一个兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗

摘要

本发明公开了一种兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗，所述双价弱毒疫苗含有CMVFny分离物的突变型RNA2；所述CMVFny分离物的突变型RNA2是在CMVFny分离物的RNA2全长序列第2661位之后插入TAATAG以及一段马铃薯Y病毒的保守序列；所插入的马铃薯Y病毒的保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CMVFny分离物的突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将本发明的双价弱毒疫苗与含有CMVFny分离物RNA1和RNA3的质粒混合接种，可以预防黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的危害，为田间防治CMV和PVY引起的植物病毒病提供了疫苗材料和有效防治措施。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一个兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗及其在防治黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒中的应用。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物之一，目前，限制烟草产业发展的主要因素就是烟草病毒病，堪称烟草的“癌症”，严重影响烟草的品质和质量，因此，对烟草病毒病的防治一直是生产上迫切需要解决的问题。复合侵染是烟草病毒病的特点，一般受侵染的烟草都是同时感染多种病毒病，症状复杂，单独防治一种病害往往效果不好。因此，设计能够同时抗多种病毒的策略尤为重要。

黄瓜花叶病毒(Cucumer mosaic virus，CMV)属于雀麦花叶病毒科(Bormoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cuucmovirus)，是目前已知的寄主范围最广的植物病毒之一，可侵染100多科1200多种植物(Mochizuki et al.,2012)。CMV是造成烟草花叶的主要病原，造成植株矮化和畸形严重，叶片出现花叶和坏死，也有黄绿相间的斑驳，严重时叶片变薄，严重影响烟草的质量与产量。马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)中的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，PVY侵染烟草时，主要发生在省长旺期，导致烟草的叶脉坏死，褐脉，黄斑，可导致烟草产量减产20％-50％，严重地块可导致烟草绝收，严重影响烟叶的质量和产量(丛鑫等，2014；孙剑萍等，2011)。

对于植物病毒病的防治，最有效的方法是抗病品种的筛选与培育，但其存在育种周期长、抗病品种抗性易丧失等不足。另一种方法是弱毒交叉保护，是利用弱毒突变体侵染，诱导植物自身的免疫系统而防治后期侵染的同样类型强病毒株系；是一种有效的病毒防治策略。弱毒突变体可以是天然存在的，也可以通过分子生物学手段进行人工制备。

一种弱毒突变体，只能用来防治对应的强病毒。如果想同时防治不同的病毒，就需要几种不同类型的弱毒突变体。但可以通过在一个骨架病毒中插入异源病毒片段，来达到既防治骨架病毒，又防治插入片段对应的病毒得效果，这种突变型病毒就是多价弱毒疫苗。以黄瓜花叶病毒为基础病毒载体，能够兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗目前还未见有报道。

发明内容

针对上述研究背景，本发明的目的是提供一种兼抗CMV和PVY的双价弱毒疫苗，为田间防治CMV和PVY引起的植物病毒病提供了疫苗材料和有效防治措施。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗，所述双价弱毒疫苗含有CMV

本发明的第二方面，提供上述兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：

(1)以CMV

(2)利用酶切和连接方法将SEQ ID NO.1所示的马铃薯Y病毒的保守序列插入到中间载体pCC

本发明的第三方面，提供上述兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗在防治黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒中的应用。

本发明的第四方面，提供一种防治黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的方法，包括以下步骤：

兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗与含有CMV

本发明的有益效果：

(1)对于获得的黄瓜花叶病毒RNA2的2b蛋白提前终止型突变体pCC

(2)本发明提供的突变型质粒中插入的PVY基因片段，是长度为200bp的PVY基因组保守序列，对多种PVY分离物均具有防治的潜力。

附图说明

图1：基础载体pCB301-CMV

图2：质粒pCC

图3：pCC

图4：pCC

图5：pCC

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，能够兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗目前还未见有报道。与单价弱毒疫苗相比，在构建双价弱毒疫苗时需要插入异源病毒的片段，既要保证插入一定长度的片段以有效引发对异源病毒的基因沉默效果，同时还要保证弱毒突变体中插入片段的稳定性，因此，双价弱毒疫苗的构建难度更大。

本发明的兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗是以CMV

对于本发明的兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗构建而言，其难度主要在于对基础载体的改造以及插入序列的选择。其中：对于基础载体的改造，发明人在前期研究(CN108486148A)中以CMV

基于此，本发明对黄瓜花叶病毒2b蛋白编码基因的改造策略进行了改进，本发明的中间载体是2661位之后先插入TAATAG，然后依次引入BamH I、SpeI和Sma I酶切位点，采用本发明的这种设计，可保证所插入序列只在核苷酸水平起作用，所制备的疫苗效果的可控性更强。所引入的克隆位点BamH I、Spe I和Sma I，主要是为不同类型片段插入到载体中准备的。可以使用任意的两个酶切位点的组合导入外源插入片段，所以有必要设计3个酶切位点，方便不同外源序列的插入。

对于插入序列的选择，马铃薯Y病毒的基因组序列本身是比较长的，由于病毒对自身尺寸存在包装限制，在构建多价弱毒疫苗时，对插入的外源病毒片段具有长度限制。因此，不可能将马铃薯Y病毒的全长序列导入，这就需要从马铃薯Y病毒基因组中筛选合适的序列作为外源基因片段导入，所导入的外源基因片段需要保证有效性和稳定性。因此，选择何种序列作为马铃薯Y病毒的插入序列十分关键。经反复优化筛选，本发明最终选取了长度为200bp的PVY基因序列作为插入序列，如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

AGCTGTACATGGGCACCGGAAGGAATGACACGTTCACATACGCTGGATGCCAAGGGCTAACCAAGCCGAAAGTACAAATTGTGTTGGACCACAACACCCAAGTGTGTAGTGCGAATGTGATGTACACGGCACTCTCTAGAGCTACCGACAGGATTCACTTCGTGAACACAAGTGCAAACTCTTCGGCCTTCTGGGAAAAG。

采用SEQ ID NO.1所示序列作为插入序列，其一方面能够有效保持马铃薯Y病毒的侵染性能；另一方面，接种后能够在植物体内稳定存在。

在本发明的一个优选实施方案中，给出了黄瓜花叶病毒(CMV

(1)PVY部分片段的克隆：根据GenBank中公布的5种不同株系PVY全序列(登录号：X97895，AB714135，JQ969040，EF026076，JF928460)，利用DNAMAN软件进行序列比对，发现其序列保守的区域并设计引物PVY-BamHI-2810-F和PVY-SmaI-3009-R(详细信息见表1)。提取受PVY侵染烟草的植物总RNA，利用RT-PCR扩增对应于PVY基因组2810-3009位的200bp片段。

表1：本发明中用到的引物

注：保护碱基用粗体表示，酶切位点用下划线表示，非病毒序列用斜体表示。

(2)pCC

所述质粒载体pCC

小写字母为CMV

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1.pCC

(1)PVY部分片段的克隆：利用TransZol Up(TransGen)提取受PVY(X97895)侵染的本氏烟植物总RNA，在Reverse Transcriptase M-MLV(Takara)作用下，进行反转录反应，反向引物为PVY-SmaI-3009-R，反应条件：在不加酶的条件下，80℃变性3min；加入反转录酶后，42℃反应1.5h。再以反转录产物cDNA为模版，在2×Taq Master Mix(Vazyme)作用下，进行PCR反应，引物对为PVY-BamHI-2810-F和PVY-SmaI-3009-R；PCR条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸12s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存；PCR产物为PVY中200bp保守序列片段。对PCR产物经DNA回收试剂盒回收后备用。

(2)中间载体pCC

利用DpnI(NEB)降解PCR反应中的质粒模板pCB301-CMV

然后利用BamH I(Takara)酶切回收产物，酶切产物经DNA回收试剂盒回收后，在T

(3)pCC

结果分析：连接产物转化后，产物经菌落PCR初筛后，提质粒进行酶切鉴定，基本确认该质粒中含有PVY 200bp的基因序列后通过质粒的DNA测序进行最终鉴定(图2)。

实施例2.质粒载体pCC

农杆菌浸润侵染林烟草：首先将野生型CMV

诱导：分别取含CMV

重悬：将经诱导的菌液于10ml离心管，在室温条件下，6000rpm离心10min；收集菌体并重新悬浮于1ml农杆菌菌体重悬溶液(10mM MgCl

将三种调节好OD

接种：取1ml一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，选取3-4叶期的林烟草，利用压力将注射器中的菌液从叶片背面的叶脉之间注入，每株共注射两个叶片，每片叶片注射量至少覆盖叶片的1/3。

接种完的植株放置25℃培养，16h光照/8h黑暗交替。

结果分析：接种9d后，接种野生型CMV

为检测突变体接种烟草后的遗传稳定性，在接种后9天在未接种系统叶片上取样，利用RT-PCR检测异源病毒插入片段是否稳定存在。为检测异源病毒插入片段是否稳定存在，在CMV

结果分析：pCC

实施例3.质粒载体pCC

利用实施例2中的方法，接种CMV

结果分析：CMV和PVY强毒直接接种林烟草，植株整体矮小，表现深浅绿相间花叶症状；预接种CMV

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一个兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗

<130> 2021

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 200

<212> DNA

<213> PVY基因序列

<400> 1

agctgtacat gggcaccgga aggaatgaca cgttcacata cgctggatgc caagggctaa 60

ccaagccgaa agtacaaatt gtgttggacc acaacaccca agtgtgtagt gcgaatgtga 120

tgtacacggc actctctaga gctaccgaca ggattcactt cgtgaacaca agtgcaaact 180

cttcggcctt ctgggaaaag 200

<210> 2

<211> 3268

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtttatttac aagagcgtac ggttcaaccc ctgcctcccc tgtaaaactc cctagactta 60

aatcttttct ttctagtatc ttttctatgg ctttccctgc ccccgcattc tcactagcca 120

atcttttgaa cggcagttac ggtgtcgaca ctcccgagga tgtggaacgt ttgcgatctg 180

agcaacgcga agaggctgct gcggcctgtc gtaattacag gcccctaccc gctgtggatg 240

tcagcgagag tgtcacagag gacgcgcatt ccctccgaac tcctgacgga gctcccgctg 300

aagcggtgtc tgatgagttt gtaacttatg gtgctgaaga ttaccttgaa aaatctgatg 360

atgagctcct tgtcgctttt gagacgatgg tcaaacccat gcgtatcgga caactatggt 420

gccctgcgtt taataaatgt tcttttattt ccagcattgc tatggccaga gctttgttgt 480

tggcacctag aacatcccac cgaaccatga agtgttttga agacctggtc gcggctattt 540

acactaaatc tgatttctac tacagtgaag agtgtgaagc cgacgacgct cagatagata 600

tctcgtctcg cgatgtaccc ggttattctt tcgaaccgtg gtcccgaacg tctggatttg 660

aaccgccgcc catttgtgaa gcgtgcgaca tgatcatgta ccagtgcccg tgttttgatt 720

ttaatgcttt aaagaaatcg tgcgctgaga ggaccttcgc tgatgattat gttattgaag 780

gtttagatgg tgttgttgat aatgcgactc tgttgtcgaa tttgggtcca tttttggtac 840

ccgtgaagtg tcaatatgaa aaatgtccaa cgccaaccat cgcgattcct ccggatttaa 900

accgtgctac tgatcgtgtt gatatcaatt tagttcaatc catttgtgac tcgactctgc 960

ccactcatag taattacgac gactcttttc atcaagtgtt cgtcgaaagt gcagactatt 1020

ctatagatct ggatcatgtt agacttcgac agtctgatct tattgcaaaa attccagatt 1080

cagggcatat gataccggtt ctgaacaccg ggagcggtca caagagagta ggtacaacga 1140

aggaggtcct tacagcaatt aagaaacgta atgctgacgt tccagagcta ggtgattccg 1200

ttaatttgtc tagattgagt aaagctgtgg ctgagagatt cttcatttca tacatcaatg 1260

gtaactctct agcatccagt aactttgtca atgtcgttag taacttccac gattacatgg 1320

aaaaatggaa gtcctcaggt ctttcttatg atgatcttcc ggatcttcat gctgagaatt 1380

tgcagtttta tgaccacatg ataaaatccg atgtgaaacc tgtggtgagc gacacactca 1440

atatcgacag accggttcca gctactataa cgtatcataa gaagagtata acctcccagt 1500

tctcaccgtt attcacagcg ctattcgagc gcttccagag atgccttcga gaacgtatta 1560

ttcttcctgt tggtaagatt tcatcccttg agatggcagg atttgatgtc aagaacaagc 1620

actgcctcga gattgacctg tctaagtttg ataagtctca aggtgaattt cacttgctaa 1680

tccaggaaca cattttgaat ggtctaggat gtccagctcc gataactaag tggtggtgtg 1740

atttccatcg attctcttac attagagacc gtagagctgg tgttggtatg cctattagtt 1800

tccagagacg aactggcgat gcactcactt attttggcaa taccatcgtc accatggctg 1860

agtttgcctg gtgttatgac accgaccaat tcgaaaagct tttattctca ggcgatgatt 1920

ctctaggatt ttcactgctt ccccctgttg gtgacccgag taaattcaca actcttttca 1980

acatggaagc taaggtgatg gaacctgccg taccatatat ttgttcgaag ttcttactct 2040

ctgacgagtt cggtaacaca ttttccgttc cagatccatt gcgcgaggtt cagcggttag 2100

gaacaaagaa aattccctat tctgacaatg atgaattctt gtttgctcac ttcatgagct 2160

ttgttgatcg attgaagttt ttggaccgaa tgtctcagtc gtgtatcgat caactttcga 2220

ttttcttcga attgaaatac aagaagtctg gggaagaggc tgctttaatg ttaggcgcct 2280

ttaagaagta taccgctaat ttccagtcct acaaagaact ctattattca gatcgtcgtc 2340

agtgcgaatt gatcaattcg ttttgtagta cagagttcag ggttgagcgt gtaaattcca 2400

acaaacagcg aaagaattat ggaattgaac gtaggtgcaa tgacaaacgt cgaactccaa 2460

ctggctcgta tggtggaggc gaagaagcag agacgaaggt ctcacaaaca gaatcgacgg 2520

gaacgaggtc acaaaagtcc cagcgagaga gcgcgttcaa atctcagact attccgcttc 2580

ctaccgttct atcaagtgga tggttcggaa ctgacagggt catgccgcca tgtgaacgtg 2640

gcggagttac ccgagtctga taatagggat ccagctgtac atgggcaccg gaaggaatga 2700

cacgttcaca tacgctggat gccaagggct aaccaagccg aaagtacaaa ttgtgttgga 2760

ccacaacacc caagtgtgta gtgcgaatgt gatgtacacg gcactctcta gagctaccga 2820

caggattcac ttcgtgaaca caagtgcaaa ctcttcggcc ttctgggaaa agcccggggg 2880

cctctcgttt agagttatcg gcggaagacc atgattttga cgatacagat tggttcgccg 2940

gtaacgaatg ggcggaaggt gctttctgaa acctcccctt ccgcatctcc ctccggtttt 3000

ctgtggcggg agctgagttg gcagtattgc tataaactgt ctgaagtcac taaacacatt 3060

gtggtgaacg ggttgtccat ccagcttacg gctaaaatgg tcagtcgtag aggaatctac 3120

gccagcagac ttacaagtct ctgaggcacc tttgaaacca tctcctaggt ttcttcggaa 3180

ggacttcggt ccgtgtactt ctagcacaac gtgctagttt cagggtacgg gtgcccccca 3240

cttttgtggg gcctccaaaa ggagacca 3268

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggatccag ctgtacatgg gcaccg 26

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atcccgggac ttttcccaga aggccgaaga 30

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcggatccac tagtcccggg gcctctcgtt tagagttatc ggcg 44

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggatccct attactcaga ctcgggtaac tccgcc 36

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agaatcgacg ggaacgaggt 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggggaggttt cagaaagcac c 21