本发明涉及用于生产具有增加的多不饱和脂肪酸含量的生物质的方法，并且涉及可通过所述方法获得的生物质。
在现有技术中已描述了用于生产含有多不饱和脂肪酸(PUFA)的生物质的方法。此处经常使用的是网粘菌(Netzschleimpilze)，其在细胞中以相对大的量天然积累多不饱和脂肪酸作为储藏脂质。
这些微藻类在海水中自然生长，意味着微藻类的培养最初是在具有高氯化物含量的培养基中进行的。然而，高氯化物含量不适合在钢生物反应器中培养，因为它们会引起金属腐蚀。
因此，在现有技术中已描述了具有低氯化物含量，并且相反地具有高硫酸盐含量的发酵培养基作为替代发酵培养基。
然而，在此情况下，获得的生物质通常具有有限的PUFA含量，推测尤其是因为高硫酸盐含量意味着以存在的PUFA量为代价，最终产物中形成的细胞壁的比例相对高。
在发酵的最后阶段硫酸盐含量非常低的实验显示，作为在发酵的最后阶段调整添加硫酸盐的结果，最终产物中形成的PUFA的相对比例可明显增加，尽管同时，使细胞在相当大的程度上不稳定，意味着于发酵过程中可能已发生存在的油部分释放至发酵培养基中。
基于该知识，本发明的目的是提供一种方法，其中获得的生物质在最终产物中具有增加的PUFA质量比例(massen-anteil)。同时，旨在优选在该方法中使用非腐蚀性发酵培养基，并旨在实现高产物产率和空间/时间产率，并旨在尽可能防止油过早地释放至发酵培养基中。
通过调节培养基中的硫酸盐含量以使发酵的最后阶段培养基中一直存在硫酸盐，但硫酸盐浓度一直低于细胞的饱和浓度(意味着存在的硫酸盐立即被细胞完全同化)的方法来实现本发明的目的是可能的。
因此，本发明首先提供了生产含有PUFA的生物质的方法，其特征在于，通过在发酵培养基中培养产PUFA的细胞来生产生物质，在所述发酵培养基中调节硫酸盐的含量，使得在发酵的最后阶段培养基中一直存在硫酸盐，但培养基中的硫酸盐浓度一直低于细胞的饱和极限。
根据本发明，细胞的硫酸盐饱和极限或硫酸盐饱和浓度定义为在给定条件下可被生物质的细胞立即完全同化的硫酸盐的量。在根据本发明优选的本发明的一个实施方案中，使用了破囊壶菌科(Familie der Thraustochytriaceae)的细胞，其具有大约5g每千克无脂质生物质的硫酸盐饱和极限。
因此，本发明优选进一步提供了用于生产含有PUFA的生物质的方法，其特征在于，通过在发酵培养基中培养破囊壶菌科的细胞而生产生物质，在所述发酵培养基中硫酸盐的含量被调节为使得在发酵的最后阶段，培养基中的硫酸盐浓度一直为0.005至5g硫酸盐每千克无脂质生物质，优选0.01至4g并且特别优选0.01至3g、2g或1g硫酸盐每千克无脂质生物质，以及尤其是0.01至0.05g硫酸盐每千克无脂质生物质。
为优化产油的目的，根据本发明的方法优选包括生长期和随后的产油期。在开放生长期首先发生的是发酵培养基中存在的产PUFA的细胞的生物质的培养和增加-其中产油被最大限度地抑制-结果是在培养基中建立了可能的最高生物质密度，而在随后的产油期(通常通过特定措施起动(Einleitung))中发生的主要是通过生物质的细胞产油，而细胞的生长至少尽可能停止。这意味着在产油期，生物质的增加至少主要不是归因于细胞计数的增加，而是归因于脂质在存在的细胞的细胞内部的积累。通过提供最佳的生长条件使生长期的细胞生长成为可能，而可通过限制单个或多个限制性因素(尤其是营养组分，例如氮源)来起动向产油期的转变。
根据本发明，“发酵的最后阶段”优选理解为意味着产油期。
因此，根据本发明的方法，优选地其特征(zeichnen)在于以下事实：至少在产油期的50％的时间段期间，优选至少在产油期的75％或85％的时间段期间，特别优选至少在产油期的90％或95％的时间段期间，并且尤其是在完整的产油期期间，培养基中存在硫酸盐，但硫酸盐浓度一直低于培养基中存在的细胞的饱和极限。
在这种情况下，优选的方法特征在于以下事实：至少在产油期剩余时间段的50％期间，优选至少在产油期剩余时间段的75％或85％期间，特别优选至少在产油期剩余时间段的90％或95％期间，并且尤其是在完整的产油期期间，培养基中存在硫酸盐，但硫酸盐浓度一直低于培养基中存在的细胞的饱和极限；这意味着，在产油期的相应的互补的初始阶段期间，硫酸盐的浓度任选地仍可高于细胞的饱和极限。
相应地，本发明还提供了用于生产含有PUFA的生物质的方法，其特征在于，通过在发酵培养基中培养破囊壶菌科的细胞而生产生物质，在所述发酵培养基中硫酸盐的含量被调节为使得至少在产油期的50％的时间段期间，优选至少在产油期的75％或85％的时间段期间，特别优选至少在产油期的90％或95％的时间段期间，并且尤其是在完整的产油期期间，培养基中的硫酸盐浓度一直为0.005至5g硫酸盐每千克无脂质生物质，优选0.01至4g，并且特别优选0.01至3g、2g或1g硫酸盐每千克无脂质生物质，并且尤其是0.01至0.05g硫酸盐每千克无脂质生物质。
相应地，本发明还提供了用于生产含有PUFA的生物质的方法，其特征在于，通过在发酵培养基中培养破囊壶菌科的细胞而生产生物质，在所述发酵培养基中硫酸盐的含量被调节为使得至少在产油期剩余时间段的50％期间，优选至少在产油期剩余时间段的75％或85％期间，特别优选至少在产油期剩余时间段的90％或95％期间，并且尤其是在完整的产油期期间，培养基中的硫酸盐浓度一直为0.005至5g硫酸盐每千克无脂质生物质，优选0.01至4g，并且特别优选0.01至3g、2g或1g硫酸盐每千克无脂质生物质，并且尤其是0.01至0.05g硫酸盐每千克无脂质生物质。
本发明进一步提供了可通过根据本发明的方法获得的生物质，优选包含破囊壶菌科的细胞的生物质。
在根据本发明优选的实施方案中，获得了具有12至20g硫酸盐每千克生物质，优选12至16g硫酸盐每千克生物质的硫酸盐含量的生物质。
因此，本发明特别地还进一步提供了含有PUFA的生物质，其具有12至20g硫酸盐每千克生物质、优选12至18g硫酸盐每千克生物质、并且特别是12至16g硫酸盐每千克生物质的硫酸盐含量，生物质优选包含破囊壶菌科的细胞。
根据本发明，“硫酸盐含量”应理解为意味着硫酸盐的总含量，即相对于生物质游离的和结合的(特别是有机结合的)硫酸盐的含量。可假设生物质中存在的大部分硫酸盐作为外多糖(Exopolysacchariden)(其参与微生物细胞壁的形成)的组成存在。
根据本发明，硫酸盐含量优选地通过确认获得的生物质的硫含量来测定，因为生物质中存在的大部分硫可归因于存在的硫酸盐。由于存在的硫酸盐的量，可忽略可归因于其它来源的硫。因此，可容易地从确认的硫的量确认存在的硫酸盐的量。
就此而言，优选地依照DIN EN ISO 11885通过元素分析来测定生物质的硫含量。为分析生物质的硫含量，在分析前将样品的适当等分试样破坏(优选使用硝酸和过氧化氢在240℃在压力下)，以确保存在的硫容易得到。
根据本发明，“生物质”、“干生物质”、“产PUFA的细胞的生物质”或“产PUFA的细胞的干生物质”通常应理解为意味着可测定的干生物质。
在此背景下，优选如下测定样品中存在的干生物质的量：收集均质样品并离心以分离出液体组分。此后，用水洗涤通过离心获得的生物质以溶解盐和任何另外可溶组分，然后再次离心。最后将由此获得的干生物质在干燥柜中干燥过夜。在此背景下，样品中存在的干生物质的百分比由干燥后测定的干生物质的质量与所研究的样品的初始质量之间的商得出。由此确认的干生物质还额外包含由生物质形成的油。
因此，根据本发明，“无脂质生物质”、“无脂质干生物质”、“产PUFA的细胞的无脂质生物质”或“产PUFA的细胞的无脂质干生物质”应理解为意味着之前确认的干生物质减去干生物质中存在的脂肪比例。
干生物质中存在的脂肪比例优选地通过在甲醇/氯仿溶液中摄取干生物质并随后对由此获得的样品进行超声处理来测定。随后将如此获得的样品用氢氧化钾皂化并使用盐酸酸化。此后，使用BF3(甲醇中的30％三氟化硼)将游离脂肪酸甲基化，并通过具有温度梯度的分配色谱法进行分离。然后通过火焰离子化检测(FID)进行检测。根据本发明，然后通过从先前测定的干生物质含量中减去如此测定的脂肪含量来测定生物质含量。
根据本发明，使用术语无脂质的干生物质，因为细胞的硫酸盐饱和极限不依赖于细胞的脂质含量，但细胞的脂质含量在产油期的过程中大大增加，意味着必须通过考虑无脂质干生物质的总含量而非干生物质的总含量来确认硫酸盐的添加量。由于最大程度地抑制细胞繁殖，在起动产油期后无脂质干生物质的含量实际上保持稳定，因此通常不必在起动产油期后再次测定无脂质干生物质的含量。
根据本发明，可以以不同方式调节培养基中期望的硫酸盐浓度。
根据本发明，至关重要的是必须一直在发酵的最后阶段，优选在产油期的末尾进行硫酸盐的计量添加(所谓的分批进料方法)。硫酸盐计量添加的开始由发酵开始时起始培养基中是否存在以及存在多少硫酸盐测定。原则上可根据期望选择起始培养基中硫酸盐的量，意味着计量添加硫酸盐的要求可能会出现在发酵过程中的不同时间。
由于要求必须在发酵的最后阶段发酵培养基中存在硫酸盐，但此处的硫酸盐浓度必须低于细胞的饱和极限，因此出现起始培养基中的硫酸盐浓度是上限(其必须相应地进行观察并易于计算)。在优选的实施方案中，选择起始培养基中的硫酸盐量，使得至少在细胞的生长期的前30％的时间段期间，优选至少在细胞的生长期的前40％、50％或60％，并且特别是前70％、80％或90％的时间段期间，硫酸盐浓度高于细胞的饱和浓度。在此背景下，在特定阶段期间，硫酸盐浓度优选为至少5g硫酸盐每千克无脂质生物质。
硫酸盐的计量添加必须不迟于硫酸盐浓度下降至零前开始。这是通过连续测定培养基中硫酸盐浓度来确保的。优选地，仅当培养基中的硫酸盐浓度降至低于2g硫酸盐每千克生物质，特别是降至低于1g硫酸盐每千克生物质时，并且特别优选仅当培养基中硫酸盐浓度已降至低于0.5g硫酸盐每千克无脂质生物质时才进行硫酸盐的计量添加，并且根据本发明，这仅在刚好转变为产油期之前进行，以优化产油。因此，在根据本发明特别优选的一个实施方案中，培养基中的硫酸盐浓度仅在产油期刚好开始前，优选产油期开始前至多3小时，特别是至多2小时，并且尤其是至多1小时前降至低于2g、特别是低于1g、并且特别优选低于0.5g硫酸盐每千克无脂质生物质。
代替最初在起始培养基中提供(vorzulegen)相对大量的硫酸盐，可替代地，也可在细胞的生长期已待实现硫酸盐的计量添加。在此背景下，相应地在生长期进行硫酸盐的计量添加，至少在生长期的第一阶段期间以优选至少5g硫酸盐每千克生物质添加，使得硫酸盐的量一直高于细胞的饱和浓度。在随后的产油期，相应地减少了硫酸盐的计量添加，结果在产油期或刚好进入产油期前的硫酸盐浓度降至低于细胞的饱和浓度，优选低于5g硫酸盐每千克无脂质生物质，特别优选低于3g，2g或1g硫酸盐每千克无脂质生物质，并且尤其是低于0.5g硫酸盐每千克无脂质生物质。
在根据本发明的进一步的实施方案中，硫酸盐为指定量，结果在整个发酵过程中或至少在整个发酵过程的大部分时间段期间的硫酸盐浓度一直低于细胞的饱和浓度，优选低于5g硫酸盐每千克无脂质生物质，特别是低于4g、3g、2或1g硫酸盐每千克无脂质生物质。
由于对于该方法至关重要的是硫酸盐浓度不降至零，有可能通过对计量加入的硫酸盐的量进行适当调节来确保避免硫酸盐浓度降至零(尤其是在发酵过程中发生所产生的生物质的量超过最初计算的值时)。
在根据本发明优选的一个实施方案中，在产油期的大部分时间段期间，优选至少在产油期的50％、60％或70％时间段期间，并且特别优选至少在产油期的最后50％、60％或70％时间段期间，以低量连续将硫酸盐计量加入发酵培养基中，优选以5至100mg、优选10至50mg每千克发酵培养的比率。
根据本发明，所使用的硫酸盐优选为硫酸钠、硫酸铵或硫酸镁以及它们的混合物。根据本发明，硫酸盐的进料也可替代地或额外地通过使用被硫酸盐污染或补充硫酸盐的工业原料来进行。
根据本发明，进一步令人惊讶地发现，低硫酸盐浓度也可与低氯化物浓度组合，意味着可使用非腐蚀性发酵培养基生产生物质。
因此，优选地，根据本发明的方法进一步特征在于：根据本发明使用的发酵培养基在整个发酵期间具有小于1g/l，特别是小于500mg/l，并且优选小于250mg/l的氯化物浓度。
本发明的生物质优选具有不超过2g每千克生物质，特别是0.5至1.8g，并且特别优选0.5至1.5g每千克生物质的氯化物含量。
根据本发明，“氯化物含量”应理解为意味着可测定的氯的量。例如，可根据DIN ENISO 11885通过元素分析测定存在的氯的量。氯在生物质中以被称为“氯化物”的盐的形式存在。当本申请提及“氯化物”或“氯离子”时，一直意味着仅氯离子或可检测的氯的量，而不是氯盐(其除氯离子外还一直包括阳离子抗衡离子)的量。
产PUFA的细胞优选是已天然产PUFA的细胞；然而，它们也可以是通过适当的基因技术方法能够产PUFA的细胞。在此背景下，生产可以是自养的、兼养的或异养的。
相应地，根据本发明的生物质包括此类细胞，并且优选地基本上由此类细胞组成。
优选地，细胞是异养地产PUFA的细胞。根据本发明，细胞优选采取藻类、真菌(特别是酵母)或原生生物的形式。特别优选地，细胞是微生物，特别是微生物藻类或真菌。
产油酵母的合适细胞特别是子囊菌酵母属(Yarrowia)、念珠菌属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、毛孢子菌属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)的菌株。
细胞优选是分类单元网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)(Labyrinthulea,Netzschleimpilze,Schleimnetze)的那些，特别是破囊壶菌科的那些。破囊壶菌科包括以下属：Althornia、Aplanochytrium、Elnia、Japonochytrium、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、Aurantiochytrium、Oblongichytrium、或Ulkenia。尤其优选以下属的细胞：破囊壶菌属、裂殖壶菌属、Aurantiochytrium或Oblongichytrium，尤其是Aurantiochytrium属的那些细胞。特别优选的菌株是Aurantiochytrium limacinum SR21菌株(IFO32693)。
根据本发明的生物质优选采取发酵培养方法的产物的形式。相应地，生物质不仅可含有待被破坏的细胞，而且可含有发酵培养基的组分。这些组分尤其可采取盐、消泡剂以及未反应的碳源和/或氮源的形式。此生物质中的细胞含量优选为至少70重量％，优选为至少75重量％。任选地，在进行细胞破坏过程前，可通过合适的洗涤步骤将生物质中的细胞含量增加至例如至少80重量％或至少90重量％。然而，获得的生物质也可直接用于细胞破坏过程。
优选地，生物质中的细胞的特征在于以下事实：在每种情况中，它们基于细胞干质量含有至少20重量％，优选至少30重量％，特别是至少40重量％的PUFA。
在优选的实施方案中，多数脂质以甘油三酯的形式存在，其中细胞中存在的脂质的优选至少50重量％，特别是至少75重量％，并且在尤其优选的实施方案中至少90重量％以甘油三酯的形式存在。
优选地，细胞中存在的脂肪酸的至少10重量％，特别是至少20重量％，尤其优选20至60重量％，特别是20至40重量％是PUFA。
根据本发明，多不饱和脂肪酸(PUFA)理解为意味着具有至少两个C-C双键的脂肪酸。根据本发明，在PUFA中优选高度不饱和脂肪酸(HUFA)。根据本发明，HUFA理解为意味着具有至少四个C-C双键的脂肪酸。
PUFA可以以游离形式或结合形式存在于细胞中。以结合形式存在的实例是PUFA的磷脂和酯，特别是单酰基甘油酯、二酰基甘油酯和三酰基甘油酯。在优选的实施方案中，多数PUFA以甘油三酯的形式存在，其中细胞中存在的PUFA的优选至少50重量％，特别是至少75重量％，并且在尤其优选的实施方案中至少90重量％以甘油三酯的形式存在。
优选的PUFA是ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸，其中ω-3脂肪酸是尤其优选的。在此背景下，优选的ω-3脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA,20:5ω-3)，特别是(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳5,8,11,14,17-五烯酸，以及二十二碳六烯酸(DHA,22:6ω-3)，特别是(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸，其中二十二碳六烯酸是尤其优选的。
在现有技术中已详细描述了产生含PUFA的细胞(尤其是破囊壶菌目)的方法(参见例如WO91/07498、WO94/08467、WO97/37032、WO97/36996、WO01/54510)。通常通过在碳源和氮源存在下在发酵罐中培养细胞来进行生产。在此背景下，可实现大于100克每升的生物质密度和大于0.5克脂质每小时每升的生产率。该方法优选以所谓的分批进料方法进行，即在发酵期间逐步加进碳源以及可能的氮源和磷酸盐源。一旦达到期望的生物质，可通过多种措施(例如通过限制氮源、磷酸盐源或氧含量或它们的组合)诱导脂质产生。
合适的碳源是醇和非醇碳源两者。醇碳源的实例是甲醇、乙醇和异丙醇。非醇碳源的实例是果糖、葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉和玉米糖浆，以及有机酸如乙酸、丙酸和中链和长链脂肪酸以及它们的盐。根据本发明优选的方法的特征在于在完全发酵过程中将至少一种碳源连续计量加入培养基。
合适的氮源是无机氮源和有机氮源两者。无机氮源的实例是硝酸盐和铵盐，特别是硫酸铵和氢氧化铵。有机氮源的实例是氨基酸，特别是谷氨酸和尿素。
根据本发明，产油期的起动优选如WO 01/54510中所述通过限制至少一种限制性营养组分，优选通过限制至少一种氮源来进行。
发酵培养基中的氯化物含量优选在整个发酵期间，至少在产油期期间一直低于2g/l，特别是低于1g/l，优选低于500mg/l，并且特别优选低于250mg/l。
除使用的硫酸盐和任何氯化物外，在发酵期间还可任选地使用其它盐，尤其是选自碳酸钠、碳酸氢钠、苏打灰或无机磷化合物的那些盐。如果使用其它盐，这些盐各自优选以小于12g/l，特别是小于8g/l，并且特别优选小于5g/l的量使用。在主发酵开始时，发酵培养基中的总盐含量优选为5至30g/l，特别是10至20g/l。
此外，还可添加有机磷化合物和/或已知的促进生长的物质，例如酵母提取物或玉米浆，以对发酵具有积极影响。
优选在pH为3至11，特别是4至10，并且优选在温度为至少20℃，特别是20℃至40℃，并且特别优选至少30℃发酵细胞。典型的发酵过程大约占用100小时。
根据本发明，优选将细胞发酵至生物质密度为至少50g/l、60g/l或70g/l，特别是50至250g/l或60至220g/l，优选至少80g/l或90g/l，特别是80至200g/l，特别优选至少100g/l，并且特别是100至180g/l。在此背景下，数据基于相对于发酵完成后发酵液总体积的干生物质含量。干生物质的含量是通过从发酵液中过滤生物质，随后用水洗涤，然后完全干燥(例如在微波炉中)并且最后确认干重来测定的。
在根据本发明优选的一个实施方案中，刚好在产油期开始前，优选在生物质密度已达到至少50g、特别优选至少80g、100g、120g或140g每升发酵培养基后，硫酸盐浓度降低至低于5g硫酸盐每千克无脂质生物质，优选低于4g、3g、2g或1g硫酸盐每千克无脂质生物质，并且特别是低于0.5g、0.1或0.05g硫酸盐每千克无脂质生物质，并且优选在剩余的发酵中还保持低于该浓度。
在收获细胞后或任选甚至在收获细胞前不久，优选将细胞进行巴氏灭菌以杀死细胞并使可能促进脂质降解的酶失活。
发酵完成后，可将获得的发酵液直接或任选地在事先浓缩后进行油分离方法，以提取存在的油。此类油分离方法例如在WO 01/53512和WO 2011/153246中描述。
可替代地，发酵完成后也可收获含有PUFA的生物质。为此，优选也首先浓缩发酵液。
根据本发明，优选通过离心、过滤、倾析和/或溶剂蒸发来浓缩发酵液，以便首先从生物质中分离出大部分发酵培养基。优选使用鼓式干燥机、隧道式干燥机通过喷雾干燥或真空蒸发来实现溶剂蒸发。特别地，还可使用旋转蒸发器、薄膜蒸发器或降膜蒸发器来实现溶剂蒸发。溶剂蒸发的合适替代方式是例如逆向渗透以浓缩发酵液。
为获得生物质，优选将如此获得的浓缩发酵液优选通过流化床制粒进一步干燥。优选地，通过随后的干燥方法，生物质的水分含量减少至低于15重量％，特别是低于10重量％，并且特别优选低于5重量％。
在根据本发明特别优选的一个实施方案中，根据本发明，在例如如WO 2015/052048中所述的流化床制粒方法或喷嘴喷雾干燥方法中干燥生物质。
在干燥方法中，可任选地将二氧化硅作为防结块剂添加到生物质中，从而可将生物质转化为易于管理的状态。为此目的，优选将包含生物质的发酵液以及二氧化硅喷洒至特定的干燥区中。可替代地，优选仅在干燥方法后将生物质与二氧化硅混合。在此方面，还特别参考专利申请WO 2015/052048。
在优选的实施方案中，干燥方法后，根据本发明待使用的生物质具有0.2至10重量％，特别是0.5至5重量％，尤其是0.5至2重量％的二氧化硅(特别是亲水性或疏水性二氧化硅)浓度。
优选通过干燥方法获得自由流动的细粒度的或粗粒度的产物，优选颗粒。具有期望的粒径的产物可任选地从通过筛分或粉尘分离获得的颗粒获得。
如果获得了自由流动的细粒度的粉末，可任选地将其转变为粗粒度的、易于自由流动的并且基本上无粉尘的产物，可通过适当的压实或制粒方法存储产物。
通常在食品加工或饲料加工中用作粘合剂、胶凝剂或增稠剂的常规有机或无机助剂或载体如淀粉、明胶、纤维素衍生物或类似物质可任选地用于随后的制粒或压实方法中。
根据本发明，“自由流动”应理解为意味着可不受阻碍地从具有不同出口开口尺寸的一系列玻璃流出容器中流出，至少从具有5毫米开口的容器中流出的粉末(Klein：Seifen，
根据本发明，“细粒度”应理解为意味着具有主要级分(＞50％)的直径20至100微米的粒径的粉末。
根据本发明，“粗粒度”应理解为意味着具有主要级分(＞50％)的直径100至2500微米的粒径的粉末。
根据本发明，“无粉尘”应理解为意味着仅含有低级分(＜10％，优选＜5％)的低于100微米的粒径的粉末。
根据本发明优选通过激光衍射光谱法测定粒径。在R.H.Müller和R.Schuhmann，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart(1996)的教科书“
通过根据本发明的干燥方法获得的产物优选具有至少80重量％，特别是至少90重量％，特别优选至少95重量％的具有100至3500微米，优选100至3000微米，尤其是100至2500微米的粒径的颗粒的级分。
在此情况下，根据本发明的流化床制粒方法获得的产物优选具有至少80重量％，特别是至少90重量％，特别优选至少95重量％的具有200至3500微米，优选300至3000微米，尤其是500至2500微米的粒径的颗粒的级分。
相比之下，根据本发明的喷雾干燥方法获得的产物优选具有至少80重量％，特别是至少90重量％，特别优选至少95重量％的具有100至500微米，优选100至400微米，尤其是100至300微米的粒径的颗粒的级分。
根据本发明的喷雾干燥方法和随后的制粒方法获得的产物优选具有至少80重量％，特别是至少90重量％，特别优选至少95重量％的具有100至1000微米的粒径的颗粒的级分。
粉尘的级分(即具有小于100微米的粒径的颗粒)优选为至多10重量％，特别是至多8重量％，特别优选至多5重量％，尤其是至多3重量％。
根据本发明的产物的堆积密度为优选400至800kg/m
因此，本发明还进一步提供了包含根据本发明的生物质以及另外的饲料成分的饲料。
就此而言，另外的饲料成分优选选自含蛋白质、含碳水化合物、含核酸和脂溶性组分，并且如果合适，还选自其它含脂肪组分，且此外还选自其它添加剂如矿物质、维生素、色素和氨基酸。此外，除营养物外，还可存在结构化剂，例如以改善饲料的质地或外观。此外，也可使用例如粘合剂以影响饲料的稠度。优选采用的既构成营养物又构成结构化剂的组分是淀粉。
根据本发明，根据本发明的饲料或用于生产根据本发明的饲料的组合物优选特征在于以下事实：其含有1至25％重量％，优选2至20重量％，特别是3至15重量％，尤其是4至12重量％的量的根据本发明的生物质。
所述饲料或用于生产饲料的组合物优选额外具有以下特性的至少一种，优选全部：
a)33至67重量％、优选39至61重量％、特别是44至55重量％的总蛋白质含量；
b)5至25重量％、优选8至22重量％、特别是10至20重量％、尤其是12至18重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选6至17重量％、尤其优选8至14重量％的总淀粉含量；
d)2至13重量％、优选3至11重量％、特别是4至10重量％、尤其是5.5至9重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
e)1至7重量％、优选1.5至5.5重量％、特别是2至5重量％、尤其是2.5至4.5重量％的ω-3脂肪酸含量；
f)0.5至3重量％、优选0.8至2.8重量％、特别是1至2.8重量％、尤其是1.3至2.4重量％、特别是1.3至2.2重量％的DHA含量。
因此，本发明优选还提供饲料或适于生产饲料的组合物，其具有以下特性的至少一种，优选全部：
a)33至67重量％、优选39至61重量％、特别是44至55重量％的总蛋白质含量；
b)5至25重量％、优选8至22重量％、特别是10至20重量％、尤其是12至18重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选6至17重量％、尤其优选8至14重量％的总淀粉含量；
d)2至13重量％、优选3至11重量％、特别是4至10重量％、尤其是5.5至9重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
e)1至7重量％、优选1.5至5.5重量％、特别是2至5重量％、尤其是2.5至4.5重量％的ω-3脂肪酸含量；
f)0.5至3重量％、优选0.8至2.8重量％、特别是1至2.8重量％、尤其是1.3至2.4重量％、特别是1.3至2.2重量％的DHA含量。
因此，本发明优选还提供饲料或适于生产饲料的组合物，其具有以下特性的至少一种，优选全部：
a)33至67重量％、优选39至61重量％、特别是44至55重量％的总蛋白质含量；
b)5至25重量％、优选8至22重量％、特别是10至20重量％、尤其是12至18重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选6至17重量％、尤其优选8至14重量％的总淀粉含量；
d)2至24重量％、优选4至22重量％、特别是9至20重量％、尤其是11至18重量％的根据本发明的生物质、特别是根据本发明的网粘菌纲生物质、优选根据本发明的破囊壶菌科生物质的生物质的含量；
e)2至13重量％、优选3至11重量％、特别是4至10重量％、尤其是5.5至9重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
f)1至7重量％、优选1.5至5.5重量％、特别是2至5重量％、尤其是2.5至4.5重量％的ω-3脂肪酸含量；
g)0.5至3重量％、优选0.8至2.8重量％、特别是1至2.8重量％、尤其是1.3至2.4重量％、特别是1.3至2.2重量％的DHA含量。
因此，本发明优选还提供饲料或适于生产饲料的组合物，其具有以下特性的至少一种，优选全部：
a)33至67重量％、优选39至61重量％、特别是40至50重量％的总蛋白质含量；
b)5至25重量％、优选8至22重量％、特别是10至20重量％、尤其是12至18重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选6至17重量％、尤其优选8至14重量％的总淀粉含量；
d)1至25重量％、优选2至20重量％、特别是3至15重量％、尤其是4至12重量％的根据本发明的Aurantiochytrium或裂殖壶菌属生物质、优选根据本发明的Aurantiochytriumlimacinum生物质、尤其是根据本发明的Aurantiochytrium limacinum SR21生物质的含量；
e)2至13重量％、优选3至11重量％、特别是4至10重量％、尤其是5.5至9重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
f)1至7重量％、优选1.5至5.5重量％、特别是2至5重量％、尤其是2.5至4.5重量％的ω-3脂肪酸含量；
g)0.5至3重量％、优选0.8至2.8重量％、特别是1至2.8重量％、尤其是1.3至2.4重量％、特别是1.3至2.2重量％的DHA含量。
通过挤出上述组合物，可获得挤出物。本发明优选提供所述挤出物。就此而言，饲料的挤出优选以12至28Wh/kg，特别是14至26Wh/kg，尤其优选16至24Wh/kg，尤其是18至22Wh/kg的能量输入进行。
就此而言，在挤出方法中优选采用螺杆挤出机或双螺杆挤出机。挤出方法优选在80至220℃，特别是80至130℃、尤其是95至110℃的温度，10至40bar的压力以及100至1000rpm，特别是300至700rpm的杆旋转速度进行。起动的混合物的停留时间为优选5至30秒、特别是10至20秒。
挤出方法可任选地包括压实步骤和/或压缩步骤。
优选在进行挤出方法前将各组分彼此密切混合。这优选在配备有叶片的鼓中进行。在优选的实施方案中，此混合步骤包括注入蒸汽，特别是以便导致优选存在的淀粉膨胀。就此而言，蒸汽的注入优选在1至5bar的压力、特别优选在2至4bar的压力进行。
在与藻类生物质混合前，如果需要，优选将其它饲料成分粉碎，以便确保在混合步骤中获得均匀混合物。其它饲料成分的粉碎可例如使用锤式粉碎机进行。
产出的挤出物优选具有1至14mm，优选2至12mm，特别是2至6mm的直径，并且优选还具有1至14mm，优选为2至12mm，特别是2至6mm的长度。在挤出期间，使用切割工具设定挤出物的长度。优选选择挤出物的长度使得其大致对应于挤出物的直径。挤出物的直径通过选择筛直径来限定。
在根据本发明优选的一个实施方案中，在挤出方法后用油加载获得的挤出物。为此，优选首先将挤出物干燥至水分含量不多于5重量％。根据本发明，可通过例如将挤出物置于油中或用油喷洒挤出物而用油加载挤出产物；然而，根据本发明，优选真空镀膜。
以此方式，获得了饲料，其以优选1至25重量％，特别是2至20重量％，尤其优选3至15重量％，尤其是4至12重量％的量含有根据本发明的生物质。
相应地，所述饲料优选额外具有以下特性的至少一种，优选全部：
a)30至60重量％、优选35至55重量％、特别是40至50重量％的总蛋白质含量；
b)15至35重量％、优选18至32重量％、特别是20至30重量％、尤其是22至28重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选5至15重量％、尤其优选7至13重量％的总淀粉含量；
d)2至12重量％、优选3至10重量％、特别是4至9重量％、尤其是5至8重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
e)1至6重量％、优选1.5至5重量％、特别是2至4.5重量％、尤其是2.5至4重量％的ω-3脂肪酸含量；
f)0.5至3重量％、优选0.8至2.5重量％、特别是1至2.5重量％、尤其是1.2至2.2重量％、特别是1.2至2.0重量％的DHA含量。
因此，本发明优选还提供具有以下特性的至少一种，优选全部特性的饲料，特别是挤出物：
a)30至60重量％、优选35至55重量％、特别是40至50重量％的总蛋白质含量；
b)15至35重量％、优选18至32重量％、特别是20至30重量％、尤其是22至28重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选5至15重量％、尤其优选7至13重量％的总淀粉含量；
d)2至12重量％、优选3至10重量％、特别是4至9重量％、尤其是5至8重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
e)1至6重量％、优选1.5至5重量％、特别是2至4.5重量％、尤其是2.5至4重量％的ω-3脂肪酸含量；
f)0.5至3重量％、优选0.8至2.5重量％、特别是1至2.5重量％、尤其是1.2至2.2重量％、特别是1.2至2.0重量％的DHA含量。
因此，本发明优选还提供具有以下特性的至少一种，优选全部特性的饲料，特别是挤出物：
a)30至60重量％、优选35至55重量％、特别是40至50重量％的总蛋白质含量；
b)15至35重量％、优选18至32重量％、特别是20至30重量％、尤其是22至28重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选5至15重量％、尤其优选7至13重量％的总淀粉含量；
d)1至25重量％、优选2至20重量％、特别是3至15重量％、尤其是4至12重量％的根据本发明的生物质、特别是根据本发明的网粘菌纲生物质、优选根据本发明的破囊壶菌科生物质的含量；
e)2至12重量％、优选3至10重量％、特别是4至9重量％、尤其是5至8重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
f)1至6重量％、优选1.5至5重量％、特别是2至4.5重量％、尤其是2.5至4重量％的ω-3脂肪酸含量；
g)0.5至3重量％、优选0.8至2.5重量％、特别是1至2.5重量％、尤其是1.2至2.2重量％、特别是1.2至2.0重量％的DHA含量。
因此，本发明优选还提供具有以下特性的至少一种，优选全部特性的饲料，特别是挤出物：
a)30至60重量％，优选35至55重量％，特别是40至50重量％的总蛋白质含量；
b)15至35重量％，优选18至32重量％，特别是20至30重量％，尤其是22至28重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％，特别是至多20重量％，优选5至15重量％，尤其优选7至13重量％的总淀粉含量；
d)1至25重量％，优选2至20重量％，特别是3至15重量％，尤其是4至12重量％的根据本发明的Aurantiochytrium或裂殖壶菌属生物质、优选根据本发明的Aurantiochytriumlimacinum生物质、尤其是根据本发明的Aurantiochytrium limacinum SR21生物质的含量；
e)2至12重量％，优选3至10重量％，特别是4至9重量％，尤其是5至8重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
f)1至6重量％，优选1.5至5重量％，特别是2至4.5重量％，尤其是2.5至4重量％的ω-3脂肪酸含量；
g)0.5至3重量％，优选0.8至2.5重量％，特别是1至2.5重量％，尤其是1.2至2.2重量％，特别是1.2至2.0重量％的DHA含量。
根据本发明，除根据本发明待使用的生物质外，使用的含脂肪组分可为动物和植物两者来源的脂肪，特别是油。根据本发明，合适的含脂肪组分特别是植物油，例如大豆油、菜籽油、葵花籽油、亚麻籽油或棕榈油以及它们的混合物。此外，鱼油也可任选地以低的量用作含脂肪组分。
根据本发明，使用的含蛋白质组分可以是例如大豆蛋白、豌豆蛋白、小麦面筋或玉米面筋以及它们的混合物。
下列实例可用作额外含有脂肪的含蛋白质组分：鱼粉、磷虾粉、蚌粉、鱿鱼粉或虾壳。这些在下文中被归入术语“海产粉”。在优选的实施方案中，本发明的饲料以3至18重量％，特别是5至15重量％，尤其是7至13重量％的量包含海产粉，优选鱼粉。
使用的含碳水化合物组分可以是例如小麦粉、向日葵粉或大豆粉以及它们的混合物。
当在动物养殖中使用根据本发明的饲料，特别是根据本发明的油包被的挤出物时，越来越明显的这尤其促进了动物的生长并改善了动物的应激水平。
本发明还进一步提供了用于养殖动物的方法，其特征在于，对其施用根据本发明的饲料。
对此而言，本发明特别提供了增加动物生长的方法，其特征在于，对其施用根据本发明的饲料。
本发明特别类似地进一步提供了用于增加动物肌肉组织中的ω-3脂肪酸，特别是DHA的分数的方法，其特征在于，对其施用根据本发明的饲料。
优选地，在根据本发明的方法中，至少每两天一次，优选至少每天一次施用饲料。
本发明进一步类似地提供了根据本发明的饲料在增加动物生长中的用途。
本发明同样进一步提供了根据本发明的饲料在增加动物肌肉组织中的ω-3脂肪酸分数中的用途。
本发明同样进一步提供了根据本发明的饲料在改善动物的身体状况，特别是在改善动物的应激水平中的用途。
本发明同样进一步提供了根据本发明的饲料在允许动物的应激减少的养殖中的用途。
用本发明的饲料喂养的养殖动物优选是家禽、猪或牛。
然而，养殖的动物尤其优选是海洋动物，特别优选有鳍鱼或甲壳类。这些特别包括鲤鱼、罗非鱼、鲶鱼、金枪鱼、鲑鱼、鳟鱼、澳洲肺鱼、鳊鱼、金鲈、鳕鱼、虾、龙虾、蟹、对虾和小龙虾。养殖的动物尤其优选鲑鱼。在此背景下，鲑鱼的优选类型是大西洋鲑、红鲑、masusalmon、王鲑、大马哈鱼、银鲑、多瑙河鲑、太平洋鲑和粉红鲑。
养殖的动物特别地也可以是鱼，其随后被加工为鱼粉或鱼油。就此而言，鱼优选是鲱鱼、绿鳕、油鲱、凤尾鱼、毛鳞鱼或鳕鱼。如此获得的鱼粉或鱼油又可用于水产养殖，以养殖食用鱼或甲壳类。
然而，养殖的动物也可以是在水产养殖中用作饲料的小型生物。这些小型生物可采取例如线虫类、甲壳类或轮虫类的形式。
海洋动物的养殖可在池塘、水箱、盆或在海洋或湖泊的隔离区域中进行，特别是在此情况下在笼或网箱中进行。养殖可用于养殖成品食用鱼，但也可用于养殖随后放生以补充野生鱼群的鱼苗。
在鲑鱼养殖中，鱼优选首先在淡水水箱或人工水道中生长为二龄鲑，然后在漂浮在海中并优选锚定在海湾或峡湾中的笼或网箱中继续生长。
相应地，根据本发明的饲料优选是用于上述动物的养殖的饲料。
示例性实施方案
实施例1通过在具有高硫酸盐含量的培养基中发酵Aurantiochytrium limacinumSR21并随后干燥生物质来生产生物质
使用具有2升的发酵罐容积的钢发酵罐在进料过程中将细胞培养约70小时，其中总起始质量为约700g以及获得的最终总质量为约1.5kg。在过程期间，计量加入葡萄糖溶液(570g/kg葡萄糖)(“分批进料过程”)。
起始培养基的组成如下：
培养基1：20g/kg葡萄糖；4g/kg酵母提取物；2g/kg硫酸铵；12g/kg或16g/kg硫酸钠；2.46g/kg硫酸镁(七水合物)；0.45g/kg氯化钾；4.5g/kg磷酸二氢钾；0.1g/kg硫胺素(HCl)；5g/kg微量元素溶液。
微量元素溶液的组成如下：35g/kg盐酸(37％)；1.86g/kg氯化锰(四水合物)；1.82g/kg硫酸锌(七水合物)；0.818g/kg EDTA钠；0.29g/kg硼酸；0.24g/kg钼酸钠(二水合物)；4.58g/kg氯化钙(二水合物)；17.33g/kg硫酸亚铁(七水合物)；0.15g/kg氯化铜(二水合物)。
培养在以下条件下进行：培养温度28℃；曝气率0.5vvm，搅拌器速度600至1950rpm，使用氨水(25％v/v)将生长期的pH控制为4.5。通过限制磷酸盐和氮气起动产油期之前，进行发酵至生物质密度达到80g/l。由于起始培养基中直至发酵结束(即包括直至产油期结束)的高硫酸盐含量，硫酸盐浓度一直高于细胞的饱和极限，为约5g每千克干生物质。以下将获得的生物质称为“生物质1”(在起始培养基中12g/kg硫酸钠)和“生物质2”(在起始介质中16g/kg硫酸钠)。
实施例2：通过在具有低硫酸盐含量的培养基中发酵Aurantiochytriumlimacinum SR21并随后干燥生物质来生产生物质
使用具有2升的发酵罐容积的钢发酵罐在进料过程中将细胞培养约70小时，其中总起始质量为约712g以及获得的最终总质量为约1.5kg。在过程期间，计量加入葡萄糖溶液(570g/kg葡萄糖)(“分批进料过程”)。
起始培养基的组成如下：
培养基1：20g/kg葡萄糖；4g/kg酵母提取物；0g/kg硫酸铵；2.46g/kg硫酸镁(七水合物)；0.45g/kg氯化钾；4.5g/kg磷酸二氢钾；0.1g/kg硫胺素(HCl)；5g/kg微量元素溶液。
微量元素溶液的组成如下：35g/kg盐酸(37％)；1.86g/kg氯化锰(四水合物)；1.82g/kg硫酸锌(七水合物)；0.818g/kg EDTA钠；0.29g/kg硼酸；0.24g/kg钼酸钠(二水合物)；4.58g/kg氯化钙(二水合物)；17.33g/kg硫酸亚铁(七水合物)；0.15g/kg氯化铜(二水合物)。
培养在以下条件下进行：培养温度28℃；曝气率0.5vvm，搅拌器速度600至1950rpm，使用氨水(25％v/v)将生长期的pH控制为4.5。通过限制磷酸盐和氮气起动产油期之前，进行发酵至生物质密度达到80g/l。起动产油期后，硫酸盐浓度已降至低于0.05g每千克发酵培养基的检测极限，并且硫酸盐浓度在整个产油期期间相应地也低于检测极限。并且由于未计量添加硫酸盐，在产油期的过程中，硫酸盐浓度降至零。以下将获得的生物质称为“生物质3”。
实施例3：通过在具有低硫酸盐含量的培养基中发酵Aurantiochytriumlimacinum SR21来生产生物质，同时在发酵期间添加硫酸盐并随后干燥生物质
使用具有2升的发酵罐容积的钢发酵罐在进料过程中将细胞培养约70小时，其中总起始质量为约712g以及获得的最终总质量为约1.5kg。在过程期间，计量加入葡萄糖溶液(570g/kg葡萄糖)(“分批进料过程”)，同时以3g/h的恒定进料速率分6个不同批次计量加入不同浓度的硫酸钠溶液(7.4、14.8或22.2g/kg硫酸钠)或不同浓度的硫酸铵溶液(6.8、13.6或20.4g/kg硫酸铵)。选择硫酸盐溶液的进料速率，以使存储阶段中的硫酸盐含量保持低于硫酸盐的检测极限(0.05g/l)。
此外，为排除“稀释效果”，将相同进料速率(3g/h)的水在一批中使用，作为阴性对照。
起始培养基的组成如下：
培养基1：20g/kg葡萄糖；4g/kg酵母提取物；2g/kg硫酸铵；2.46g/kg硫酸镁(七水合物)；0.45g/kg氯化钾；4.5g/kg磷酸二氢钾；0.1g/kg硫胺素(HCl)；5g/kg微量元素溶液。
微量元素溶液的组成如下：35g/kg盐酸(37％)；1.86g/kg氯化锰(四水合物)；1.82g/kg硫酸锌(七水合物)；0.818g/kg EDTA钠；0.29g/kg硼酸；0.24g/kg钼酸钠(二水合物)；4.58g/kg氯化钙(二水合物)；17.33g/kg硫酸亚铁(七水合物)；0.15g/kg氯化铜(二水合物)。
培养在以下条件下进行：培养温度28℃；曝气率0.5vvm，搅拌器速度600至1950rpm，使用氨水(25％v/v)将生长期的pH控制为4.5。通过限制磷酸盐和氮气起动产油期之前，进行发酵直至生物质密度达到50g/l。起动产油期后，硫酸盐浓度已降至低于0.05g每千克发酵培养基的检测极限，并且硫酸盐浓度在整个产油期相应地也低于检测极限。然而，由于硫酸盐的连续计量添加，防止了培养基中的硫酸盐浓度降至零。在下文中，具有硫酸钠进料的生物质被称为“生物质3、4和5”，并且具有硫酸铵进料的生物质被称为“生物质6、7和8”。
实施例4：检查和比较获得的生物质和方法
培养过程后，将发酵液加热至60℃持续20分钟，以防止进一步的细胞活性。
这以后是生物质的两阶段干燥：首先，通过蒸发将发酵液浓缩至干质量为约20重量％。其后，使用Production Minor
表1：比较获得的生物质
生物质1和2是依据实施例1通过在高硫酸盐含量发酵获得的生物质，生物质3是依据实施例2通过在低硫酸盐含量发酵获得的生物质，而生物质4-9是依据实施例3通过在低硫酸盐含量发酵并以低计量速率连续进料硫酸盐获得的。
可以看出，与在无连续的硫酸盐进料的低硫酸盐含量进行的方法(生物质3)或在高硫酸盐含量进行的方法(生物质1和2)相比，产生生物质4-9的发酵方法给予了明显更高的DHA产率，并且还给予了更多的产物和更纯的产物。依据实施例3的方法获得的根据本发明优选的生物质含有的硫酸盐的量为12至16g每千克生物质。
机译： 生产具有增加的多不饱和脂肪酸含量的生物质的方法
机译： 制备生物质的方法，其可以容易地分解并具有增加的多不饱和脂肪酸含量增加
机译： 制备生物质的方法，其可以容易地分解并具有增加的多不饱和脂肪酸含量增加
