一种快速检测新冠病毒IgM抗体的方法和试剂盒

摘要

本发明提供了一种快速检测新冠病毒IgM抗体的方法和试剂盒。本发明的快速检测新冠病毒IgM抗体的方法，包括：S1：将重组新冠病毒S1‑RBD蛋白包被于固相载体上；S2：向包被有重组新冠病毒S1‑RBD蛋白的固相载体中加入待检样本，孵育、洗涤；S3：向洗涤后的固相载体中加入酶标二抗，孵育、洗涤，随后显色。本发明的方法和试剂盒解决了现有检测方法操作时间长、出结果慢等技术问题，大大缩短了检测时间，同时保证了对新冠病毒抗体检测的准确性和稳定性。

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，尤其是涉及一种快速检测新冠病毒IgM抗体的方法和试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，简称“新冠肺炎”，世界卫生组织命名为“2019冠状病毒病”，是2019新型冠状病毒感染导致的肺炎。根据现有病例资料，新冠肺炎以发热、干咳、乏力等为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状；重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。

酶联免疫吸附试验(ELISA)又称酶联免疫法，是将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。常规的ELISA技术通常先将一抗血清加入包被有抗原的酶联板，置于37℃下孵育2小时；随后采用PBS洗涤酶联板后加入酶标二抗，置于37℃下孵育1小时；再先后加入A液和B液进行显色，加入终止液后在酶标仪上读数，操作总耗时约3小时。

目前，在新冠肺炎诊断方面尚无检测新冠病毒抗体的酶联免疫试剂盒面市。同时，常规ELISA实验方法存在检测操作时间过长、检测结果得出较慢等问题和缺陷，从而不利于疫情期间对新冠病毒抗体的大规模应急血清学检测。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测新冠病毒IgM抗体的方法和试剂盒，其解决了现有检测方法操作时间长、出结果慢等技术问题，大大缩短了检测时间，同时保证了对新冠病毒抗体检测的准确性和稳定性。

本发明提供的一种快速检测新冠病毒IgM抗体的方法，包括：

S1：将重组新冠病毒S1-RBD蛋白包被于固相载体上；

S2：向包被有重组新冠病毒S1-RBD蛋白的固相载体中加入待检样本，孵育、洗涤；

S3：向洗涤后的固相载体中加入酶标二抗，孵育、洗涤，随后显色。

本发明的方法采用重组新冠病毒S1-RBD蛋白包被固相载体，有利于快速地得出检测结果。

本发明对重组新冠病毒S1-RBD蛋白的制备方法没有特殊要求，即利用基因工程技术获取真核表达系统表达的重组新型冠状病毒S1-RBD蛋白；具体地，重组新型冠状病毒S1-RBD蛋白的制备方法：采用PCR扩增的方法克隆新冠病毒S1-RBD蛋白的基因,通过核酸内切酶酶切和DNA连接酶连接的方法获得可在哺乳动物细胞(HEK293)中表达重组蛋白的真核表达载体，将此真核表达载体转染至HEK293细胞，该真核表达系统HEK293细胞即可分泌表达重组新冠病毒S1-RBD蛋白。

本发明对所采用的固相载体不作严格限制，例如可以采用酶联板等常规固相载体。

在本发明中，所述重组新冠病毒S1-RBD蛋白的包被浓度为3-5μg/mL，优选为4μg/mL。通过优化重组新冠病毒S1-RBD蛋白的包被浓度，进一步保证了对新冠病毒抗体检测的准确性和稳定性。

本发明对待检样本不作严格限制，待检样本例如可以为稀释血浆、稀释血清等。特别是，稀释血浆或稀释血清的稀释倍数可以为50-150倍，优选为100倍。该稀释倍数有利于缩短ELISA时长，从而达到省时、提高工作效率等目的。

此外，在制备稀释血浆或稀释血清时，可以将样本稀释液由4℃平衡至室温后进行使用，以便ELISA反应能够快速、稳定地进行。

在本发明中，所述酶标二抗为HRP-鼠抗人IgM单克隆抗体；特别是，所述HRP-鼠抗人IgM单克隆抗体的浓度为600-1000ng/mL。通过选择该特定的酶标二抗，能够进一步缩短整个检测时间，大大提高检测效率。

进一步地，在步骤S1中，所述重组新冠病毒S1-RBD蛋白的加入量可以为80-120μL/孔，优选为100μL/孔；步骤S2中，所述待检样本的加入量可以为80-120μL/孔，优选为100μL/孔；步骤S3中，所述酶标二抗的加入量可以为80-120μL/孔，优选为100μL/孔。通过控制上述用量，进一步解决了现有检测操作时间过长、检测结果得出较慢等技术问题，实现了对目标血样新冠病毒IgM抗体的快速检测。

在本发明的步骤S2、步骤S3中，所述孵育的温度分别为35-40℃，优选为37℃；所述孵育的时间分别为10-25min，优选为10-20min，更优选为20min。本发明一抗和二抗的孵育时间大大缩短，有利于缩短整个检测时间，从而实现快速检测，有利于在高通量应急检测中的推广应用。

在本发明中，对显色时间不作严格限制，例如可以控制所述显色的时间为0.5-2min，优选为1min。

在本发明中，在加入待检样本或酶标二抗后，贴好封板膜，轻轻拍打固相载体的边缘2-4下，随后孵育；在孵育结束后揭开封板膜，甩干固相载体中的液体，用洗涤液洗涤4-6次，再用吸水纸拍干固相载体中的水分。上述特定的操作方式能够与本发明的上述检测方法相匹配，从而在最大程度上缩短整个检测时间，由常规ELISA的3个小时缩短至50分钟以内，大大提高了工作效率。

此外，对洗涤时洗涤液的加入量不作严格限制，例如可以为250-350μL/孔，优选为300μL/孔。

在本发明中，IgM抗体的含量与酶标仪所读数值呈正相关，根据OD值的高低即可判定待检样本中的IgM抗体水平是否处于正常范围之内。

本发明还提供一种快速检测新冠病毒IgM抗体的试剂盒，包括包被有重组新冠病毒S1-RBD蛋白的固相载体和酶标二抗。

具体地，所述酶标二抗为HRP-鼠抗人IgM单克隆抗体；所述重组新冠病毒S1-RBD蛋白的包被浓度为3-5μg/mL，更优选为4μg/mL。

本发明的实施，至少具有以下优势：

1、本发明的方法和试剂盒是为了实现对高危人群血样进行新冠病毒IgM抗体的快速检测而研制，其对常规ELISA技术进行了改进，解决了原有检测操作时间过长、检测结果得出较慢等技术问题，实现了对目标血样新冠病毒IgM抗体的快速及高通量应急检测，达到了辅助诊断等目的。

2、本发明选择正确的抗原蛋白包被酶联板，保证了对新冠病毒抗体检测的准确性和稳定性；同时，通过有效调整包被酶联板的抗原浓度和抗体的使用量从而缩短了整个检测时间，由常规ELISA的3个小时缩短至50分钟以内，大大提高了工作效率。

3、本发明的方法和试剂盒克服了现有技术中尚无能够在50分钟之内完成ELISA反应的试剂盒及成熟技术的难题，将ELISA反应由常规ELISA的3个小时缩短至50分钟以内，从而实现了对新冠病毒IgM抗体的快速检测，进而实现了在新冠肺炎疫情防控中对患者血清的快速检测和对疑似人群的高通量筛查，取得了有益的社会效果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、制备重组新冠病毒S1-RBD蛋白

利用常规基因工程技术制备并获得重组新冠病毒S1-RBD蛋白。

2、抗原包被

将上述基因工程表达的重组新冠病毒S1-RBD蛋白的浓度调节至4μg/mL，随后以100μL/孔的加入量加入96孔酶联板中，使重组新冠病毒S1-RBD蛋白包被于酶联板上。

3、试剂及样本准备

将所需试剂自4℃冰箱中取出，平衡至室温，备用。

用样本稀释液对待检血样(血浆或血清)进行1:100稀释，具体方法为：对所有待检样本各取5μL，分别加入预先装有495μL样本稀释液的Ep管中，混匀，编号备用，即获得稀释样本。

4、检测

1)加样孵育：

取上述包被有基因工程表达的重组新冠病毒S1-RBD蛋白的酶联板，将各稀释样本以100μL/孔的加入量快速加入酶联板孔中，随后贴好封板膜，轻轻拍打酶联板边缘3下，置于37℃孵育20分钟。

2)洗涤：

小心揭掉封板膜，将酶联板孔中的液体甩干，用12道微量加样器吸取洗涤液进行洗涤275μL/孔，共洗5遍；最后一遍洗涤完后，在吸水纸上拍干酶联板孔中的水分。

3)加酶标二抗孵育：

向上述洗涤后的酶联板中快速加入相应的酶标抗体(HRP-鼠抗人IgM单克隆抗体)，100μL/孔，贴好封板膜，轻轻拍打酶联板边缘3下，置于37℃孵育20分钟。

4)洗涤：

小心揭掉封板膜，将酶联板孔中液体甩干，用12道微量加样器吸取洗涤液进行洗涤，275μL/孔，共洗5遍；最后一遍洗涤后，在吸水纸上拍干酶联板孔中的水分。

5)显色与读数：

用12道微量加样器，先后快速加入A液和B液进行显色，50μL/孔，显色1分钟左右后，立即快速加入终止液，50μL/孔，然后立即在酶标仪上OD 450nm/630nm处读数。

实施例2

1、抗原包被

将实施例1制备的重组新冠病毒S1-RBD蛋白的浓度调节至8μg/mL，随后以100μL/孔的加入量加入96孔酶联板中，使重组新冠病毒S1-RBD蛋白包被于酶联板上。

2、试剂及样本准备

将所需试剂自4℃冰箱中取出，平衡至室温，备用。

用样本稀释液对待检血样(血浆或血清)进行1：50稀释，具体方法为：对所有待检样本各取10μL，分别加入预先装有490μL样本稀释液的Ep管中，混匀，编号备用，即获得稀释样本。

3、检测

1)加样孵育：

取上述包被有基因工程表达的重组新冠病毒S1-RBD蛋白的酶联板，将各稀释样本以100μL/孔加入量快速加入酶联板孔中，随后贴好封板膜，轻轻拍打酶联板边缘3下，置于37℃孵育15分钟。

2)洗涤：

小心揭掉封板膜，将酶联板孔中的液体甩干，用12道微量加样器吸取洗涤液进行洗涤，275μL/孔，共洗5遍；最后一遍洗涤完后，在吸水纸上拍干酶联板孔中的水分。

3)加酶标二抗孵育：

向上述洗涤后的酶联板中快速加入相应的酶标抗体(HRP-鼠抗人IgM单克隆抗体)，100μL/孔，贴好封板膜，轻轻拍打酶联板边缘3下，置于37℃孵育15分钟。

4)洗涤：

小心揭掉封板膜，将酶联板孔中液体甩干，用12道微量加样器吸取洗涤液进行洗涤，275μL/孔，共洗5遍；最后一遍洗涤后，在吸水纸上拍干酶联板孔中的水分。

5)显色与读数：

用12道微量加样器，先后快速加入A液和B液进行显色，50μL/孔，显色1分钟左右后，立即快速加入终止液，50μL/孔，然后立即在酶标仪上OD 450nm/630nm处读数。

实施例3

1、抗原包被

将实施例1制备的重组新冠病毒S1-RBD蛋白的浓度调节至2μg/mL，随后以100μL/孔的加入量加入96孔酶联板中，使重组新冠病毒S1-RBD蛋白包被于酶联板上。

2、试剂及样本准备

将所需试剂自4℃冰箱中取出，平衡至室温，备用。

用样本稀释液对待检血样(血浆或血清)进行1：50稀释，具体方法为：对所有待检样本各取5μL，分别加入预先装有245μL样本稀释液的Ep管中，混匀，编号备用，即获得稀释样本。

3、检测

1)加样孵育：

取上述包被有基因工程表达的重组新冠病毒蛋白的酶联板，将各稀释样本以100μL/孔加入量快速加入酶联板孔中，随后贴好封板膜，轻轻拍打酶联板边缘3下，置于37℃孵育10分钟。

2)洗涤：

小心揭掉封板膜，将酶联板孔中的液体甩干，用8道微量加样器吸取洗涤液进行洗涤，275μL/孔，共洗5遍；最后一遍洗涤完后，在吸水纸上拍干酶联板孔中的水分。

3)加酶标二抗孵育：

向上述洗涤后的酶联板中快速加入相应的酶标抗体(HRP-鼠抗人IgM单克隆抗体)，120μL/孔，贴好封板膜，轻轻拍打酶联板边缘3下，置于37℃孵育10分钟。

4)洗涤：

小心揭掉封板膜，将酶联板孔中液体甩干，用8道微量加样器吸取洗涤液进行洗涤，275μL/孔，共洗5遍；最后一遍洗涤后，在吸水纸上拍干酶联板孔中的水分。

5)显色与读数：

用8道微量加样器，先后快速加入A液和B液进行显色，50μL/孔，显色1分钟左右后，立即快速加入终止液，50μL/孔，然后立即在酶标仪上OD 450nm/630nm处读数。

实施例4

1、抗原包被

将实施例1制备的重组新冠病毒S1-RBD蛋白的浓度调节至4μg/mL，随后以100μL/孔的加入量加入酶联板中，使重组新冠病毒S1-RBD蛋白包被于酶联板上。

2、试剂及样本准备

将所需试剂自4℃冰箱中取出，平衡至室温，备用。

用样本稀释液对待检血样(血浆或血清)进行1：150稀释，具体方法为：对所有待检样本各取5μL，分别加入预先装有745μL样本稀释液的Ep管中，混匀，编号备用，即获得稀释样本。

3、检测

1)加样孵育：

取上述包被有基因工程表达的重组新冠病毒蛋白的酶联板，将各稀释样本以100μL/孔加入量快速加入酶联板孔中，随后贴好封板膜，轻轻拍打酶联板边缘3下，置于37℃孵育20分钟。

2)洗涤：

小心揭掉封板膜，将酶联板孔中的液体甩干，用12道微量加样器吸取洗涤液进行洗涤，275μL/孔，共洗5遍；最后一遍洗涤完后，在吸水纸上拍干酶联板孔中的水分。

3)加酶标二抗孵育：

向上述洗涤后的酶联板中快速加入相应的酶标抗体(HRP-鼠抗人IgM单克隆抗体)，100μL/孔，贴好封板膜，轻轻拍打酶联板边缘3下，置于37℃孵育20分钟。

4)洗涤：

小心揭掉封板膜，将酶联板孔中液体甩干，用12道微量加样器吸取洗涤液进行洗涤，275μL/孔，共洗5遍；最后一遍洗涤后，在吸水纸上拍干酶联板孔中的水分。

5)显色与读数：

用12道微量加样器，先后快速加入A液和B液进行显色，50μL/孔，显色1分钟左右后，立即快速加入终止液，50μL/孔，然后立即在酶标仪上OD 450nm/630nm处读数。

对照例1

除采用重组新冠病毒N蛋白替代实施例1的重组新冠病毒S1-RBD蛋白进行包被之外，其余与实施例1基本相同。

对照例2

除将实施例1制备的重组新冠病毒S1-RBD蛋白的浓度调节至7μg/mL，同时用样本稀释液对待检血样进行1：10稀释且孵育时间2小时、酶标二抗孵育1小时之外，其余与实施例1基本相同。

对照例3

除将实施例1制备的重组新冠病毒S1-RBD蛋白的浓度调节至1μg/mL，同时用样本稀释液对待检血样进行1：500稀释且孵育时间2小时、酶标二抗孵育1小时之外，其余与实施例1基本相同。

对照例4

除将实施例1制备的重组新冠病毒S1-RBD蛋白的浓度调节至7μg/mL，同时用样本稀释液对待检血样进行1：10稀释之外，其余与实施例1基本相同。

对照例5

除将实施例1制备的重组新冠病毒S1-RBD蛋白的浓度调节至1μg/mL，同时用样本稀释液对待检血样进行1：500稀释之外，其余与实施例1基本相同。

试验例1

采用实施例1-4和对照例1-5的方法，对衡水地区306人份的血样进行了检测，结果见表1。

表1新冠肺炎患者血清抗体检测结果

注：“/”表示无法获取检测结果。

表1结果表明：

1、采用本发明实施例1-4的测试条件均能够较快速完成新冠病毒IgM抗体的检测，准确率在97％以上，其中实施例1的检测准确率和灵敏度最高，检测结果与市传染病医院对上述样本的核酸检测结果及依靠临床症状和其他临床检验手段确诊的结果完全相符，没有漏检和误检，共检测出8例新冠病毒IgM抗体呈阳性的血清样本(其中新冠病毒肺炎患者7例、无症状感染者1例)，其余298例皆为阴性样本(含密切接触者、外域返校学生、复工企业员工、传染科医护人员等高危人群血样)，该方法对新冠病毒IgM抗体检测的准确率和灵敏度均达到100％。

2、采用对照例1的重组新冠病毒N蛋白准确性差，在规定时间内未能检测出样本中的新冠病毒IgM抗体，说明现有包被抗原重组新冠病毒S1-RBD蛋白不可用重组新冠病毒N蛋白替代；采用对照例2方法测试时存在显色极快、本底OD值高等问题，出现大量假阳性，无法获得正确检测结果；对照例3按常规ELISA检测条件需要长达3小时的检测时间，且由于抗原包被量过低和样本稀释倍数过大，导致阳性检出率及灵敏度均极低，有6例阳性样本未检出；对照例4-5均是由于抗原包被量过高或过低，以及样本稀释的倍数过大或过小，导致其在较短的检测时间内无法获取准确客观的检测结果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。