮中补充EBS和EC益生菌复合制剂组显著提高了断奶后最初三周仔猪的ADG、ADFI，以及第21天仔猪的BW和FCR，此外，d21对照组的腹泻评分最高为3.69±0.87，EBS和EC组断奶仔猪的腹泻评分、粪便含水量和pH值显著降低，对于缓解断奶腹泻均有效，EBS和EC组断奶仔猪血清中的ALT和酶ALP显著降低，EC对于断奶仔猪血清中的GLU含量升高也有正向的影响，EC益生菌复合制剂对于肠道的形态学恢复有显著提高的作用，优于商业复合益生菌，整个益生菌复合制剂结构简单，操作方便，使用的效果相对于传统方式更好。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

促进猪幼崽生长并改善其肠道的益生菌制剂，包括以下原材料：商业复合益生菌产品EBS与自主复合益生菌EC，商业复合益生菌产品EBS包括粪肠球菌Enterococcusfaecium S1、枯草芽孢Bacillus subtilis 45与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1，自主复合益生菌EC包括粪肠球菌Enterococcus faecium YS01与丁酸梭菌Clostridiumbutyricum YS08。

进一步的，益生菌制剂以乳清粉作为载体混入日粮中，添加量为1g益生菌复合制剂/kg基础日粮。

进一步的，商业复合益生菌产品EBS与自主复合益生菌EC可以作为控制断奶腹泻的有效添加剂，益生菌复合物补充断奶仔猪的日粮提高了ADG、ADFI和FCR，ADG为平均每日体重增量，ADFI为每日进食量，FCR为饲料转化率。

促进猪幼崽生长并改善其肠道的益生菌制剂的制备方法，其特征在于：包括以下操作步骤：

S1：挑选一定数量的菌株，菌株采用不同的类型，菌株主要存在于发酵肉制品、乳制品等多种食品中，其中，发酵肉制品是产细菌素菌株的重要来源之一；

S2：选择不同的培养基，培养基主要包括屎肠球菌Enterococcus faecium YS01培养基与丁酸梭菌Clostridium butyricum YS08培养基，不同的菌株接种于对应的培养基中；

S3：在适宜条件对菌株进行培养，将菌株培养到约1011CFU/ml，然后用发酵罐扩大培养，在室温下对菌株进行离心操作，收集菌体；

S4：在手机的菌体内部加入冻干保护剂，用冻干机冻干72h获得菌粉，测定其活菌数；

S5：将其存活的菌体以一定的比例与乳清粉混合，得到不同的益生菌复合制剂；

进一步的，一升屎肠球菌EnterococcusfaeciumYS01培养基中包含蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖40g、酵母浸粉5g、柠檬酸氢二铵2g、无水乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、吐温801mL、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g，pH为6.8。

进一步的，一升丁酸梭菌ClostridiumbutyricumYS08培养基包含蛋白胨10g、牛肉粉10g、酵母粉3g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、醋酸钠3g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、琼脂0.5g，pH为6.8。

进一步的，S3步骤中进行离心操作的速度为4000rpm，离心的时间为15min。

实施例：

选取产期和窝仔数相近、胎次相同、体重较为接近的28日龄三元杂交猪(杜×长×大)48只，随机分为三组，每组4个重复栏，每栏4头(公母各2)，断奶后饲喂相同的日粮，不同添加剂，实验期共计21天，记录疾病及治疗情况；

断奶仔猪分为对照组、益生菌复合制剂的两组；基础日粮是玉米-豆粕基础日粮，对照组添加量1g乳清粉/kg基础日粮，实验组分别是EBS和EC益生菌复合制剂，是将不同的益生菌复合制剂组以乳清粉作为载体混入日粮中，添加量为1g益生菌复合制剂/kg基础日粮；

每日测定断奶仔猪的体重(BW)和日粮剩余量，计算平均每日体重增量(ADG)，并且计算仔猪平均每日进食量(ADFI)和饲料转化率(FCR)；

在实验的第10天和第21天分别收集断奶仔猪的新鲜粪便，用固体专用的pH计测定其pH值，用真空冷冻干燥法测定水分含量，腹泻评分参考Pierce等的研究方法，利用粪便外观进行评分，从而表征仔猪腹泻状况；

在第21天每组随机选6只仔猪，通过前腔静脉采血的方法取5mL于真空抗凝采血管，于4℃冷藏，2小时内用血常规分析仪进行测定：白细胞计数WBC，红细胞计数RBC，血红蛋白浓度HB，红细胞压积HCT，平均红细胞体积MCV，平均红细胞血红蛋白含量MCH，平均红细胞血红蛋白浓度MCHC，血小板计数PLT，红细胞分布宽度RDW-CV，血小板体积分布宽度PDW，平均血小板体积MPV，大血小板比例P-LCR等；

在第21天每组随机选6只仔猪，通过前腔静脉采血的方法取5mL，分装于真空促凝管，静置1小时后，用低温离心机以3,500r/min转速离心10min，取上清，分装后冻存于-20℃冰箱待测；采用用血常规分析仪及DE全自动生化分析仪测定血清中的总蛋白TP，白蛋白ALB，球蛋白GLB，总胆固醇TC，甘油三脂TG，低密度脂蛋白-胆固醇LDL-C，高密度脂蛋白-胆固醇HDL-C，血糖GLU，尿素氮UREA等；谷丙转氨酶ALT，谷草转氨酶AST，碱性磷酸酶ALP和乳酸脱氢酶LDH等用试剂盒进行测定；

在第21天每组随机选3只仔猪，通过安乐死的方法处死仔猪；然后取样：取出仔猪的十二指肠、空肠、回肠和结肠，在其中部取约2cm的组织，用PBS缓冲液轻轻冲掉肠段内容物后，浸泡在组织固定液中，送至谷歌生物公司进行石蜡包埋及HE染色；

肠道切片的制作方法如下：

(1)组织固定液固定：将新鲜切取的肠道组织浸泡于组织固定液(谷歌生物公司)固定；

(2)清洗脱水：先用PBS清洗15min×2次，用50％乙醇浸泡30min，用70％乙醇浸泡30min，用95％乙醇浸泡40min，再用无水乙醇浸泡15min×3次，用二甲苯浸泡10min×2次；

(3)浸蜡：保持54-56℃，30min×2次；

(4)石蜡包埋：硬蜡+蜂蜡于82℃包埋，室温保存；

(5)组织切片：将蜡块固定于切片机上，调整好组织块和切片厚度(5μm)切片；

(6)切片处理：将切好的片子置于恒温箱中在65℃下，烤片1h使石蜡融化；

(7)HE染色：脱蜡入水：二甲苯浸泡15min×2次，无水乙醇浸泡5min×1次，95％乙醇浸泡5min×1次，80％乙醇浸泡5min×1次，70％乙醇浸泡5min×1次，水洗5min后水封；然后苏木素染色5min，冲洗之后自来水浸泡10min返蓝；之后在95％乙醇中浸泡1min×2次；用伊红染液复染2min，蒸馏水洗2min；然后用85％乙醇浸泡1min，95％乙醇处理1min×2次，无水乙醇处理1min×2次，最后用二甲苯处理1min×2次进行脱水透明；

(8)利用中性树胶进行封片，自然晾干；

(9)用计算机辅助显微镜(Micrometrics TM；Nikon ECLIPSE E00，日本东京)以各种放大倍数获取图像；使用Image Pro Plus6.0(Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA)在100×放大倍数的图像中随机选择30个视野中测量绒毛高度和隐窝深度；

本研究中，与对照组断奶仔猪相比，用益生菌复合物补充断奶仔猪的日粮提高了ADG，ADFI和FCR；这些改善可能是由于EBS喂养和EC喂养仔猪的营养物质消化率较高所致；益生菌复合制剂对断奶仔猪生长性能的影响如表2-4所示，第10天断奶仔猪体重(BW)三组之间没有显著性差异，但是与对照组相比，基础日粮中添加EBS或EC的仔猪平均每日体重增量(ADG)和每日进食量(ADFI)显著增加(P<0.05)；第21天，EBS和EC组仔猪的BW，ADG显著增加(P<0.05)，饲料转化率(FCR)显著减少(P<0.05)；基础日粮中添加EBS与添加EC的两种益生菌复合制剂的两组之间BW，ADG，ADFI及FCR均没有明显差异；因此，EBS与EC两种益生菌复合制剂在断奶后21天内都可以改善仔猪的生长性能，同时降低料肉比；这与之前的一些研究结果一致，例如在断奶后21天内添加乳酸菌复合物的仔猪饲料摄入量和生长性能有积极影响。

工作原理：挑选一定数量的菌株，菌株采用不同的类型，菌株主要存在于发酵肉制品、乳制品等多种食品中，其中，发酵肉制品是产细菌素菌株的重要来源之一，选择不同的培养基，培养基主要包括屎肠球菌Enterococcus faecium YS01培养基与丁酸梭菌Clostridium butyricum YS08培养基，不同的菌株接种于对应的培养基中，在适宜条件对菌株进行培养，将菌株培养到约1011CFU/ml，然后用发酵罐扩大培养，在室温下对菌株进行离心操作，收集菌体，在手机的菌体内部加入冻干保护剂，用冻干机冻干72h获得菌粉，测定其活菌数，将其存活的菌体以一定的比例与乳清粉混合，得到不同的益生菌复合制剂，一升屎肠球菌EnterococcusfaeciumYS01培养基中包含蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖40g、酵母浸粉5g、柠檬酸氢二铵2g、无水乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、吐温801mL、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g，pH为6.8，一升丁酸梭菌ClostridiumbutyricumYS08培养基包含蛋白胨10g、牛肉粉10g、酵母粉3g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、醋酸钠3g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、琼脂0.5g，pH为6.8，产细菌素屎肠球菌YS01和产丁酸丁酸梭菌YS08益生菌复合制剂可作为抗生素替代物，添加在日粮中改善仔猪生产性能和缓解断奶腹泻和肠道损伤等问题。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二(一号、二号)等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。