用于扩增抗原特异性CAR-T细胞、组合物的方法及其相关用途

摘要

本发明提供用于制备和表征CAR‑T细胞培养物和制剂的方法。

说明书

相关申请

本申请要求于2018年09月10日提交的美国临时专利申请序列号62/729,089和于2019年09月06日提交的美国临时专利申请序列号62/896,707的优先权权益，其通过引用被整体并入本文。

背景

过继性免疫疗法涉及将疾病特异性和/或工程化T细胞(如抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)和表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞)植入或注入个体，以识别、靶向和破坏疾病相关细胞。过继性免疫疗法已成为治疗许多疾病和紊乱(包含癌症、移植后淋巴增生性紊乱、传染性疾病(例如，病毒感染)和自身免疫性疾病)的一种很有前途的方法。

例如，已经表明暴露于普遍存在的EB病毒(EBV，也被称作人疱疹病毒4(humanherpesvirus 4))可导致易感自身免疫性疾病(包括多发性硬化(MS)、系统性自身免疫性疾病(SAD)和炎症性肠病(IBD))或在自身免疫性疾病(包括多发性硬化(MS)、系统性自身免疫性疾病(SAD)和炎症性肠病(IBD))发病机制中发挥作用。这样的病理(即，MS、SAD和IBD)是由对抗机体自身组织的异常免疫应答引起的。MS的特征在于由身体自身的免疫细胞降解髓鞘(一种围绕神经纤维的保护性脂质壳)。SAD是一组具有多种症状的结缔组织疾病，包括类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)和斯耶格伦综合征(

病毒感染与多种病况(如癌症和自身免疫性疾病)发病机制之间的关联为几个团队开发产生同种异体的抗原特异性T细胞(参见，例如，WO 2017/203368，特此以引用的方式并入本文)和自体的抗原特异性T细胞(参见，例如，Pender et al.,Multiple SclerosisJournal.2014；20(11):1541-1544)提供了动力。

T细胞的免疫监视在检测和杀死多种恶性细胞方面起着关键作用(Gottschalk等人，2005，Leuk Lymphoma.46:1–10；Ochsenbein等人，2002，Cancer Gene Ther.9:1043–10)。恶性细胞的存活和扩散与这些细胞逃避CTL识别的能力有关(Bubenik等人，2003，Oncol.Rep.10:2005–2008；Rees等人，1999，Cancer Immunol.Immunother.48:374–381)。特别是，抗原处理和呈递功能在EBV相关的恶性肿瘤(如霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌)中保持完整(Khanna等人，1998，Cancer Res.58:310–314，Lee等人，1998.Blood 92:1020–1030)。最近的研究已经表明，调节性T细胞介导的对EBV特异性T细胞的抑制可能破坏免疫监视(以及随后的应答)，导致清除恶性细胞的失败。例如，抑制性免疫检查点受体(如PD-1和Tim-3)的上调与T细胞功能障碍相关，并且已在患有慢性丙型肝炎病毒感染患者的丙型肝炎病毒(HCV)特异性和HCV非特异性CD8

嵌合抗原受体(CAR)T细胞是FDA批准的治疗儿童急性淋巴细胞白血病和弥漫性大细胞淋巴瘤的药物。CAR-T细胞在体内的增殖和持久性是影响治疗效果的重要因素。为此，我们在本发明中描述用于产生(generation/production)自体和同种抗原特异性T细胞(例如，特异性致敏以检测例如EBV相关抗原的T细胞)的方法，并且还被设计成表达至少一种针对所选疾病相关抗原的功能性嵌合抗原受体。同时表达一种或多种CAR的抗原特异性CTL的产生为治疗多种疾病提供了一个新的过继性免疫疗法平台。此外，代表中央记忆型T细胞(T

发明概述

本文提供生成同种异体T细胞或自体T细胞的方法，同种异体T细胞或自体T细胞表达与I类主要组织相容性复合体(MHC)上呈递的抗原(例如，病毒抗原，如EBV肽)特异性结合的T细胞受体和与靶标细胞抗原或细胞表面标志物(例如，癌细胞相关抗原，如CD19)特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞通过将包括T细胞(应答细胞，例如，PBMC样品或从中分离的T细胞)的样品与抗原呈递细胞(APC，即刺激细胞)(呈递I类MHC(例如，由受试者中存在的HLA等位基因编码的I类MHC)上的抗原)(例如，病毒肽)，从而诱导抗原特异性应答T细胞的增殖。优选地，用包括编码CAR的核酸序列的病毒运载体转导抗原特异性应答T细胞。本文还提供用于诱导表达CAR的抗原特异性T细胞群体的体外增殖的方法，方法包括用抗原呈递刺激细胞培养分离的T细胞群体，以及用包括编码CAR的核酸序列的病毒运载体转导获得的抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，经转导的T细胞与抗原呈递刺激细胞一起培养以诱导抗原特异性CAR T细胞的增殖。在某些其它实施方案中，分离的T细胞在与APC一起培养之前用编码CAR的病毒运载体转导。在其它实施方案中，分离的T细胞在用编码CAR的病毒运载体转导之前和之后与APC一起培养。

在一些方面，本文提供了用于富集中央记忆型T细胞的体外方法。在某些实施方案中，此类方法包括从包括CD3

在一些实施方案中，通过将预期刺激细胞与天然/野生型病毒或者与编码病毒肽抗原的病毒运载体孵育，使刺激细胞呈递至少一种病毒肽抗原。在一些这样的实施方案中，病毒肽抗原源自如下病毒类型：疱疹病毒(例如，EBV和CMV)、乳头瘤病毒(例如，HPV)、腺病毒、多瘤病毒(例如，BKV、JCV和默克尔细胞病毒)、逆转录病毒(例如，HTLV-I，还包括慢病毒(如，HIV))、小核糖核酸病毒(例如，甲型肝炎病毒)、嗜肝DNA病毒(例如，乙型肝炎病毒)、丙型肝炎病毒(hepacivirus)(例如，丙型肝炎病毒)、三角洲病毒(deltavirus)(例如，丁型肝炎病毒)、戊型肝炎病毒(hepevirus)(例如，戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus))、肿瘤病毒等。在某些优选的实施方案中，通过使PBMC与天然/野生型EBV孵育使刺激细胞呈递EBV肽。在其它优选的实施方案中，通过使PBMC与编码EBV肽的病毒运载体孵育使刺激细胞呈递EBV肽，从而诱导刺激细胞呈递EBV肽。在一些实施方案中，EBV肽包括LMP1肽或LMP1肽的片段、LMP2A肽或LMP2A肽的片段、和/或EBNA1肽或EBNA1肽的片段。在一些实施方案中，EBV肽包括表1中列出的序列。在一些实施方案中，病毒运载体是重组复制缺陷型腺病毒(例如，AdE1-LMPpoly)。在一些实施方案中，刺激细胞可为B细胞、抗原呈递T细胞、树突状细胞或人工抗原呈递细胞(例如，表达CD80、CD83、41BB-L和/或CD86的细胞系，如aK562细胞)。优选地，本文所描述的抗原呈递刺激细胞也向CAR呈递靶标细胞抗原或细胞表面标志物物(如CD19)。在一些实施方案中，辐照刺激细胞。

本文还提供了用于鉴别适用于施用的CAR-T细胞的治疗制剂的方法。在一些实施方案中，获得CAR-T细胞的治疗制剂的样品并评估多种T细胞类型和亚型的丰度。在一些这样的实施方案中，评估CD3

在某些方面，本文提供了用于提高T细胞增殖能力的方法，方法包括执行本文公开的方法。在一些方面，本文提供用于提高表达CAR的T细胞的活力的方法，方法包括执行本文公开的方法。在某些方面，本文提供通过本文公开的任一方法制备的T细胞组合物。

附图的简要说明

图1示出了概述比较源自PBMC或分离的T细胞的EBV-T细胞的CAR转导的程序和实验组的流程图。

图2示出了抗原刺激的T细胞(EBV CTL)中的持续中央记忆型表型。

图3示出了源自PBMC和分离的T细胞并经转导以表达CAR的EBV-T细胞的生长曲线。

图4示出了源自分离的T细胞的活的CAR

图5示出了研究设计，以检查刺激和CAR转导后T细胞的记忆表型。

图6示出了代表性流式细胞术门控策略(gating strategy)，以鉴别CD19-CAR-T细胞上的CD3、CD4、CD8、CD62L和CD45RO。

图7示出了无刺激、BLCL、可溶性抗CD3/CD28和珠结合抗CD3/CD28刺激后CD19-CAR-T细胞上CD62L和CD45RO(门控于CD3

图8示出了CD19-CAR T细胞上CD4和CD8表达(门控于CD3上)的代表性点图。

图9示出了EBV特异性抗CD19 CAR T细胞发挥有效的且特异性的细胞毒性。

图10示出了EBV特异性抗CD19 CAR T细胞诱导CD19特异性细胞毒性。

图11示出了在HLA匹配的(BLCL靶标)和HLA不匹配的(BLCL靶标和Raji靶标)细胞中特异性和有效的HLA非依赖性细胞溶解，而EBV-CTL只能在匹配的BLCL靶标细胞中诱导显著的细胞溶解。

图12示出了传统生成的抗CD19 CAR T细胞相对于EBV特异性抗CD19 CAR T细胞展现出增强的同种异体反应性增殖。

图13示出了与所示细胞系共培养后的CellTrace

图14示出了EBV抗原特异性抗CD19 CAR T细胞和常规生成的抗CD19 CAR T细胞的细胞因子谱展现出不同的响应。

详细说明

本文公开的研究寻求确定适于高产量制造方法和/或用于在最终治疗产品中富集记忆型T细胞免疫表型的各种CAR-T细胞刺激的影响。标准的基于抗CD3/CD28珠的刺激作为一种在用编码CAR的运载体转导之前在体外或体内扩增T细胞的方法被广泛应用于所述领域。然而，本文公开了也表达一种或更多种CAR的抗原刺激的T细胞(例如，病毒特异性T细胞)的制造方法。此类方法可包括初始T细胞富集步骤，其中CD3

本文公开的研究还提供了用CD3/CD28或BLCL共培养物刺激CTL获得的抗CD19CAR-T细胞的中央记忆型T细胞亚群和效应记忆型T细胞亚群的比较。

为了方便起见，此处收集了说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。

本文中使用冠词“一(a)”和“一(an)”指所述冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一要素”意指一个要素或多于一个要素。

如本文所使用的，术语“施用”意指向受试者提供药剂或药物组合物，并且包含(但不限于)由医疗技术人员施用和自我施用。这样的药剂可以含有例如本文所描述的肽、本文提供的抗原呈递细胞和/或本文提供的T细胞。

术语“结合”或“相互作用”指由于例如生理条件下的静电相互作用、疏水相互作用、离子相互作用和/或氢键相互作用而在两个分子之间(例如，TCR与肽/MHC之间)的缔合(其可以是稳定的缔合)。

术语“生物样品”、“组织样品”或简单地“样品”各自指从受试者的组织获得的细胞的集合。组织样品的来源可以是如来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样品、活组织检查、或抽出物的实体组织；血液或任何血液成分、血清、血液；体液，如脑脊液、羊水、腹膜液或间质液；或来自受试者的妊娠或发育的任何时间的细胞。

如本文所使用的，术语“细胞因子”指影响细胞功能，并且是调控免疫应答、炎症应答或造血反应中细胞之间的相互作用的分子的任何分泌的多肽。细胞因子包含(但不限于)单核因子和淋巴因子，无论哪种细胞产生其。例如，单核因子通常被称为由单核细胞(如巨噬细胞和/或单核细胞)产生和分泌。然而，许多其他细胞也产生单核因子，如天然杀伤细胞、成纤维细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、脑星形细胞、骨髓基质细胞、表皮角质形成细胞和B淋巴细胞。淋巴因子通常被称为由淋巴细胞产生。细胞因子的实例包含(但不限于)白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-15(IL-15)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和肿瘤坏死因子β(TNFβ)。

术语“抗体片段”指小于全长的抗体的任何衍生物。在示例性实施方案中，抗体片段保留全长抗体特异性结合能力的至少重要部分。抗体片段的示例包含(但不限于)Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv双体(diabody)、Fc和Fd片段。抗体片段可以通过任何方式产生。例如，抗体片段可以通过酶或化学方法通过完整抗体的裂解产生，可以通过编码部分抗体序列的基因重组产生，或者可以全部或部分合成产生。抗体片段可可选地为单链抗体片段。可替代地，片段可包括例如通过二硫键连接在一起的多个链。片段也可以可选地是多分子复合物。功能性抗体片段通常将包括至少约50个氨基酸且更典型地将包括至少约200个氨基酸。

术语“抗原结合位点”指抗体中特异性结合抗原上的表位的区域。

术语“单链可变片段”或“scFv”指重链域和轻链域相连的Fv片段。一个或更多个scFv片段可连接到其它抗体片段(如重链或轻链的恒定域)以形成具有一个或更多个抗原识别位点的抗体构建体。

术语“Fab片段”指抗体片段，其包括通过用木瓜蛋白酶(其在铰链区N-末端切割到H-链间二硫键并由一个抗体分子生成两个Fab片段)切割抗体而生成的抗原结合位点。

术语“F(ab')2片段”指含有两个抗原结合位点的抗体片段，通过用酶胃蛋白酶(在铰链区C末端切割到H-链间二硫键)切割抗体分子而产生。

术语“Fc片段”指包括重链恒定域的抗体片段。

术语“Fv片段”指包括重链和轻链可变域的抗体片段。

术语“工程化抗体”指至少包括抗体片段的重组分子，所述抗体片段包括源自抗体的重链和/或轻链的可变域的抗原结合位点，并且可以可选地包括来自任意Ig类别(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY)的抗体的可变域和/或恒定域的全部或部分。

如本发明所使用的，当提及多肽(包含抗体)或受体时，术语““特异性结合(specifically binds/specific binding)”或“靶向性”指确定蛋白质或多肽或受体在蛋白质和其它生物制备物的异质群体中的存在的结合反应。因此，在指定的条件下(例如抗体的免疫分析条件)，当指定的配体或抗体没有与样品中存在的其它蛋白质大量结合或与配体或抗体在生物体中可能接触的其它蛋白质大量结合时，指定的配体或抗体与其特定的“靶标”“特异性结合”(例如，抗体与内皮抗原特异性结合)。通常，“特异性结合”第二分子的第一分子与所述第二分子具有大于约10

术语“表位”意为能够与抗体或TCR特异性结合的蛋白决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成。某些表位可以由抗体能够结合的氨基酸的特定序列限定。

如本文所使用的，短语“药学上可接受的”指在合理的医学判断范围内适合于与人类和动物的组织接触，而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些药剂、化合物、材料、组合物和/或剂量。

如本文所使用的，短语“药学上可接受的载体”意为药学上可接受的材料、组合物或运载体(vehicle)(如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、或溶剂包封材料)，其涉及将药剂从器官、或身体的一部分携带或转运至另一器官、或身体的一部分。每种载体在与制剂的其他成分相容并且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包含：(1)糖(如乳糖、葡萄糖和蔗糖)；(2)淀粉(如玉米淀粉和马铃薯淀粉)；(3)纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素)；(4)粉状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂(如可可脂和栓剂蜡)；(9)油类(如花生油、棉籽油、红花子油、麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)；(10)二醇类(如丙二醇)；(11)多元醇(如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇)；(12)酯类(如油酸乙酯和十二烷酸乙酯)；(13)琼脂；(14)缓冲剂(如氢氧化镁和氢氧化铝)；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及(22)药物制剂中采用的其他无毒相容物质。

术语“多核苷酸”和“核酸”可互换地被使用。它们指任何长度的核苷酸的聚合体形式，脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析确定的基因座(loci)(基因座(locus))、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、运载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物的组装之前或之后被赋予。多核苷酸可以被进一步修饰，如通过与标记组件偶联。在本文提供的全部核酸序列中，U核苷酸与T核苷酸是可互换的。

如本文所使用的，“预防”病况的治疗剂指化合物，当在紊乱或病况的发作之前被施用至统计样品时，相对于未经处理的对照样品，所述化合物降低经处理的样品中的紊乱或病况的发生，或相对于未经处理的对照样品，所述化合物延迟紊乱或病况的一种或更多种症状的发作或降低紊乱或病况的一种或更多种症状的严重性。

如本文所使用的，“特异性结合”指TCR与MHC(例如，I类MHC或II类MHC)上呈递的肽结合的能力。通常，TCR以至少约10

如本文所使用的，术语“受试者”意为被选择用于治疗或疗法的人类或非人类动物。

在某些实施方案中，本发明的药剂可单独施用或与其他类型的治疗剂联合施用。如本文所使用，短语“联合施用(conjoint administration/administered conjointly)”指两种或更多种不同治疗剂(例如，包括本文公开的CAR T和免疫检查点的抑制剂的组合物)的任何形式的施用，使得在先前施用的治疗剂仍在体内有效的同时施用第二药剂(例如，两种药剂在受试者中同时有效，其可以包含两种药剂的协同效应)。例如，不同的治疗剂可以以相同的剂型或单独的剂型同时或顺序施用。在一些优选的实施方案中，CAR T细胞表达(例如，细胞表面呈递或分泌)其它治疗剂。在某些实施方案中，不同的治疗剂(例如，CART细胞和免疫检查点阻断分子)可在彼此相隔约1小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时或约一周内施用。因此，接受这样的治疗的受试者可以受益于不同治疗剂的联合作用。

如本文所使用的，术语“治疗”指设计用于在临床病理过程中改变被治疗个体的自然过程的临床干预。理想的治疗效果包括降低进展率、改善或缓和病理状态、缓解或改善特定疾病、紊乱或病况的预后。例如，如果与特定疾病、紊乱或病况相关的一个或更多个症状得到缓解或消除，个体就可以成功地“治疗”。

术语“运载体”指工具(means)，通过所述工具，核酸可以在生物体、细胞或细胞组分之间繁殖和/或转移。运载体包含质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转位子和人工染色体等，其可能或可能不能够自主复制或整合到宿主细胞的染色体中。

到目前为止，本领域中已知的用于制造CAR-T细胞的方法依赖于粗的和异质的起始材料，如PBMC(参见Sun等人的Journal for ImmunoTherapy of Cancer(2015)3:5)或特异性T细胞类型(即CD4

本文公开的初始CD3

制造表达与I类MHC上呈递的肽特异性结合的T细胞受体的T细胞需要针对所定义的抗原进行T细胞扩增。在一些实施方案中，T细胞还表达与疾病相关肽(例如，肿瘤相关肽、抗原、配体等)特异性结合的CAR。

抗原递送(antigen delivery)可经由通过来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)或由此分离的B细胞淋巴母细胞(例如CD19

因此，本文提供生成同种异体或自体T细胞的方法，同种异体或自体T细胞表达与例如I类MHC上呈递的EBV肽特异性结合的T细胞受体，并且进一步表达与所选靶标(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，例如通过野生型/天然EBV或腺病毒运载体(例如AdE1-LMPpoly)通过刺激细胞的病毒感染生成APC。AdE1-LMPpoly运载体编码来自LMP1和LMP2的已定义CTL表位的多表位，并与Gly-Ala重复序列缺失的EBNA1序列融合。AdE1-LMPpoly运载体在例如Smith等人的Cancer Research 72:1116(2012)、Duraiswamy等人的Cancer Research 64:1483-9(2004)和Smith等人的J.Immunol 117:4897-4906(2006),中进行了描述，其中每一者均通过引用的方式并入本文。在一些实施方案中，刺激细胞与未感染、分离的T细胞(应答因子)混合，以便向所述T细胞呈递EBV多肽。在一些实施方案中，用EBV多表位呈递的分离的病毒特异性T细胞被活化并被诱导用于增殖。

T细胞可分为原初或三个主要经历抗原刺激(antigen-experienced)亚型之一：中央记忆型T细胞、效应记忆型T细胞和终末分化效应T细胞。中央记忆型T细胞(T

在一些实施方案中，应答细胞和刺激细胞各自源自外周血单核细胞(PBMC)。在一些这样的实施方案中，应答细胞和刺激细胞各自源自同一供体的PBMC。在其它实施方案中，应答细胞和刺激细胞各自源自不同供体的PBMC。在一些这样的实施方案中，在与刺激细胞接触之前，分离和/或纯化应答细胞以便基本上由T细胞组成。在优选实施方案中，分离和/或纯化应答细胞以便基本上由CD3

在呈递给应答细胞(例如，T细胞)之前，刺激细胞可被诸如EBV之类的天然病毒感染，从而在其表面呈递病毒抗原。在一些实施方案中，用病毒运载体(优选包括编码疱疹病毒抗原的核酸序列的腺病毒运载体)转导刺激细胞。在一些这样的实施方案中，腺病毒运载体是复制缺陷。更优选地，腺病毒运载体包括编码一种或更多种EBV抗原的核酸序列。一种或更多种EBV抗原可包括LMP1肽或其片段、LMP2A肽或其片段和/或EBNA1肽或其片段。最优选地，腺病毒运载体是AdE1-LMPpoly并且编码来自LMP1和LMP2的已定义CTL表位的多表位，多表位融合到Gly-Ala重复缺失的EBNA1序列。在一些实施方案中，刺激细胞在与应答细胞(例如，未感染的PBMC或富集CD3

尽管抗原特异性T细胞在被刺激因子部分呈递抗原时实现活化和增殖，但在最终收获的CAR-T细胞产物中不期望这样的刺激细胞。此外，为了最小化增殖细胞中导致形成活性病毒(competent virus)的任何病毒重组事件的风险，刺激细胞在与应答T细胞培养之前被处理和/或修饰以抑制增殖(例如。通过γ射线照射或暴露于药剂(如丝裂霉素C))。例如，在这种培养条件下，应答细胞(例如，T细胞)由非增殖刺激细胞呈递肽抗原。在一些这样的实施方案中，在用编码CAR的运载体转导之前将培养物保持至少24小时到至少28天。在一些实施方案中，培养物被保持至少24小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少17天，或者至少28天。优选地，在用编码CAR的运载体转导之前，在刺激细胞呈递抗原之后将培养物保持至少2天。最优选地，在用编码CAR的运载体转导之前，在刺激细胞呈递抗原之后将培养物保持至少6天。在其它实施方案中，在用编码CAR的运载体转导之后，将培养物保持至少24小时到至少28天。在某些实施方案中，在用编码CAR的运载体转导之后培养物被保持至少24小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少17天或至少28天。在一些实施方案中，培养物根据需要重新接种和/或重新刺激。例如，应答T细胞经历至少第一刺激步骤(即，在APC上呈递抗原)，并且可以根据需要重新接种和/或重新刺激(即，第二次或更多)。所述经重新接种和/或重新刺激培养物在用编码CAR的运载体转导之前或之后保持至少24小时、至少3天、至少9天、至少11天、至少14天、至少17天或至少28天。在优选的实施方案中，在用编码CAR的运载体转导之前刺激应答细胞培养物至少一次。更优选地，多次刺激应答培养物，其中随后的刺激步骤间隔2到14天。例如，经历第一刺激的培养物可在第一刺激11天后经历第二刺激(例如，再刺激)；可选地，在第二刺激步骤7天后开始第三刺激(例如，再刺激)。在用编码CAR的运载体转导之前，将经历刺激步骤(例如，再刺激)的培养物保持至少1到10天。优选地，在用编码CAR的运载体转导之前将培养物保持至少2天。最优选地，在用编码CAR的运载体转导之前，在刺激细胞呈递抗原之后将培养物保持至少6天。可选地，在刺激之前采用NK去除步骤。例如，CD56

在某些实施方案中，在至少第一次呈递抗原实现活化和增殖之后，抗原特异性T细胞可在用编码CAR的运载体转导之前和/或之后被冷冻和储存，以在未来解冻。例如，本文所设想的抗原特异性、表达CAR的T细胞可向有需要的受试者施用，或冷冻以储存在细胞库或储存库中以在稍后日期解冻。在一些这样的实施方案中，如本文所述，在转导之前和/或之后至少再次用抗原(例如，如本文所述，用抗原呈递刺激细胞，如BLCL等)重新刺激解冻培养物。在一些实施方案中，根据需要重新刺激和/或重新接种所述解冻的培养物，并且在用如本问所述的编码CAR的运载体转导之前或之后，所述重新刺激和/或重新接种培养物保持至少24小时、至少2天、至少3天、至少9天、至少11天、至少14天、至少17天，或至少28天。同样，在培养物多次再刺激的情况下，如本问所述，随后的刺激步骤间隔2到14天。

抗原特异性T细胞的活化和增殖也需要刺激细胞提供足够数量的抗原呈递。因此，本文预期的刺激培养物(例如，包含再刺激培养物)包括已知比率的应答细胞与刺激细胞。例如，应答细胞与刺激细胞的比率为约0.1:1至约20:1。优选地，应答细胞与刺激细胞的比率为约0.2:1至约5:1。在一些实施方案中，应答细胞与刺激细胞的比率为约20:1、约19:1、约18:1、约17:1、约16:1、约15:1、约14:1、约13:1、约12:1、约11:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约0.9:1、约0.8:1、约0.7:1，约0.6:1、约0.5:1、约0.4:1、约0.3:1、约0.2:1或约0.1:1。在一些这样的实施方案中，应答细胞与刺激细胞的比率为约0.25:1、0.43:1或4:1。此外，在培养物被多次再刺激的情况下，每个刺激可包括相同比率或不同比率的应答细胞与刺激细胞。例如，且不限于此，在优选的实施方案中，初始刺激包括约0.43:1的应答因子与刺激因子比率。随后的刺激(例如，再刺激)可包括0.25:1的应答因子:刺激因子比率，并且进一步的刺激(例如，再刺激)可包括4:1的应答因子:刺激因子比率。

本领域的技术人员应了解，培养物中的细胞增殖可变化且受限于对营养物和氧的需求以及诸如二氧化碳和乳酸等废物产物的累积。因此，本领域的技术人员将能够根据经验确定适当的培养和(如有必要)重新接种时间表以获得本发明的T细胞。在一些实施方案中，培养物保持到预定收获日期。在收获前和/或收获当天对培养物进行评估，并确定是否存在活性病毒。最优选地，本文公开的培养物和/或制剂在收获CTL时基本上不含活性病毒。

在某些方面，本文提供生成表达TCR的同种异体或自体CAR-T细胞的方法，TCR与包括I类MHC上呈递的T细胞表位的肽(例如抗原)和与选定靶标(例如疾病相关肽靶标)结合的CAR特异性结合，用于治疗自身免疫性疾病和癌症(例如，MS、SAD、IBD和/或CD19

在一些这样的实施方案中，如本文所述，包括T细胞表位的肽包括来自诸如但不限于疱疹病毒(例如，EBV和CMV)、乳头瘤病毒(例如，HPV)、腺病毒、多瘤病毒(例如，BKV、JCV和默克尔细胞病毒)、逆转录病毒(例如，HTLV-I，还包括慢病毒(如，HIV))、小核糖核酸病毒(例如，甲型肝炎病毒)、嗜肝DNA病毒(例如，乙型肝炎病毒)、丙型肝炎病毒(hepacivirus)(例如，丙型肝炎病毒)、三角洲病毒(例如，丁型肝炎病毒)和戊型肝炎病毒(hepevirus)(例如，戊型肝炎病毒)等的病毒的表位。在一些实施方案中，表位是HLA I类限制性T细胞表位。在其它实施方案中，表位是HLAII类限制性T细胞表位。

本文提供的肽可以包括任何EBV病毒蛋白的序列(例如，任何EBV蛋白的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个邻接的氨基酸的序列)。在一些实施方案中，本文提供的肽包括EBV病毒蛋白的不超过25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个邻接的氨基酸。

本文提供的肽可以包括LMP1的序列(例如，LMP1的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个邻接的氨基酸的序列)。在一些实施方案中，本文提供的肽包括LMP1的不超过25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个连续氨基酸。下文提供示例性LMP1氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

在一些实施方案中，本文提供的肽包括LMP2A的序列(例如，LMP2A的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个邻接的氨基酸的序列)。在一些实施方案中，本文提供的肽包括LMP2A的不超过25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个邻接的氨基酸。下文提供示例性LMP2A氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

在一些实施方案中，本文提供的肽包括EBNA1的序列(例如，EBNA1的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个邻接的氨基酸的序列)。在一些实施方案中，本文提供的肽包括EBNA1的不超过25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个邻接的氨基酸。下文提供示例性EBNA1氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：

优选地，所述肽包括表1中所列表位的序列。

表1：示例性EBV病毒蛋白表位

在某些实施方案中，本文所提供的肽包括任何多瘤病毒蛋白质的序列，例如，包括BKV表位、JCV表位、MCV表位和/或当在HLA上呈递时被CTL识别的包括BKV表位、JCV表位和/或MCV表位之间同源的序列的表位相关。在某些实施方案中，本文所描述的表位在多瘤病毒感染(例如，BKV病毒感染、JCV病毒感染、或MCV病毒感染)和/或癌症(例如，表达本文提供的表位的多瘤病毒相关性癌症)的预防和/或治疗中、和/或对于在多瘤病毒感染(例如，BKV病毒感染、JCV病毒感染、或MCV病毒感染)和/或癌症(例如，表达本文提供的表位的多瘤病毒相关性癌症)的预防和/或治疗中有用的药剂(例如，CTL和/或APC)的生成是有用的。在一些实施方案中，表位是杂合表位，所述杂合表位包括来自BKV表位和同源的JCV表位两者的氨基酸、和/或在不同BKV或JCV表位内发现的氨基酸变体(在此插入适当的名词)。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法还包括MCV表位。包括BKV表位、JCV表位、MCV表位和/或包括BKV表位、JCV表位和/或MCV表位之间同源序列的表位(例如，杂合表位)的示例性肽可在WO2018049165中找到，其特此通过引用整体并入本文中。

在一些实施方案中，本文提供的肽包括任何巨细胞病毒蛋白质的序列，例如，包括由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别并且在预防和/或治疗CMV感染和/或癌症(例如，表达CMV表位的癌症)中有用的表位的肽。包括CMV表位的示例性肽可在WO2017203370、WO2014059489和WO2006056027中的每一个中找到，WO2017203370、WO2014059489和WO2006056027在特此通过引用整体并入本文中

在一些实施方案中，本文提供的肽包括任何人乳头瘤病毒蛋白质的序列，例如，包括由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别并且在预防和/或治疗HPV感染和/或癌症(例如，表达HPV表位的癌症)，和/或癌前病变中有用的HPV表位的肽。包括HPV表位的示例性肽可在PCT/US2019/014727中找到，其特此通过引用整体并入本文中。

在一些实施方案中，肽包括来自两种或更多种病毒的表位。在一些实施方案中，肽包括来自三种或更多种病毒的表位。在一些实施方案中，肽包括来自四种或更多种病毒的表位。在一些实施方案中，肽包括来自五种或更多种病毒的表位。例如，在一些实施方案中，肽包括来自JCV、BKV、MCV、EBV、CMV和/或HPV中至少两个、三个、四个或五个的序列。

在一些实施方案中，本文提供的肽包括两个或更多个T细胞表位(例如，病毒表位)。在一些实施方案中，本文提供的肽包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个T细胞表位。例如，在一些实施方案中，本文提供的肽包括由连接体(例如，多肽连接体)连接的两个或更多个T细胞表位。在一些实施方案中，多肽或蛋白质还包括在多个表位中的至少两个之间的间插氨基酸序列。在一些实施方案中，间插氨基酸或氨基酸序列是蛋白酶体释放氨基酸或氨基酸序列。蛋白酶体释放氨基酸或氨基酸序列的非限制性实例是或者包括AD、K或R。在一些实施方案中，间插氨基酸或氨基酸序列是TAP识别基序。通常，TAP识别基序可以符合下式：(R/N:I/Q:W/Y)

在一些实施方案中，除一个或更多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)保守序列修饰之外，肽的序列包括病毒蛋白序列。如本文所使用的，术语“保守序列修饰”旨在指不显著地影响或改变T细胞受体(TCR)与含有MHC上呈递的氨基酸序列的肽之间的相互作用的氨基酸修饰。这样的保守修饰包含氨基酸置换、添加(例如，向肽的N末端或C末端添加氨基酸)和缺失(例如，从肽的N末端或C末端缺失氨基酸)。保守氨基酸置换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包含具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支化侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本文所描述的肽的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本领域已知的方法测试改变的肽的TCR结合的保留。可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入抗体。

在一些实施方案中，本文提供的肽包括与病毒蛋白质序列(例如，病毒蛋白的片段的序列)至少80％、85％、90％、95％或100％一致的序列。为了测定两个氨基酸序列的百分比一致性，序列被比对以用于最优比较目的(例如，可以在第一氨基酸序列和第二氨基酸序列中的一个或两个中引入空位以用于最优比对，并且可以忽略非一致序列以用于比较目的)。然后比较相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基占据时，则分子在该位置处是一致的。考虑到空位的数量和每个空位的长度(其需要被引入以用于两个序列的最优比对)，两个序列之间的百分比一致性是序列共有的一致位置的数量的函数。

肽可以是嵌合肽或融合肽。如本文所使用的，“嵌合肽”或“融合肽”包括具有连接至不同的肽(具有本文提供的序列的肽在自然界中不连接至所述不同的肽的序列)的本文提供的序列的肽。例如，不同的肽可以通过肽键直接地融合至本文提供的肽的N-末端或C-末端或通过化学连接体间接地融合至本文提供的肽的N-末端或C-末端。在一些实施方案中，本文提供的肽被连接至包括不同EBV表位的不同肽。在一些实施方案中，本文提供的肽被连接至包括于其他病毒和/或感染性疾病相关的表位的肽。可以通过标准重组DNA技术产生本文提供的嵌合肽或融合肽。例如，根据常规技术，例如，通过采用平端末端或交错端末端以用于连接、限制酶消化以提供适当的末端、酌情补平粘性端、碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接、以及酶促连接，将编码不同肽序列的DNA片段在框内连接在一起。在另一个实施方案中，可以通过常规技术(包含自动DNA合成仪)合成融合基因。可替代地，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续基因片段之间产生互补突出端，其随后可以退火并且再扩增以生成嵌合基因序列(参见，例如，Current Protocols inMolecular Biology,Ausubel et al.,eds.,John Wiley&Sons:1992)。此外，许多表达运载体是商业可获得的，所述表达运载体已经编码融合部分。

本文提供的肽可以使用标准蛋白质纯化技术通过适当的纯化方案从细胞来源或组织来源分离，并且可以通过重组DNA技术产生，和/或可以使用标准肽合成技术以化学方法合成。可以通过编码本发明的一种或多种肽的核苷酸的表达，在原核宿主细胞或真核宿主细胞中产生本文所描述的肽。可替代地，可以通过化学方法合成这样的肽。用于在重组宿主中表达异源肽的方法、肽的化学合成的方法和体外翻译的方法是本领域公知的，并且被进一步在Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989),2nd Ed.,Cold Spring Harbor,N.Y.；Berger and Kimmel,Methods in Enzymology,Volume 152,Guide to Molecular Cloning Techniques(1987),Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.；Merrifield,J.(1969)J.Am.Chem.Soc.91:501；Chaiken I.M.(1981)CRCCrit.Rev.Biochem.11:255；Kaiser et al.(1989)Science 243:187；Merrifield,B.(1986)Science 232:342；Kent,S.B.H.(1988)Annu.Rev.Biochem.57:957；以及Offord,R.E.(1980)Semisynthetic Proteins,Wiley Publishing中描述，其通过引用被并入本文。

在某些方面，本文提供编码本文所描述的肽的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是运载体。在一些实施方案中，核酸分子是病毒运载体(如基于腺病毒的表达运载体)，所述病毒运载体包括本文所描述的核酸分子。在一些实施方案中，本文提供的运载体编码本文提供的多个表位(例如，如多表位)。在一些实施方案中，本文提供的运载体编码本文提供的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个表位(例如，表1中提供的表位)。

在一些实施方案中，运载体是病毒运载体(例如，腺病毒，如AdE1-LMPpoly)。AdE1-LMPpoly运载体编码来自LMP1和LMP2的限定的CTL表位的多表位，所述LMP1和LMP2被融合至Gly-Ala重复缺失的EBNA1序列。AdE1-LMPpoly运载体描述于，例如，Smith et al.,CancerResearch 72:1116(2012)；Duraiswamy et al.,Cancer Research 64:1483-9(2004)；以及Smith et al.,J.Immunol 117:4897-4906(2006)中，其中的每个特此通过引用被并入。

如本文所使用的，术语“运载体”指能够转运已经与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的运载体是“质粒”，其指环状双链DNA环，附加的DNA区段可以连接至所述环状双链DNA环中。另一种类型的运载体是病毒运载体，其中附加的DNA区段可以连接至病毒基因组中。某些运载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌运载体、游离型哺乳动物运载体)。其他运载体(例如，非游离型哺乳动物运载体)在被引入宿主细胞时可以被整合到宿主细胞的基因组中，并且从而与宿主基因组一起被复制。此外，某些运载体能够指导基因的表达。这样的运载体在本文中被称为“重组表达运载体”(或简单地“表达运载体”)。在一些实施方案中，本文提供被可操作地连接至表达运载体中的一个或更多个调控序列(例如，启动子)的核酸。在一些实施方案中，细胞转录本文提供的核酸，并且从而表达本文所描述的肽。核酸分子可以被整合到细胞的基因组中，或其可以在染色体外。

在一些实施方案中，本文提供含有本文所描述的核酸(例如，编码本文所描述的肽的核酸)的细胞。细胞可以是，例如，原核的、真核的、哺乳动物的、禽的、鼠的和/或人的。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是APC(例如，抗原呈递T细胞、树突状细胞、B细胞或aK562细胞)。在本发明的方法中，本文所描述的核酸可以例如以核酸无需递送运载体(vehicle)被施用至细胞、与递送试剂组合被施用至细胞。在一些实施方案中，本领域已知的任何核酸递送方法可以被用于本文所描述的方法中。合适的递送试剂包含(但不限于)例如，Mirus Transit TKO亲脂性试剂；转化脂(lipofectin)；阳离子脂质体(lipofectamine)；细胞转染剂(cellfectin)；聚阳离子(例如，聚赖氨酸)、缺端胶原、纳米颗粒系统(nanoplexe)和脂质体。在本文所描述的方法的一些实施方案中，脂质体被用于将核酸递送至细胞或受试者。适合于在本文所描述的方法中使用的脂质体可以由标准囊泡形成脂类形成，所述标准囊泡形成脂类通常包含中性的或带负电的磷脂和甾醇(如胆甾醇)。通常由考虑因素(如期望的脂质体尺寸和脂质体在血流中的半衰期)来指导脂类的选择。已知用于制备脂质体的各种各样的方法，例如，如Szoka et al.(1980),Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467；和美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所描述的，其全部公开内容通过引用被并入本文。

本文提供通过向受试者施用表达T细胞受体的同种异体或自体CAR-T细胞来治疗癌症和自身免疫性疾病(例如，MS、SAD、IBD)的方法，所述T细胞受体与呈递在或主要组织相容性复合物(MHC)分子上的抗原(例如，病毒肽抗原)，以及嵌合抗原受体分子特异性结合，所述嵌合抗原受体分子能够特异性结合选定的靶标肽并经由存在于其细胞质尾部的免疫受体活化基序(ITAM)转导随后的活化信号。

在一些实施方案中，用于生成本发明的CAR-T细胞的抗原特异性T细胞选自细胞库或细胞文库(cell bank or library)。优选地，MHC是I类MHC。在某些实施方案中，MHC是II类MHC并且具有α链多肽(其为HLA-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA、HLA-DQA或HLA-DRA)。在一些这样的实施方案中，II类MHC具有β链多肽(其为HLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB、HLA-DQB或HLA-DRB)。如本文所述的这样的T细胞(例如，抗原特异性T细胞和表达CAR的抗原特异性T细胞)在施用给受试者之前被存储在细胞文库或库中。

在一些实施方案中，用于生成本发明的CAR-T细胞的T细胞是多功能T细胞，即那些能够诱导多种免疫效应子功能的T细胞，其对病原体提供比产生只有单一的免疫效应子(例如，单一的生物标志物，如细胞因子或CD107a)更有效的免疫应答。在慢性感染期间，少多功能性、单功能性、甚至“疲劳的”T细胞可能主导免疫应答，从而对预防病毒相关并发症产生负面影响。同样，本发明的CAR-T细胞也是多功能的(例如，展示、保留或具有增强的多功能性)。在一些实施方案中，用于生成本发明的CAR-T细胞的至少50％的T细胞是CD4

本文还提供呈递本文中所描述的肽(例如，包括T细胞表位的肽)的APC。在一些实施方案中，APC是B细胞、抗原呈递T细胞、树突状细胞、或人工抗原呈递细胞(例如，aK562细胞)。在某些优选的实施方案中，APC源自淋巴母细胞，例如BLCL。示例性抗原呈递的BLCL在O’Reily等人的Immunol Res 2007 38:237-250和Koehne等人的Blood 2002 99:1730-1740中描述，其特此通过引用并入本文中。

可以通过从患者样品中取出PBMC并且将其粘附至塑料来制备用于在过程中使用的树突状细胞。通常，单核细胞群体粘着，并且全部其他细胞可以被清洗掉。然后用IL-4和GM-CSF分化粘附的群体以产生单核细胞来源的树突状细胞。这些细胞可以通过添加IL-1β、IL-6、PGE-1和TNF-α(其上调树突状细胞的表面上的重要的共刺激分子)来成熟化，并且然后用本文提供的肽中的一种或更多种转导。

在一些实施方案中，APC是人工抗原呈递细胞(如aK562细胞)。在一些实施方案中，将人工抗原呈递细胞工程化以表达CD80、CD83、41BB-L和/或CD86。示例性人工抗原呈递细胞(包含aK562细胞)描述于美国专利公布号2003/0147869中，其特此通过引用并入。

在某些方面，本文提供生成呈递本文所描述的T细胞表位中的一个或更多个的APC的方法，所述方法包括使APC与包括表位的肽和/或与编码所述表位的核酸接触。在一些实施方案中，APC被照射。可以通过本领域已知的标准技术来产生呈递本文所描述的肽的细胞。例如，细胞可以被施以脉冲以促进肽摄取。在一些实施方案中，用编码本文提供的肽的核酸转染细胞。本文提供产生抗原呈递细胞(APC)的方法，所述方法包括用本文所描述的肽对细胞施以脉冲。产生抗原呈递细胞的示例性实例可以在WO2013088114(其特此通过引用被整体并入)中找到。

在一些实施方案中，本文提供T细胞(例如，CD4T细胞和/或CD8T细胞)，所述T细胞(例如，CD4T细胞和/或CD8T细胞)表达识别MHC上呈递的本文所描述的肽的TCR(例如，αβTCR或γδTCR)。在一些实施方案中，T细胞是CD8T细胞(CTL)，所述CD8 T细胞(例如，CTL)表达识别I类MHC上呈递的本文所描述的肽的TCR。在一些实施方案中，T细胞是CD4 T细胞(例如，辅助性T细胞)，所述CD4 T细胞(例如，辅助性T细胞)识别II类MHC上呈递的本文所描述的肽。

在一些实施方案中，本文提供生成CAR-T细胞、活化CAR-T细胞和/或诱导CAR-T细胞的增殖的方法，CAR-T细胞识别本文所描述的EBV表位中的一种或更多种并且表达嵌合抗原受体(例如，EBV特异性抗D19-CAR-T细胞)。在一些实施方案中，将包括T细胞(即，分离的T细胞)的样品在培养基中与本文提供的APC(例如，呈递I类MHC复合物上的包括EBV表位的肽的APC，如本文所描述的经病毒转导的PBMC)孵育。在一些实施方案中，APC对于从其获得T细胞的受试者是自体的。在一些实施方案中，APC对于从其获得T细胞的受试者不是自体的。在一些实施方案中，将含有T细胞的样品与本文提供的APC孵育2次或更多次。在一些实施方案中，在存在至少一种细胞因子的情况下将T细胞(和/或CAR-T细胞)与APC孵育。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2、IL-4、IL-7和/或IL-15。例如，美国专利公布号2015/0017723(其特此通过引用被并入)中提供用于使用APC诱导T细胞增殖的示例性方法。在优选的实施方案中，用包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的运载体转导这样的抗原特异性(例如，EBV特异性)T细胞，嵌合抗原受体(CAR)通常包括胞外域(extracellular domain/ectodomain)、跨膜域，以及胞内信号传导域(也称为胞内域)。

胞外域使得当在T细胞表面表达时CAR能够将T细胞活性引导到那些表达胞外域识别的靶标的细胞。共刺激域(如4-1BB(CD137)共刺激域)与胞内区中的CD3ζ串联，使T细胞能够接收共刺激信号。

为了举例说明的目的，第一代CAR表示人工受体，其在由T细胞表达时可将其重新定位到预定的疾病相关抗原(例如，肿瘤相关抗原)。这类CAR通常包括一个单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段源自与T细胞受体(TCR)信号传导域(如CD3ζ)融合的靶标特异性抗体(例如肿瘤抗原)。结合抗原后，CAR触发免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAMS)的磷酸化，并启动细胞溶解、细胞因子分泌和增殖所需的信号级联，绕过内源性抗原处理通路和MHC限制。第二代CAR设计包括另外的信号传导域以增强活化和共刺激，例如CD28和/或4-1BB。第二代CAR被观察到诱导更多的IL-2分泌，增加T细胞的增殖和持久性，介导更大的肿瘤排斥反应，延长T细胞的存活时间。第三代CAR是通过结合多个信号传导域，如CD3ζ-CD28-OC40或CD3ζ-CD28-41BB，以增强细胞因子的产生和杀伤能力的效率。

本文公开的CAR的胞外域通常包括靶向域，例如配体结合域或结合靶抗原的抗原识别域。在某些实施方案中，靶向域来自如本文所述的天然T细胞受体(TCR)α和β单链。优选地，此类靶向域具有简单的胞外域(例如，识别HIV感染的细胞的CD4胞外域)。可替代地，此类抗原识别域包括外源识别组件，例如连接的细胞因子(其可导致识别携带细胞因子受体的细胞)。一般而言，关于本文公开的方法，几乎任何以高亲和力结合给定靶标的东西都可以用作抗原识别区域。因此，这样的靶向域通常源自抗体。在一些实施方案中，靶向域是功能性抗体片段或其衍生物(例如，scFv或Fab，或抗体的任何合适的抗原结合片段)。在优选实施方案中，胞外域包括单链可变片段(scFv)。在一些这样的实施方案中，scFv来自单克隆抗体(mAb)。在优选的实施方案中，抗原特异性结合域(例如，scFv)与参与淋巴细胞活化的跨膜和/或信号传导基序(如Sadelain M等人的Nat Rev Cancer2003 3:35–45中所公开，其通过引用整体并入本文中)融合。其还可选地含有信号肽(SP)，以便CAR可以被糖基化并锚定在免疫效应细胞的细胞膜中。scFv的亲和力/特异性在很大程度上由重链(V

在一些实施方案中，靶向域源自天然抗体，例如单克隆抗体。在某些情况下，抗体是人类。在某些情况下，抗体发生了改变，使其在施用至人时免疫原性降低。例如，改变可包括选自嵌合、人源化、CDR嫁接、去免疫和框架氨基酸的突变的一种或更多种技术，以对应于最接近的人类种系序列。在又一实施方案中，靶向域是基于配体的靶向域，其中，例如，本文公开的scFv被用于肿瘤标志物的配体替换。因此，表达IL13受体的配体(IL13R)的CAR将允许T细胞重新定向到胶质母细胞瘤上表达的IL13R。

还公开了能够与至少两个分子靶标(例如，细胞特异性标志物和肿瘤抗原)结合的双特异性CAR。还公开了设计成仅与另一种结合不同抗原(例如癌症相关抗原)的CAR协同工作的CAR。例如，在这些实施方案中，第一CAR的胞内域仅含有信号传导域(SD)或共刺激信号传导区(CSR)，但不含有两者。如果第二CAR被活化，它将提供丢失的信号。例如，如果所公开的CAR含有SD而非CSR，则仅当含有CSR的另一CAR(或T细胞)结合其各自的抗原时，含有该CAR的免疫效应细胞才被活化。同样，如果所公开的CAR含有CSR而非SD，则仅当含有SD的另一CAR(或T细胞)结合其各自的抗原时，含有该CAR的免疫效应细胞才被活化。

示例性抗原包括(但不限于)肿瘤抗原，即由引起免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。另外的抗原结合域可以是肿瘤抗原的抗体或天然配体。另外的抗原结合域的选择将取决于待治疗的特定癌症类型。肿瘤抗原在本领域中是众所周知的，并且包含例如胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、IL-llRa、IL-13Ra、EGFR、FAP、B7H3、Kit、CA LX、CS-1、MUC1、BCMA、bcr-abl、HER2、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、ALK、CD19、TIM3、细胞周期蛋白Bl、凝集素反应性AFP、Fos相关抗原1、ADRB3、甲状腺球蛋白、EphA2、RAGE-1、RUl、RU2、SSX2、AKAP-4、LCK、OY-TESl、PAX5、SART3、CLL-1、岩藻糖基GM1、GloboH、MN-CAIX、EPCAM、EVT6-AML、TGS5、人端粒酶逆转录酶、多聚唾液酸(plysialicacid)、PLAC1、RUl、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、lewisY、sLe、LY6K、HSP70、HSP27、mut hsp70-2、M-CSF、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIBI、BORIS、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAX3、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、LMP2、NCAM、p53、p53突变体、Ras突变体、gplOO、前列腺素、OR51E2、PANX3、PSMA、PSCA、Her2/neu、hTERT、HMWMAA、HAVCR1、VEGFR2、PDGFRβ、生存

肿瘤抗原的进一步非限制性示例包含以下：分化抗原(如酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多系抗原(如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pi 5))；过度表达的胚胎抗原(如CEA)；过度表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因(如p53、Ras、HER-2/neu)；染色体易位产生的独特肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，如EB病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它大型基于蛋白质的抗原包含SCCA、GP73、FC-GP73、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α甲胎蛋白、βHCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242，CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7 Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAL、SDCCAG1 6、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、GPC3、MUC16、TAG-72、LMP1、EBMA-1、BARF-1、CS1、CD319、HER1、B7H6、L1CAM、IL6和MET。

跨膜域(TD)连接胞外域(ectodomain/extracellular domain)和胞内域(endodomain/intracellular domain)，并在细胞表达时位于细胞膜内。跨膜域可源自天然或合成来源。如果来源是天然的，则域可源自任何膜结合或跨膜蛋白质。例如，跨膜区可源自T细胞受体的α、β或ζ链(即，包括至少源自T细胞受体的α、β或ζ链的一个或多个跨膜区)：CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如，CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a，CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BURN(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR和PAG/Cbp。可替代地，跨膜域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包括疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，将在合成跨膜域的每一端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。一个短的寡或多肽连接体，例如长度在2到10个氨基酸之间，可以在CAR的跨膜域和内质域之间形成连接。

胞内域在抗原识别后向免疫效应细胞传送活化信号，活化所述免疫效应细胞的至少一种正常效应功能。在某些实施方案中，例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包含细胞因子的分泌。通常，胞内域可含有胞内信号传导域(ISD)和可选的共刺激信号传导区(CSR)。胞内域可包括T细胞受体(TCR)的ISD和可选的共受体。虽然可以使用整个胞内信号传导域，但不必使用整个链。在使用胞内信号传导域的截断部分的程度上，只要所述截断部分转导效应功能信号，就可以使用所述截断部分来代替完整链。“信号传导域(SD)”(如ISD)通常含有细胞质信号传导序列，细胞质信号传导序列调控TCR复合体的初级活化，TCR复合体以刺激方式起作用，并由信号传导基序组成，这些基序被称为免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)。当ITAM被磷酸化时，信号传导级联被活化。术语“共刺激信号传导区域(CSR)”指来自共刺激蛋白受体的胞内信号传导域，例如CD28、41BB和ICOS，它们能够通过T细胞受体增强T细胞活化。在一些实施方案中，胞内域含有SD或CSR，但不是两者。在这些实施方案中，域仅当含有缺失域的另一个CAR(或T细胞受体)也结合其各自的抗原时，含有所公开的CAR的免疫效应细胞才被活化。含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包含源自CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD32(FcγRIIa)、DAP10、DAP12、CD79a、CD79b、FcγRIγ、FcγRIIIγ、FcεRIβ(FCERIB)和FcεRIγ(FCERIG)的序列。

在特定实施方案中，胞内信号传导域源自CD3 zeta(CD3ζ)(TCRζ、GenBankaccno.BAG36664.1)。T细胞表面糖蛋白CD3 zeta(CD3ζ)链，也称为T细胞受体T3ζ链或CD247(分化簇247)，是一种由CD247基因编码的蛋白质。CD3分子的胞内尾部含有单个ITAM，其对TCR的信号传导能力至关重要。ζ链(CD3ζ)的胞内尾部含有3个ITAM。在一些实施方案中，ζ链是突变ζ链。例如，突变ζ链包括至少一个ITAM中的突变，例如点突变，以使所述ITAM不起作用。在一些这样的实施方案中，膜近端ITAM(ITAM1)、膜远端ITAM(C-末端第三ITAM，ITAM3)或两者都是非功能性的。在进一步的实施方案中，两个膜近端ITAM(ITAM1和ITAM2)或两个膜远端ITAM(ITAM2和ITAM3)是非功能性的。在又一实施方案中，只有ITAM2是非功能性的。在一些实施方案中，突变ζ链包括缺失(例如，截断)突变，使得至少一个ITAM缺失。在一些这样的实施方案中，ζ链缺失膜近端ITAM(ITAM1)、膜远端ITAM(ITAM3)或两者。在其它实施方案中，ζ链缺失两个膜近端ITAM(ITAM1和ITAM2)或两个膜远端ITAM(ITAM2和ITAM3)。在进一步的实施方案中，ζ链缺失ITAM2。本领域的技术人员已知产生突变型CD3ζ的方法(Bridgeman JS等人的Clin Exp Immunol.2014Feb；175(2):258-67和WO2019/133969，其特此以引用的方式并入本文中)。从引入的CAR中去除至少一种ITAM可减少CD3ζ介导的细胞凋亡。可替代地，从引入的CAR中去除至少一个ITAM可以在不损失功能的情况下减小其尺寸。

在一些实施方案中，CAR包括铰链序列。铰链序列是便利抗体柔韧性的氨基酸的短序列(参见，例如，Woof等人的Nat.Rev.Immunol.,4(2):89-99(2004))。铰链序列可位于抗原识别部分(例如，抗-CD19、抗-CD20、抗-CD22或抗CLEC4 scFv)和跨膜域之间。铰链序列可以是源自任何合适的分子或从任何合适的分子获得的任何合适的序列。在一些实施方案中，例如，铰链序列源自CD8a分子或CD28分子。

在优选的实施方案中，所公开的CAR由下式定义：

SP–TD–HG–TM–CSR–SD；或

SP–TD–HG–TM–SD–CSR；

其中“SP”表示可选信号肽，

其中“TD”表示靶向域，

其中“HG”表示可选铰链域(间隔域)，

其中“TM”表示跨膜域，

其中“CSR”表示一个或更多个共刺激信号传导区，

其中“SD”表示信号传导域，并且

其中“—”表示肽键或连接体。

在一些实施方案中，CAR含有一个信号传导域。在其它实施方案中，CAR含有一个或更多个信号传导域(包含共刺激信号传导域)。一个或更多个信号传导域可以是选自以下的多肽：CD8、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、FcγRI-γ、FcγRIII-γ、FcεRIβ、FcεRIγ、DAP10、DAP12、CD32、CD79a、CD79b、CD28、CD3C、CD4、b2c、CD137(41BB)、ICOS、CD27、CD28δ、CD80、NKp30、OX40及其突变体。例如，CAR的胞内域可被设计为包括CD3ζ信号传导域本身或与在本发明的CAR的上下文中有用的任何其它期望的细胞质域组合。可替代地，CAR的细胞质域可以包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的胞内域的CAR的一部分。共刺激分子是细胞表面分子，而非淋巴细胞对抗原作出有效反应所必需的抗原受体或其配体。此类分子的实例包含CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83、CD8、CD4、b2c、CD80、CD86、DAP10、DAP12、MyD88、BTNL3、NKG2D及其突变体特异性结合的配体。因此，虽然主要以CD28作为共刺激信号传导元件来举例说明CAR，但其它共刺激元件及其突变体可单独使用或与其它共刺激信号元件组合使用。例如，在一些这样的实施方案中，优选的CAR共刺激信号传导域是如WO2019/010383中所述的称为“Mut06”的CD28突变域。

在一些实施方案中，CAR具有多个跨膜域，其可以是相同跨膜域的重复，或者可以是不同的跨膜域。

在一些实施方案中，如WO2015/039523中所述(其以引用的方式合并用于该教导)，CAR是多链CAR。多链CAR可包括不同跨膜多肽中的单独胞外配体结合域和信号传导域。信号传导域可以设计成在膜旁位置组装，形成更接近天然受体的柔性结构，从而提供最佳的信号转导。例如，多链CAR可以包括FCERIα链的一部分和FCERIβ链的一部分，使得FCERI链自发地二聚在一起形成CAR。

例如，在Fresnak AD等人的Engineered T cells:the promise and challengesof cancer immunotherapy.Nat Rev Cancer.2016Aug 23；16(9):566-81中描述了另外的CAR构建体，其通过引用整体并入以用于教导这些CAR模型。

在某些实施方案中，CAR可以是例如(且不限于)TRUCK、通用CAR、自驱动CAR、有防护的CAR、自毁式CAR、条件性CAR、经标记的CAR、TenCAR、双重CAR或sCAR。

TRUCK(被重新定向用于通用细胞因子杀伤的T细胞)共同表达嵌合抗原受体(CAR)和抗肿瘤细胞因子。细胞因子的表达可能是组成性的，也可能是由T细胞活化引起的。以CAR特异性为靶标，促炎细胞因子的局部产生将内源性免疫细胞招募到肿瘤部位，并可能增强抗肿瘤反应。

通用的同种异体CAR T细胞被工程化为不再表达内源性T细胞受体(TCR)和/或主要组织相容性复合体(MHC)分子，从而分别预防移植物抗宿主病(GVHD)或排斥反应。

自驱动CAR共同表达CAR和趋化因子受体，后者与肿瘤配体结合，从而增强肿瘤归巢。

在本文公开的某些方面，本发明采用免疫检查点抑制/阻断策略。免疫检查点疗法以刺激或抑制免疫应答的免疫系统关键调节因子为目标。这样的免疫检查点可以在疾病状态下(例如肿瘤)利用，以逃避免疫系统的攻击。检查点抑制剂研究已注意到PD-1抑制剂疗法的活性(El Khoueiry，Sangro等人，2017)，并且FDA已批准纳武单抗(Nivolumab)用于HCC二线治疗，客观响应率为20％。经工程化可抵抗免疫抑制的CAR T细胞(有防护的CAR)可以被基因改造以不再表达各种免疫检查点分子(例如，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1))。示例性“敲低(Knockdown)”和“敲除(Knockout)”技术包含(但不限于)RNA干扰(RNAi)(例如asRNA、miRNA、shRNA、siRNA等)和CRISPR干扰(CRISPRi)(例如CRISPR-Cas9)。在某些实施方案中，CAR T细胞被工程化以表达检查点分子的显性阴性形式。在一些此类这样的实施方案中，免疫检查点分子的胞外配体结合域(即，胞外域)融合到跨膜膜上以竞争配体结合。例如，PD-1的胞外配体结合域可与CD8跨膜域融合，从而从靶标细胞竞争PD-1配体。在一些实施方案中，CAR T细胞被工程化以表达免疫检查点开关受体以利用存在于靶标细胞上的抑制性免疫检查点配体。在这样的实施方案中，免疫检查点分子的胞外配体结合域融合到信号传导、刺激和/或共刺激域。例如，PD-1的胞外配体结合域可与CD28域融合，从而在阻断PD-1信号传导的同时提供CD28共刺激。在进一步的实施方案中，可使用阻断免疫检查点信号传导的适体或单克隆抗体施用CAR T细胞。在一些这样的实施方案中，CAR-T细胞(例如，CAR-T细胞疗法)与PD-1阻断方法相结合，如与PD-1/PD-L1拮抗适体或抗PD-1/PD-L1抗体施用。在优选的实施方案中，联合施用CAR T细胞和PD-1通路阻断抗体。在进一步的实施方案中，将CAR T细胞经工程以表达或表达并分泌免疫检查点阻断抗体，如抗PD-1或抗PD-L1或其片段。在又一实施方案中，用表达本文所述免疫检查点阻断分子的运载体(例如，工程化的病毒)施用CAR T细胞。

利用电穿孔传递的RNA对CAR进行编码，可以设计出自毁式CAR。可替代地，通过基因修饰的淋巴细胞中的胸苷激酶结合更昔洛韦或最近描述的通过小分子二聚体活化人半胱氨酸蛋白酶9的系统，可以实现T细胞的诱导凋亡。

条件性CAR T细胞在默认情况下是无反应的，或关闭的，直到加入一个小分子来完成“电路”(例如，分子通路)，使信号1和信号2能够完全转导，从而活化CAR T细胞。可替代地，可将T细胞工程化以表达接合体特异性受体，接合体特异性受体与随后施用的针对靶标抗原的二级抗体具有亲和力。

经标记的CAR T细胞表达CAR加上肿瘤表位，现有的单克隆抗体试剂与肿瘤表位结合。在无法忍受的不良反应的情况下，单克隆抗体的施用清除了CAR T细胞，减轻了症状，没有额外的肿瘤外效应。

串联CAR(TanCAR)T细胞表达由两个连接的单链可变片段(scFv)组成的单个CAR，两个连接的单链可变片段(scFv)与一个或多个胞内共刺激域和CD3ζ域具有不同的亲和力。只有当靶标细胞共同表达两个靶标时，才能活化TanCAR T细胞。

双重CAR T细胞表达两个具有不同配体结合靶标的单独的CAR。作为非限制性示例，一个CAR可仅包含CD3ζ域，而另一个CAR仅包含共刺激域。在一些这样的实施方案中，当两个靶标在肿瘤上表达时，双重CART细胞被活化。

安全CAR(sCAR)由融合到胞内抑制域的胞外scFv组成。共表达标准CAR的sCAR T细胞只有在遇到具有标准CAR靶标但缺乏sCAR靶标的靶标靶标细胞时才会被活化。

还公开了编码所公开的靶向特异性CAR的多核苷酸和多核苷酸载体，其允许所公开的免疫效应细胞(例如T细胞)中表达所述CAR。

编码所公开的CAR及其区的核酸序列可使用本领域中已知的重组方法获得，如，通过使用标准技术从表达该基因的细胞中筛选文库、通过从已知包含该基因的运载体中获得或通过直接从含有该基因的细胞和组织中分离，使用标准技术。可替代地，感兴趣的基因可以合成产生而非克隆产生。

编码CAR的核酸的表达通常通过将编码CAR多肽的核酸可操作地连接到启动子并将构建体并入表达运载体中来实现。典型的克隆运载体含有转录和翻译终止子、起始序列和对于调控期望的核酸序列的表达有用的启动子。

所公开的核酸可以被克隆到多种类型的运载体中。例如，可以将核酸克隆到运载体中，运载体包括但不限于质粒、噬菌体粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的运载体包含表达运载体、复制运载体、探针生成运载体和测序运载体。

此外，表达运载体可以病毒运载体的形式提供给细胞。病毒运载体技术在本领域中是众所周知的，并且例如在Sambrook等人的(2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其它病毒学和分子生物学手册中描述。可用作运载体的病毒包括但不限于逆转录病毒(例如，伽玛逆转录病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的运载体含有在至少一种生物体中具有功能的复制源、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一个或更多个可选择标志物。在一些实施方案中，多核苷酸运载体是慢病毒运载体或逆转录病毒运载体。优选地，多核苷酸运载体是伽玛逆转录病毒运载体。

许多以病毒为基础的系统已经被开发用于基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因传递系统提供了方便的平台。可使用本领域中已知的技术将所选基因插入运载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并将其体内或体外递送到受试者的细胞中。

一个合适的启动子的实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是一个强大的组成性启动子序列，能够驱动与之操作连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其它组成性启动子序列，包含但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、MND(骨髓增生性肉瘤病毒)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒即刻早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。可替代地，启动子可以是可诱导启动子。可诱导启动子的实例包括但不限于金属硫堇启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

另外的启动子元件，例如增强子，调控转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近有许多启动子也被证明含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，因此当元件相互翻转或移动时，启动子功能得以保持。

报告基因用于鉴别潜在的转染细胞和评估调控序列的功能。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或由其表达并且编码多肽(多肽的表达通过一些易于检测的特性(例如酶活性)来表现)的基因。报告基因的表达在DNA被引入受体细胞后的适当时间进行检测。合适的报告基因可包含编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因。合适的表达系统是众所周知的，并且可以使用已知技术制备或商业上获得。通常，报告基因表达水平最高的5′侧翼区最小的构建体被确定为启动子。这样的启动子区可与报告基因连接并用于评估调节启动子驱动的转录的能力的剂(agent)。

本领域中已知将基因引入和表达到细胞中的方法。在表达运载体的上下文中，可以通过本领域的任何方法将运载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物手段将表达运载体转移到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。生产包括运载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域是众所周知的。参见，例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA运载体。病毒运载体，尤其是逆转录病毒运载体，已经成为将基因插入哺乳动物细胞(如人类细胞)的最广泛使用的方法。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包含水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。在体外和体内用作递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。

在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。在另一方面，核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸相关联的连接分子附接到脂质体、包封在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂类的溶液中、与脂类混合、与脂类结合，作为脂类悬浮液、含有胶束或与胶束复合、或以其它方式与脂类相关联。脂质、脂质/DNA或脂质/表达运载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可能以胶束形式存在于双层结构中，或以“折叠”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂类是脂肪物质，可能是天然存在的或合成的脂类。例如，脂类包含天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛类)的一类化合物。适合使用的脂质可从商业来源获得。例如，二苯乙烯磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从密苏里州圣路易斯的西格玛获得；磷酸二丁酯(“DCP”)可从K&K实验室(纽约州普莱恩维尤)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem Behring获得；二苯乙烯磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可从Avanti Polar Lipides公司(阿拉巴马州伯明翰)获得。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，将表达运载体引入细胞(例如，抗原特异性T细胞，细胞(例如，抗原特异性T细胞也可含有选择标记基因或报告基因或两者，以便利从寻求通过病毒运载体转染或感染的细胞群体中鉴别和选择表达细胞。在其它实施方案中，可选择标志物可携带在单独的DNA片段上并在共转染程序中使用。可选择的标志物和报告基因两者都可能有适当的调控序列，以便在宿主细胞中表达。在一些实施方案中，编码CAR的运载体包括慢病毒运载体。在一些优选的实施方案中，编码CAR的运载体包括伽玛逆转录病毒运载体。最优选地，编码CAR的运载体包括编码可选择标志物或物理标签的核酸序列，可选择标志物或物理标签仅允许选择那些表达由所述运载体编码的CAR的细胞。有用的可选择标志物包含但不限于抗生素耐受性基因、报告基因或物理标签的表达。物理标签可以包含但不限于截短的细胞表面肽(例如，缺乏胞内信号传导域的细胞表面受体)，并且可以使用本领域中已知的方法用适当的抗体来选择。在一些实施方案中，编码CAR的运载体包括编码抗生素耐受性基因(例如bor-杀稻瘟菌素抗性)的核酸序列。在一些这样的实施方案中，CART细胞(例如，抗原特异性CAR T细胞)在选择标志物(例如，杀稻瘟菌素)存在下培养，从而允许选择和扩增本文所述的表达CAR的T细胞。

在一些实施方案中，本文提供的方法旨在通过向受试者施用本文提供的自体或同种异体CAR-T细胞来治疗受试者中的癌症和/或自身免疫性疾病。

本公开的方法部分地依赖于对特定靶抗原的T细胞限制的原理。例如且不限于，可在包含EBV转化的B淋巴细胞(BLCL)的靶向抗原呈递(例如，刺激因子)细胞系上诱导包括针对由病毒(如EB病毒(EBV))表达的抗原的供体衍生CTL的产物和制剂。关于所公开的病毒抗原特异性CAR-T细胞制剂(例如，抗CD19-CD28-CAR-EBV-CTL)，通过本文提供的方法制备的CAR-T产品的靶标细胞和/或受体可以是自体的或同种异体的。对于同种异体靶标，供体的人类白细胞抗原(HLA)身份必须已知并与靶标(即经培养细胞系和/或受体)的HLA身份匹配。

CAR T细胞的制备可能具有抗原特异性和非特异性CTL的混合物。因此，为了量化同种异体反应性CTL(例如，抗原特异性CTL有或没有CAR)，引发针对HLA不匹配靶标的反应。理想情况下，细胞裂解应当是最小的，或者低于预定的阈值。此外，可扩增CTL或表达CAR的CTL的水平可通过限制稀释试验和针对同种异体靶标的细胞毒性稀释来量化。

用于本文所公开的分析的靶标细胞通常因其均匀表型和大量可用性而被选择。在某些实施方案中，靶标细胞系是抗原呈递细胞(APC)。在一些这样的实施方案中，靶标细胞系是B细胞、抗原呈递T细胞、树突状细胞或人工抗原呈递细胞(例如aK562细胞)。在某些实施方案中，靶标细胞系包括外周血单核细胞(PBMC)。在一些这样的实施方案中，靶标细胞系是淋巴母细胞。在某些优选的实施方案中，靶标细胞系经病毒转化。在优选的实施方案中，靶标细胞系包括植物血凝素刺激的外周血淋巴细胞(PHA母细胞/PHAb)和EB病毒转化的B淋巴细胞样细胞系(BLCL)中的每一个。如本文中用于评估表达CAR的抗原特异性CTL的示例所示，BLCL具有以下优点：较大的细胞具有高活力，并且能够保留显著的乳酸脱氢酶(LDH)和/或较大的胞内铬(Cr)储库，使得它们有利于经由Cr或LDH释放测定进行细胞毒性评估。然而，在EBV抗原的情况下，BLCL(如用作APC的BLCL)是EBV抗原阳性的，这允许EBV抗原特异性交叉呈递到对不匹配的HLA等位基因特异性的T细胞受体(TCR)。PHA母细胞具有EBV抗原阴性的优点，不能将EBV抗原交叉呈递给TCR。尽管如此，PHA母细胞还是更小，而且通常更脆弱的细胞。这导致较小的储库和渗透性的报告，最终提供更高的概率假阳性细胞毒性结果。因此，BLCL和PHA母细胞可作为来自同一供体的靶标细胞对。在一些这样的实施方案中，靶标细胞源自本文所述的同种异体CAR T细胞制剂的潜在受体，以便指导要施用的CAR T细胞制剂的适当选择。

在某些实施方案中，如果制剂诱导多个靶标细胞系中高于预定阈值的裂解，则方法还包括在制剂中量化能够裂解靶标细胞系的可扩增的CAR-T CTL的频率，其中，如果样品含有处于或低于预定阈值的水平的可扩展CAR-T CTL，则样品被鉴定为不具有临床同种异体反应性。在某些实施方案例中，在量化细胞溶解性可扩增的CAR-T CTL的频率之前，制剂诱导同种异体PHA母细胞系和同种异体细胞系中的每一个中超过15％的溶解。

在一些实施方案中，量化制剂中可扩增的CAR-T-CTL的频率包括在CAR-T-CTL扩增一段时间后评估细胞溶解功能，例如通过执行限制性稀释分析。在进一步的实施方案中，评估细胞溶解功能包括执行检测方法，例如放射性铬(例如，

在一些实施方案中，靶标细胞系包括同种异体细胞。在一些这样的实施方案中，靶标细胞携带人类白细胞抗原(HLA)等位基因，这些等位基因与制剂的CAR-T CTL受限的HLA等位基因不匹配。在其它这样的实施方案中，靶标细胞携带与制剂的CAR-T CTL受限的HLA等位基因部分匹配的HLA等位基因。在其它这样的实施方案中，靶标细胞携带与制剂的CAR-T CTL受限的HLA等位基因匹配的HLA等位基因。在优选的实施方案中，CAR-T CTL限于编码MHCⅠ类蛋白质的靶标细胞的HLA等位基因。

在其它实施方案中，靶标细胞系包括自体细胞。在一些这样的实施方案中，通过确认制剂在预定阈值、高于或低于预定阈值时裂解两个或更多个自体靶标细胞系的能力，将CAR-T CTL制剂鉴定为适合用于对抗靶标细胞。

在某些诉讼法中，自体或同种异体CAR-T细胞包括中央记忆型T细胞(TCM细胞)，例如，至少60％、70％、80％的细胞是Tcm细胞。在一些实施方案中，自体或同种异体CAR-T细胞包括中央记忆型T细胞与效应记忆型细胞的比率(T

在一些实施方案中，本文提供的方法可用于治疗任何自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的示例包括例如肾小球肾炎、关节炎、扩张型心肌病样疾病、溃疡性结肠炎(ulceouscolitis)、斯耶格伦综合征、克罗恩病、系统性狼疮、慢性类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、斯蒂尔病、多发性硬化、银屑病、变应性接触性皮炎、多肌炎、厚皮病、结节性动脉周围炎、风湿热、寻常型白癜风、贝赫切特病、桥本病、艾迪生病、皮肌炎、重症肌无力、赖特综合征、格雷夫斯病、恶性贫血、不孕症、天疱疮、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、慢性活动性肝炎、艾迪生病、抗磷脂综合征、特应性变态反应、自身免疫性萎缩性胃炎、胃酸缺乏自身免疫(achlorhydra autoimmune)、乳糜泻、库欣综合征、皮肌炎、盘状红斑狼疮、古德帕斯彻综合征(Goodpasture's syndrome)、桥本甲状腺炎、特发性肾上腺萎缩、特发性血小板减少症、胰岛素依赖型糖尿病、兰-伊(Lambert-Eaton)综合征、狼疮样肝炎、淋巴细胞减少症、混合性结缔组织病、类天疱疮、寻常性天疱疮、恶性贫血、晶状体源性葡萄膜炎(phacogenic uveitis)，结节性多动脉炎、多腺体自体综合征(polyglandularautosyndromes)、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、雷诺综合征、复发性多软骨炎、施密特综合征、局限性硬皮病(或嵴综合征)、交感性眼炎、系统性红斑狼疮、高安动脉炎、颞动脉炎、甲状腺毒症、b型胰岛素抵抗、I型糖尿病、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)和韦格纳肉芽肿病。

在一些实施方案中，本文提供的方法用于治疗MS。在一些实施方案中，MS是复发缓解型MS、继发进行性MS、原发进行性MS或进行性复发性MS。

在一些实施方案中，本文提供的方法用于治疗SAD。例如，在某些实施方案中，本文提供的方法用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和/或斯耶格伦综合征。

在一些实施方案中，本文提供的方法用于治疗IBD。例如，在某些实施方案中，本文提供的方法用于治疗克罗恩病(区域性肠病，例如，非活性和活性形式)、乳糜泻(celiacdisease)(例如，非活性或活性形式)和/或溃疡性结肠炎(例如，非活性和活性形式)。在一些实施方案中，本文提供的方法用于治疗肠易激综合征、显微镜下结肠炎、淋巴细胞浆细胞性肠炎、乳糜泻(coeliac disease)、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、嗜酸性结肠炎、不确定结肠炎、传染性结肠炎(病毒性、细菌性或原生动物，例如阿米巴结肠炎)(例如，梭状芽孢杆菌性结肠炎、假膜性结肠炎(坏死性结肠炎)、缺血性炎症性肠病、白塞病、结节病、硬皮病、IBD相关的发育不良、发育不良相关的肿块或病变和/或原发性硬化性胆管炎。

在一些实施方案中，本文提供通过向受试者施用如本文所述的治疗性CAR-T细胞制剂来治疗受试者中的癌症的方法。

在一些实施方案中，本文提供的方法可用于治疗任何癌症。例如，在一些实施方案中，本文所述的方法和CAR-T细胞可用于治疗任何癌性或癌前肿瘤。在一些实施方案中，癌症包括实体肿瘤。在一些实施方案中，可通过本文提供的方法和组合物治疗的癌症包括但不限于来自膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、胃肠、牙龈、头部、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的癌细胞。此外，癌症可以具体地是以下组织学类型，但不限于这些：恶性新生物；癌；未分化的癌；巨型梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移形细胞癌；乳头状移形细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；肝细胞癌合并胆管癌；小梁状腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞型癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包裹性硬化型癌(nonencapsulating sclerosingcarcinoma)；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；盯聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺派杰氏病；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌伴鳞状上皮化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞肿瘤；以及恶性成神经细胞瘤(malignant roblastoma)；塞托利细胞癌；恶性莱迪希细胞肿瘤；恶性脂质细胞肿瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩张性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性皮肤纤维瘤；粘液肉瘤；脂肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡性横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒混合肿瘤(mullerian mixed tumor)；肾母细胞瘤；肝胚细胞瘤；癌肉瘤；恶性间充质瘤；恶性卵巢纤维上皮瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性甲状腺肿样卵巢瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮细胞瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间充质型软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；成星形细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑脊膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞肿瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；类肉芽肿；小淋巴细胞恶性淋巴瘤；弥散性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿病；其他规定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴细胞白血病；血浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓细胞白血病；嗜碱细胞白血病；嗜酸细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓系肉瘤；和毛细胞白血病。。在一些这样的优选实施方案中，本文提供的组合物和方法可用于治疗包含慢性淋巴细胞白血病(CLL)、ALL和许多非霍奇金淋巴瘤的B细胞恶性肿瘤(例如CD19

在一些实施方案中，本文提供的方法用于治疗EBV相关癌症。在一些实施方案中，EBV相关癌症是EBV相关NPC。在一些实施方案中，EBV相关癌是移植后淋巴增生性疾病(PTLD)、NK/T细胞淋巴瘤、EBV

在一些实施方案中，受试者已暴露于病毒(例如EBV)中，使得可在受试者的血液中检测到病毒颗粒。在一些实施方案中，方法还包括测量受试者中的病毒载量(例如，在向受试者施用肽特异性CAR-T细胞之前或之后)。确定受试者中的病毒载量可能是免疫治疗有效性的良好预后标志。在一些实施方案中，选择CAR-T细胞的操作还包括确定受试者中(例如，在组织或血液样品中)的病毒DNA拷贝数。在一些实施方案中，病毒载量被测量两次或更多次。本文提供的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得活性成分的量，所述活性成分的量对实现特定患者、组合物和施用模式的期望的治疗响应是有效的，而对患者没有毒性。

所选择的剂量水平将取决于各种各样的因素，所述因素包含所采用的特定药剂的活性、施用途径、施用时间、正在被采用的特定化合物的排泄或代谢的速率、治疗的持续时间、与所采用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在被治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、总体健康状况和先前的病史，以及医学领域中众所周知的类似因素。

在一些实施方案中，本文所述的方法包含从细胞库(例如，表位特异性T细胞的预生成第三方供体衍生库)中选择同种异体T细胞。在一些实施方案中，选择T细胞是因为它们表达限制于I类MHC的TCR，所述I类MHC由存在于受试者中的HLA等位基因编码。在一些实施方案中，如果T细胞和受试者共享至少2个(例如，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个)HLA等位基因并且T细胞通过共享的HLA等位基因受到限制，则选择T细胞。在一些实施方案中，方法包括使用流式细胞术测试预生成的第三方供体衍生表位特异性T细胞(即同种异体T细胞)的TCR库(TCR repertoire)。在一些实施方案中，使用四聚体测定、ELISA测定、免疫蛋白印迹测定(western blot assay)、荧光显微镜测定、埃德曼降解测定和/或质谱测定(例如，蛋白质测序)检测表位特异性T细胞。在一些实施方案中，使用核酸探针、核酸扩增测定和/或测序测定来分析TCR库。

在一些实施方案中，本文提供的组合物(例如，治疗组合物)包括本文提供的T细胞和/或APC，用于通过向受试者施用有效量的组合物来治疗和/或预防受试者中的自身免疫疾病。在一些方面，本文提供使用组合物(例如，药物组合物，这样的组合物包括同种异体CTL)治疗自身免疫性紊乱的方法。在一些实施方案中，组合物包含本文提供的多个(例如，两个或更多个)CTL的组合。

实施例

实施例1：源自PBMC和分离的T细胞的EBV CTL的CAR转导的比较

将来自健康供体的冻存的PBMC解冻后回收到RPMI培养基中。将细胞分成两部分；1/3的细胞(刺激因子)在37℃下用AdE1-LMPpoly腺病毒感染1小时。然后将刺激因子洗涤两次并重新悬浮在RPMI/AB血清培养基中，并以2500cGy(2500rads)照射。剩余的2/3的细胞(应答因子)要么转移到RPMI/AB血清培养基中并保持在37℃直到它们可以与刺激因子(例如源自PBMC的BLCL)混合，要么用于分离CD3

PBMC活化

在第0天，在6孔(10cm

分离的CD3

在第0天，通过本领域中已知的方法(例如，活FACS或抗CD3涂覆的磁珠)从PBMC分离(即，富集)T细胞。T细胞在6孔(10cm

CAR转导

在第9天和第10天，分离的T细胞和PBMC培养物用编码抗CD19CAR(和杀瘟素选择标志物)的重组病毒转导。简单地说，在每种刺激条件下，将逆转录连接蛋白(retronecti)(0.5mL 10μg/mL)添加到24孔非组织培养处理平板的每个孔中，并在室温下孵育2小时。然后通过抽吸去除后逆转录连接蛋白，用0.5mL封闭缓冲液替换到每个孔中，并在室温下孵育30分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤平板。将编码抗CD19-CAR的病毒在室温下解冻并加入平板中。将平板包裹在石蜡膜中，以2000×g在32℃下离心2小时。吸取病毒上清液并添加来自每个刺激组的1ml制备的细胞悬浮液(0.5×106细胞/ml再悬浮在YH5培养基中)。平板在1000×g下在32℃C下离心15分钟，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。然后去除每个刺激条件下的细胞，并合并计数。细胞以0.5-1.0×10

在第11天，将每个刺激条件(即分离的T细胞或应答PBMC)恢复到与辐照刺激因子PBMC一起培养。在第15天、第23天和第27天采集样品，用于荧光活化细胞分选(FACS)(例如CD3

源自分离的T细胞中的EBV-CTL证明提高的生存能力和增殖能力。富含CD3

实施例2：BLCL刺激后抗CD19-CAR-EBV-CTL记忆型T细胞表型的评估

标准的抗CD3/CD28珠刺激作为一种在体外扩增T细胞的方法被广泛应用于CAR运载体的转导之前。下面的实验是为了确定适合于高产量制造方法的各种CAR-T刺激对最终治疗产品的记忆型T细胞免疫表型的影响。

研究设计和程序

分离的CD3

1.无刺激；

2.可溶性抗CD3/CD28；

3.抗CD3/CD28磁珠；以及

4.用BLCL细胞。

刺激3天后，用编码嵌合抗原受体(CAR)的病毒运载体转导每个培养物，并在标准(YH培养基)培养基中恢复孵育7天，以允许经转导的T细胞扩增。然后收集细胞，通过细胞染色和荧光活化细胞分选(FACS)分析细胞表型，如图5所示。

细胞系和培养条件

将CD3

表2：评估刺激和CAR转导后T细胞记忆型表型的刺激条件

用抗CD3/CD28免疫磁珠的刺激在1:1的细胞:珠比率下进行。在直接添加到细胞悬浮液之前，去除足够体积的珠子并在DPBS中洗涤。因此，如上所述，刺激培养物在24孔板中以每孔含100IU/mL IL-2的2mL YH5培养基进行点板，并孵育3天。

通过直接添加浓度为25μl/mL(即上述24孔板中每孔50μl)的CD3/CD28ImmunoCult

用EBV转化的类淋巴母细胞样B细胞系(BLCL)以1个EBV抗原特异性T细胞与4个BLCL细胞的比例进行刺激。简言之，将CD3

CAR转导

在制备转导时，按如下方法制备24孔板：向24孔非组织培养处理板的每个孔中添加0.5mL逆转录连接蛋白(10μg/mL)，并在室温下孵育2小时。然后去除逆转录连接蛋白，用0.5ml封闭缓冲液替换，并在室温下孵育30分钟。然后移除封闭缓冲液，并用至少1mL的洗涤缓冲液清洗每个孔。在4℃下用洗涤缓冲液保持板，直到可以使用为止。

将编码CAR的慢病毒运载体(包括4-1BB或CD28信号转导域)在室温下解冻并添加到逆转录连接蛋白涂覆的板的每个孔中以获得MOI(多重感染)或15个病毒颗粒/细胞(参见表2)。然后将培养板包裹在石蜡膜中，并以2000×g在32℃下离心2小时，在此期间计数来自每个刺激组的细胞，并以0.5×10

表3：FACS试剂-结合抗体和活性染料

将来自各刺激组的细胞汇集、计数并以新鲜YH5培养基的0.5-1.0×10

表4：CD19-CAR-T细胞上CD62L

流式细胞术评估表明，与可溶性CD3/CD28或珠刺激相比，经EBV-BLCL刺激的经转导的CD19-CAR-T细胞在CD62L

表5：CD19-CAR-T细胞上CD4和CD8的频率(CD3门控)

CD19-CAR-T细胞上也检测CD4和CD8的表达。在CD19-CAR-T细胞的CD3

这些数据表明，与通过珠结合或可溶性抗体的CD3/CD28刺激的结果相比，用表达CAR靶向抗原的BLCL刺激CAR-T细胞培养可导致向主要的中央记忆型表型转变。本研究强烈支持相比于使用标准抗CD3/CD28珠或其它无细胞刺激模式时预期的质量，利用抗原阳性APC刺激(以抗原呈递BLCL为代表)的CAR-T细胞培养的潜在质量改善。

实施例3：抗CD19-CAR-EBV-CTL发挥有效的和特异性的细胞毒性

与上述类似，编码CAR(包括4-1BB或CD28信号转导域)的慢病毒运载体用于EBVBLCL刺激的CD3

简言之，以以下方式制备表达CAR的病毒特异性T细胞。

·第0天，将PBMC样品解冻，并富集CD3

·刺激后11天(第11天)，去除培养物中的NK细胞(例如，使用抗CD56珠)，并用新鲜的EBV抗原呈递的BLCL在1:4的应答/刺激比率下再刺激培养物7天。

·在第18天，以4:1的应答/刺激比率第三次刺激培养物2天。

·在第20天，用编码嵌合抗原受体(CAR)的病毒运载体启动转导，并在标准培养基(YH培养基)中恢复孵育，以允许经转导的病毒特异性T细胞的扩增。可选地，可在紧接转导之前采用NK细胞去除步骤。

·到第25天，评估CAR表达(例如，通过FACS测定)，并将表达CAR的病毒特异性T细胞(效应子)添加到靶标培养物中进行细胞毒性测定。可选地，细胞可以在第25天冷冻，然后在第28天解冻并测试细胞毒性。

在与EBV-CAR19-CAR T细胞或对照EBV CTL以指示的E:T比率共培养4小时后，可以观察到通过LDH释放测定的细胞毒性(参见图9和图10)。EBV-CD19-CAR T细胞通过特异性杀伤CD19

当与常规产生的CAR T细胞(即，没有开始T培养的富集或抗原刺激)相比时，抗原特异性CAR T细胞(例如，抗CD19-CD28-CAR-EBV-CTL)展现出相当的细胞毒性(即使不是更好的话)(参见图12)。然而，抗CD19-CD28-CAR-EBV-CTL的同种异体反应性似乎较低。与所示细胞系共培养后，通过CellTrace

以下是本文公开的本发明的一些特定编号实施方案。这些实施方案是示例性的并且仅用于说明的目的。应当理解，本发明不限于实施方案，而是包括在上述公开的范围内的所有形式及其组合。

实施方案1.一种生成包括表达嵌合抗原受体(CAR)的抗原特异性T细胞的制剂的方法，方法包括：

i)制备CD3

ii)用包括编码CAR的核酸序列的病毒运载体转导所述培养物的T细胞；

iii)培养经转导的T细胞以允许表达CAR的抗原特异性T细胞增殖；以及

iv)收获表达CAR的抗原特异性T细胞。

实施方案2.一种诱导表达CAR的抗原特异性T细胞的群体体外增殖的方法，方法包括：

i)制备CD3

ii)用包括编码CAR的核酸序列的病毒运载体转导T细胞；

iii)培养经转导的T细胞群体，以允许表达CAR的抗原特异性T细胞增殖；以及

iv)收获表达CAR的抗原特异性T细胞以进行处理。

实施方案3.根据实施方案1或2所述的方法，方法还包括用抗原呈递刺激细胞培养步骤iii)的经转导的T细胞。

实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，方法还包括将步骤i)、ii)、iii)或其任何组合的培养物与一种或更多种细胞因子孵育。

实施方案5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，方法还包括在与CD3

实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中刺激细胞是经辐照的抗原呈递刺激细胞。

实施方案7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中CD3

实施方案8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中CD3

实施方案9.根据实施方案8的方法，其中CD3

实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中CD3

实施方案11.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中CD3

实施方案12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中刺激细胞包括淋巴母细胞、B细胞、抗原呈递T细胞、树突状细胞、人工抗原呈递细胞和/或K562细胞。

实施方案13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中刺激细胞包括类淋巴母细胞样B细胞(BLCL)。

实施方案14.根据实施方案1至13中任一项所述的方法，其中刺激细胞从供体样品中阳性选择。

实施方案15.根据实施方案14所述的方法，其中阳性选择的细胞为CD19

实施方案16.根据实施方案1至15中任一项所述的方法，其中刺激细胞感染含有至少一种包括T细胞表位的免疫原性肽抗原的天然和/或野生型病毒。

实施方案17.根据实施方案1至15中任一项所述的方法，其中刺激细胞表达病毒运载体，病毒运载体包括编码至少一种免疫原性肽抗原的核酸序列，免疫原性肽抗原包括T细胞表位。

实施方案18.根据实施方案16或17所述的方法，其中免疫原性肽抗原来自肿瘤病毒。

实施方案19.根据实施方案16至18中任一项所述的方法，其中免疫原性肽抗原来自疱疹病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、多瘤病毒或逆转录病毒。

实施方案20.根据实施方案16至19中任一项所述的方法，其中免疫原性肽抗原来自EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人乳头瘤病毒(HPV)、BK病毒(BKV)、约翰·坎宁安病毒(JCV)、默克尔细胞病毒(MCV)、人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)或人类免疫缺陷病毒(HIV)。

实施方案21.根据实施方案16至18中任一项所述的方法，其中免疫原性肽抗原来自已知可引起病毒性肝炎的病毒。

实施方案22.根据实施方案17所述的方法，其中病毒运载体是复制缺陷的。

实施方案23.根据实施方案17至22中任一项所述的方法，其中病毒运载体包括编码一个或更多个免疫原性肽抗原的核酸序列。

实施方案24.根据实施方案17至23中任一项所述的方法，其中病毒运载体是腺病毒运载体。

实施方案25.根据实施方案24所述的方法，其中腺病毒运载体包括编码一种或更多种EBV抗原的核酸序列。

实施方案26.根据实施方案24或25所述的方法，其中腺病毒运载体是AdE1-LMPpoly。

实施方案27.根据实施方案1至26中任一项所述的方法，其中刺激细胞呈递一种以上包括T细胞表位的免疫原性肽抗原。

实施方案28.根据实施方案1至27中任一项所述的方法，其中刺激细胞表达一种或更多种EBV抗原。

实施方案29.根据实施方案28的方法，其中一种或更多种EBV抗原包括LMP1肽或其片段、LMP2A肽或其片段和/或EBNA1肽或其片段。

实施方案30.根据实施方案1至29中任一项所述的方法，其中刺激细胞内源性地表达由CAR靶向的抗原或配体。

实施方案31.根据实施方案1至29中任一项所述的方法，其中刺激细胞表达包括编码由CAR靶向的抗原或配体的核酸序列的运载体。

实施方案32.根据实施方案30或31所述的方法，其中CAR抗原或配体是CD19。

实施方案33.根据实施方案1至32中任一项所述的方法，方法可选地包括冷冻和储存CD3

实施方案34.根据实施方案33所述的方法，其中在转导之前，将CD3

实施方案35.根据实施方案1至34中任一项所述的方法，方法包括在转导之前将所述培养物中的CD3

实施方案36.根据实施方案35所述的方法，方法包括在转导之前将所述培养物中的CD3

实施方案37.根据实施方案35所述的方法，方法包括在转导之前将所述培养物中的CD3

实施方案38.根据实施方案35所述的方法，方法包括在转导之前将所述培养物中的CD3

实施方案39.根据实施方案35所述的方法，方法包括在转导之前将所述培养物中的CD3

实施方案40.根据实施方案1至39中任一项所述的方法，方法包括在转导之后将所述培养物中的经转导的T细胞保持至少2天到至少17天。

实施方案41.根据实施方案40所述的方法，方法包括在转导之后将所述培养物中的经转导的T细胞保持至少2天。

实施方案42.根据实施方案40所述的方法，方法包括在转导之后将所述培养物中的经转导的T细胞保持至少7天。

实施方案43.根据实施方案40所述的方法，方法包括在转导之后将所述培养物中的经转导的T细胞保持至少17天。

实施方案44.根据实施方案37至39中任一项所述的方法，方法还包括用刺激细胞再培养所述培养物的CD3

实施方案45.根据实施方案37至39中任一项所述的方法，方法还包括用刺激细胞再培养所述培养物的CD3

实施方案46.根据实施方案44或45所述的方法，其中至少每2至14天开始再培养。

实施方案47.根据实施方案44至46中任一项所述的方法，其中在所述培养物制备后11天开始第一次再培养。

实施方案48.根据实施方案44至47中任一项所述的方法，其中在第一次再培养7天后开始第二次再培养。

实施方案49.根据实施方案1至48中任一项所述的方法，其中包括编码CAR的核酸序列的病毒运载体是慢病毒运载体。

实施方案50.根据实施例49所述的方法，其中编码CAR的病毒运载体是伽玛逆转录病毒运载体。

实施方案51.根据实施方案49或50所述的方法，其中病毒运载体是复制缺陷的。

实施方案52.根据实施方案51所述的方法，其中编码CAR的核酸序列包括一个或更多个信号转导域。

实施方案53.根据实施方案52所述的方法，其中一个或更多个信号转导域包括CD28信号传导域、4-1BB信号传导域和/或CD3信号传导域或其片段。

实施方案54.根据实施方案53所述的方法，其中CD3信号传导域是CD3ζ。

实施方案55.根据实施方案49至54中任一项所述的方法，其中包括编码CAR的核酸序列的病毒运载体还包括编码可选择标志物的核酸序列。

实施方案56.根据实施方案55所述的方法，其中包括编码CAR的核酸序列的病毒运载体还包括编码抗生素耐受性的核酸序列。

实施方案57.根据实施方案56所述的方法，其中抗生素是杀稻瘟菌素。

实施方案58.根据实施方案1至57中任一项所述的方法，其中收获的表达CAR的T细胞是CD3

实施方案59.根据实施方案58所述的方法，方法可选地包括将收获的表达CAR的T细胞冷冻并储存在细胞库中，以便在以后制备过继性免疫疗法组合物。

实施方案60.根据实施方案59所述的方法，其中在制备过继性免疫疗法组合物之前，将表达CAR的T细胞解冻并与刺激细胞再培养至少一次。

实施方案61.根据实施方案58至60中任一项所述的方法，其中收获的表达CAR的T细胞包括中央记忆型T细胞(T

实施方案62.根据实施方案58至60中任一项所述的方法，其中收获的表达CAR的T细胞主要是T

实施方案63.根据实施方案61所述的方法，其中T

实施方案64.根据实施方案63所述的方法，其中T

实施方案65.根据实施方案63所述的方法，其中T

实施方案66.根据实施方案63所述的方法，其中T

实施方案67.根据实施方案58至60中任一项所述的方法，其中收获的表达CAR的T细胞包括CD4

实施方案68.根据实施方案58至60中任一项所述的方法，其中收获的表达CAR的T细胞主要是CD4

实施方案69.根据实施方案68所述的方法，其中CD4

实施方案70.根据实施方案69所述的方法，其中CD4

实施方案71.根据实施方案69所述的方法，其中CD4

实施方案72.根据实施方案69所述的方法，其中CD4

实施方案73.根据实施方案62至72中任一项所述的方法，其中至少60％的收获的表达CAR的T细胞是T

实施方案74.一种用于富集抗原特异性、表达CAR的T细胞的体外方法，方法包括：

(i)从受试者获得细胞样品，样品包括CD3

(ii)从所述样品分离所述CD3

(iii)用编码嵌合抗原受体(CAR)的病毒运载体转导CD3

(iv)可选地，在具有抗原呈递刺激细胞的培养物中体外培养表达CAR的CD3

实施方案75.根据实施方案74所述的方法，其中样品包括外周血单核细胞(PBMC)。

实施方案76.根据实施方案74或75所述的方法，其中分离的CD3

实施方案77.根据实施方案74至76中任一项所述的方法，其中分离的CD3

实施方案78.根据实施方案74至77中任一项所述的方法，其中抗原呈递刺激细胞包括淋巴母细胞、B细胞、抗原呈递T细胞、树突状细胞、人工抗原呈递细胞和/或K562细胞。

实施方案79.根据实施方案74至78中任一项所述的方法，其中抗原呈递刺激细胞是BLCL。

实施方案80.根据实施方案74至79中任一项所述的方法，其中抗原呈递刺激细胞是CD19

实施方案81.根据实施方案74至80中任一项所述的方法，其中抗原呈递刺激细胞表达一种或更多种EBV抗原。

实施方案82.根据实施方案81所述的方法，其中一种或更多种EBV抗原包括LMP1肽或其片段、LMP2A肽或其片段和/或EBNA1肽或其片段。

实施方案83.根据实施方案74至82中任一项所述的方法，方法包括在转导之前，在与所述抗原呈递刺激细胞接触之后将CD3

实施方案84.根据实施方案83所述的方法，方法包括在转导之前，在与所述抗原呈递刺激细胞接触之后将CD3

实施方案85.根据实施方案83所述的方法，方法包括在转导之前，在与所述抗原呈递刺激细胞接触之后将CD3

实施方案86.根据实施方案83所述的方法，方法包括在转导之前，在与所述抗原呈递刺激细胞接触之后将CD3

实施方案87.根据实施方案83所述的方法，方法包括在转导之前，在与所述抗原呈递刺激细胞接触之后将CD3

实施方案88.根据实施方案83至87中任一项所述的方法，方法还包括将所述分离的CD3

实施方案89.根据实施方案83至88中任一项所述的方法，方法还包括将所述分离的CD3

实施方案90.根据实施方案88或89所述的方法，其中至少每2至14天开始将所述分离的CD3

实施方案91.根据实施方案88至90中任一项所述的方法，其中所述分离的CD3

实施方案92.根据实施方案88至91中任一项所述的方法，其中在所述分离的CD3

实施方案93.根据实施方案74至92中任一项所述的方法，其中选择性增强抗原特异性、表达CAR的CD3

实施方案94.根据实施方案93所述的方法，方法包括将抗原特异性、表达CAR的CD3

实施方案95.根据实施方案94所述的方法，方法包括将抗原特异性、表达CAR的CD3

实施方案96.根据实施方案94所述的方法，方法包括将抗原特异性、表达CAR的CD3

实施方案97.根据实施方案74至96中任一项所述的方法，其中编码CAR的病毒运载体是慢病毒运载体。

实施方案98.根据实施方案97所述的方法，其中编码CAR的病毒运载体是伽玛逆转录病毒运载体。

实施方案99.根据实施方案97或98中任一项所述的方法，其中编码CAR的病毒运载体是复制缺陷的。

实施方案100.根据实施方案99所述的方法，其中编码CAR的核酸序列包括一个或更多个信号转导域。

实施方案101.根据实施方案100所述的方法，其中所述一个或更多个信号转导域包括CD28信号传导域、4-1BB信号传导域和/或CD3信号传导域或其片段。

实施方案102.根据实施方案101所述的方法，其中CD3信号传导域是CD3ζ或其片段。

实施方案103.根据实施方案97至102中任一项所述的方法，其中包括编码CAR的核酸序列的病毒运载体还包括编码可选择标志物的核酸序列。

实施方案104.根据实施方案97至102中任一项所述的方法，其中包括编码CAR的核酸序列的病毒运载体还包括编码抗生素耐受性的核酸序列。

实施方案105.根据实施方案74至104中任一项所述的方法，其中选择性增强抗原特异性、表达CAR的CD3

实施方案106.根据实施方案105所述的方法，其中抗生素是杀稻瘟菌素。

实施方案107.一种用于制备过继性免疫疗法组合物的方法，方法包括实施方案74至106中任一项，其中组合物主要包括抗原特异性、表达CAR的CD3

实施方案108.根据实施方案107所述的方法，其中至少60％的过继性免疫疗法组合物包括抗原特异性、表达CAR的CD3

实施方案109.根据实施方案107或108中任一项所述的方法，其中抗原特异性、表达CAR的CD3

实施方案110.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中CAR包括结合CD19的靶向域。

实施方案111.根据实施方案110所述的方法，其中CAR包括抗CD19单链可变片段(ScFv)。

实施方案112.一种用于提高T细胞增殖能力的方法，方法包括执行前述实施方案中任一项所述的方法。

实施方案113.一种用于提高T细胞的转导效率的方法，方法包括执行前述实施方案中任一项所述的方法。

实施方案114.一种用于提高表达CAR的T细胞的活力的方法，方法包括执行前述实施方案中任一项所述的方法。

实施方案115.一种通过前述实施方案中任一项所述的方法制备的T细胞组合物。

实施方案116.一种T细胞制剂，制剂包括表达重组嵌合抗原受体(CAR)的抗原特异性T细胞；其中至少60％的表达CAR的T细胞是T

实施方案117.根据实施方案116所述的T细胞制剂，其中表达CAR的T

援引并入

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等同物

本领域技术人员将认识到或能够使用仅仅常规实验来确定本文中描述的本发明的具体的实施方案的许多等同物。这样的等同物旨在由以下权利要求涵盖。