一种高效分离人实体瘤相关中性粒细胞的方法

摘要

本发明公开了一种高效分离人实体瘤中性粒细胞的方法，包括利用木瓜蛋白酶介导的肿瘤组织分离制备单细胞悬液与CD66B介导的流式细胞术分析单细胞悬液相结合获取中性粒细胞的步骤。本发明通过建立木瓜蛋白酶介导的组织解离和CD66B介导FACS在GANs分离中组合应用，对脑胶质瘤组织中性粒细胞进行分离，经实验验证，经木瓜蛋白酶介导的胶质瘤组织分离获得的活细胞数平均达到6.3×106cells/g，同时检测到在15min木瓜蛋白酶消化下，97％的CD66B被保留，因此，本发明提供的分离方法可实现高效分离实体瘤中中性粒细胞，为患者来源的肿瘤相关免疫细胞及其在实体瘤进展和复发中的生物学功能研究提供技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种高效分离人实体瘤相关中性粒细胞的方法。

背景技术

免疫细胞在肿瘤进展中发挥着双重作用。在自发性免疫系统中，肿瘤相关基因突变产生多种新抗原，如EGFRvIII，bcr-abl，ERG和LMP2。这些新抗原会被抗原呈递细胞(如树突状细胞，单核细胞和B淋巴细胞等)吸收，通过MHC-II复合物呈递，然后被T细胞抗原受体(TCR)识别，激活T或B淋巴细胞。活化的CD8+T细胞能够产生穿孔素，丝氨酸酯和淋巴毒素，从而杀伤肿瘤细胞。活化的B细胞可产生抗原特异性抗体和IL-2等白细胞介素，调节肿瘤的免疫监视。同时，T，B淋巴细胞分泌的IFN和IL-2可募集和激活天然免疫细胞如NK细胞，NK细胞产生TNF和颗粒酶B直接杀伤肿瘤细胞。这些自发的免疫过程会抑制肿瘤的生长和进展。在肿瘤适应免疫系统中，高进化的癌细胞如肿瘤干细胞可分泌CCL2，IL-6，IL-10，募集多种免疫抑制调节性细胞如调节性T细胞和髓系源性抑制细胞，以抑制细胞毒性CD8+T细胞，B细胞和NK细胞诱导的免疫应答。此外，进化的癌细胞还直接改变了几种先天免疫细胞的命运，如恶性肿瘤细胞分泌IL-4，IL-13，IL-17和TGF，使肿瘤相关的巨噬细胞极化为促肿瘤表型，这些肿瘤相关的免疫细胞不仅诱导肿瘤的免疫逃逸，而且促进肿瘤的生长，血管生成，侵袭和转移，形成恶性表型。这些发现不仅拓展了我们对肿瘤生物学的认识，而且为肿瘤免疫治疗的发展提供了前景。然而，我们目前对免疫细胞分化的认识是建立在小鼠模型上的，免疫细胞在人源性肿瘤组织中的功能作用还有待研究。

作为循环中最丰富的白细胞，中性粒细胞传统上被认为是防御宿主免受微生物入侵和辅助伤口愈合的作用。然而，大量资料表明，中性粒细胞在肿瘤进展中起着关键作用。例如，中性粒细胞胞外陷阱(NET)相关蛋白酶可以切割层粘连蛋白，而蛋白水解重塑的层粘连蛋白激活整合素信号通路，从而诱导休眠癌细胞增殖。此外，NET-DNA可被跨膜受体CCDC25感知，激活ILK-parvin通路，促进肿瘤细胞转移。此外，此外，手术及放疗均能诱导Ly6G+中性粒细胞向肿瘤区域浸润。其中手术招募的中性粒细胞能够导致胶质瘤细胞死亡，从而造成局部坏死，进而导致肿瘤恶化。放疗招募的中性粒细胞则能够通过NOS2-NO-ID4调控胶质瘤细胞逆分化为胶质瘤干细胞。然而，这些关于中性粒细胞功能的发现主要来自小鼠。由于中性粒细胞在体外的寿命较短，患者来源的胶质瘤相关中性粒细胞(GANs)的生理功能尚不明确，而从实体肿瘤中分离中性粒细胞仍是一个难题。

外周血中的中性粒细胞通常通过Ficoll分离，该方法基于密度梯度离心法。但这种方法可能不适合从实体肿瘤中分离中性粒细胞，因为肿瘤组织中的细胞组成比血液中的复杂。流式细胞仪可根据单个荧光结合抗原抗体反应产生的多重荧光信号，分离或监测特定谱系细胞。因此，流式细胞荧光分选技术(FACS)通常应用于通过多种组合表面标记物从全血中分离免疫细胞。在实体瘤中，分离GANs的第一步是组织分离，这一过程会导致细胞表面蛋白(包括细胞谱系特异性标记物)的物理或化学破坏，不利于表面抗原介导的分离。因此，需要探索一种合适的实体瘤分离方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效分离脑胶质瘤相关中性粒细胞的方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过将木瓜蛋白酶介导的组织分离和CD66B介导的流式细胞术的结合，实现患者来源肿瘤中性粒细胞的高效分离。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种高效分离人实体瘤中性粒细胞的方法，包括利用木瓜蛋白酶介导的肿瘤组织分离制备单细胞悬液与CD66B介导的流式细胞术分析单细胞悬液相结合获取中性粒细胞的步骤。

优选的是，木瓜蛋白酶介导的肿瘤组织分离制备单细胞悬液具体包括以下方法步骤：

将脱氧核糖核酸酶和木瓜蛋白酶混合液加入肿瘤中混合，于37℃孵育1-45min，离心收集细胞颗粒；

将所述细胞颗粒重悬于卵粘蛋白抑制剂-白蛋白中，再用碎片去除溶液处理，之后离心，收集沉淀并用PBS/无菌水混合液裂解，获取单细胞悬液。

优选的是，所述脱氧核糖核酸酶和木瓜蛋白酶混合液是脱氧核糖核酸酶和木瓜蛋白酶按体积比1:1-1:20(优选1:10)混合而成；

按肿瘤质量计，所述脱氧核糖核酸酶和木瓜蛋白酶混合液按100-500μL/g(优选300μL/g)的浓度加入肿瘤中。

优选的是，离心条件为：1000rpm离心5min。

优选的是，PBS/无菌水混合液为PBS与无菌水按体积比1:1-1:5混合而成。

优选的是，CD66B介导的流式细胞术分析单细胞悬液包括以下步骤：将所制备的单细胞悬液离心后收集细胞颗粒，并将细胞颗粒重悬于FBS-PBS溶液中，室温下用人BD Fc阻断剂阻断10min，依次洗涤、染色、再洗涤细胞后，用流式细胞仪检测CD66B

优选的是，所述离心条件为：1500rpm离心5min。

优选的是，所述实体瘤包括脑胶质瘤。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开的高效分析人实体瘤相关中性粒细胞的方法，改变常规分离中性粒细胞大多是在小鼠模型或HL-60(人早幼粒细胞急性白血病细胞系)分化中性粒细胞样细胞中进行。而本发明通过建立木瓜蛋白酶介导的组织分离和CD66B引导的FACS在GANs分离中的组合应用，实验验证，木瓜蛋白酶介导的脑胶质瘤组织分离获得的活细胞数平均达到6.3×10

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为苏木精-伊红染色不同级别脑胶质瘤组织评估中性粒细胞在人脑胶质瘤组织中的分布情况；A-D为不同级别脑胶质瘤组织中中性粒细胞的浸润情况；E为不同级别脑胶质瘤组织中中性粒细胞所占百分比；

图2为木瓜蛋白酶消化和物理研磨脑胶质瘤组织分离效果对比；A为物理研磨法处理脑胶质瘤组织示意图；B为木瓜蛋白酶消化处理脑胶质瘤组织示意图；C为物理研磨、胰蛋白酶消化以及木瓜蛋白酶消化脑胶质瘤组织后的活细胞数量分析；D为用木瓜蛋白酶消化处理不同时间后CD66B

图3为筛选适宜GANs的分离的表面标记物；A为通过CD15与CD66B联合标记中性粒细胞的流式检测结果，B为联合CD44和CD66B评估脑胶质瘤组织中的中性粒细胞免疫荧光分析图；C为CD44

图4为不同分离方法的胶质瘤相关中性粒细胞(GANs)的纯化情况分析；A为Ficoll介导的密度梯度离心分离和FACS两种纯化方法示意图；B为血液来源中性粒细胞Ficoll法纯化结果；C为胶质瘤组织来源中性粒细胞Ficoll法纯化结果；D为胶质瘤组织来源中性粒细胞经CD66B介导的FACS分离后的纯化结果分析；E为FACS分选的胶质瘤组织来源的CD66B

图5为脑胶质瘤组织中嗜碱粒细胞的分布情况。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中所用试剂或材料如无特殊说明，均能通过商业渠道获取。

实施例1一种高效脑胶质瘤相关中性粒细胞的方法

1、实验材料

1.1人体组织标本和外周血

组织标本取自病理诊断后手术切除的患者。其中，Ⅱ级胶质瘤标本2例，Ⅲ级胶质瘤标本3例，Ⅳ级胶质瘤标本8例，柔脑膜瘤标本1例(有众多粒细胞浸润)。8例正常脑标本取自颅脑外伤供体。匹配的外周血取自胶质瘤患者的静脉血。本研究通过了天津市肿瘤研究所和医院的伦理委员会同意，并从每个患者处获得书面知情同意。

1.2苏木精-伊红染色

胶质瘤标本经福尔马林固定，石蜡包埋，石蜡块切片。切片经脱蜡，水化后，苏木精染色5min，伊红染色3min，然后依次用乙醇和二甲苯浸泡。最后，组织切片用合成树脂覆盖，在通风柜中干燥。

2、实验方法

2.1胶质瘤组织单细胞悬液制备

对胶质瘤组织进行称重，并将其随机分为两组。用手术刀将胶质瘤标本切成0.5-1mm

同时，以物理研磨组织分离方法作为对比例，具体方法如下：将切块的胶质瘤标本移入1.5mL离心管中，浸泡于1mL PBS中，然后用灭菌陶瓷球匀浆10s，过滤细胞悬浮液以去除组织块(见图2A)；通过物理研磨获得的细胞悬浮液以去除死细胞，并以1000rpm离心5min，再用PBS/无菌蒸馏水混合液(V/V＝1:3)裂解红细胞。

2.2外周血白细胞悬液的制备

外周血混合血沉液(TBD,#HES-TBD-550)并在室温下静置30min。然后将上清液转移到干净的15mL离心管中，通过以1000rpm离心5min将细胞制成颗粒，用PBS/无菌蒸馏水混合液(V/V＝1:3)裂解红细胞。

2.3流式细胞术分析与细胞分选(FACS)

将单细胞悬液以1500rpm离心5min，然后将细胞颗粒重悬于2％FBS-PBS溶液(PBS中添加2％FBS)中。样品在室温下用5μL人BD Fc阻断剂(BD，#564219)阻断10min。用1mL 2％FBS-PBS溶液洗涤后，根据实验分别用抗人CD66B-FITC(Biolegend，#305104)或抗人CD15-APC(Biolegend，#301908)对样品进行染色，并在冰上保存20min，再次洗涤染色细胞，用流式细胞仪检测CD66B

2.4免疫荧光检测

石蜡包埋的胶质瘤切片进行脱蜡水化处理，然后用含5％BSA的封闭缓冲液在室温下封闭30min。用抗CD66B(1:100，Novus Biologicals，#NB100-64916)，CD44(1:100，BD，#550392)，FceR1(1:100，Invitrogen，#12-5899)，SIGLEC8(1:100，Invitrogen，#PA5-11681)的一抗分别免疫标记后，用PBST洗涤样品三次，然后在室温下与-荧光二抗避光孵育2h；DAPI复染细胞核。用蔡司荧光显微镜采集免疫荧光图像。

2.Ficoll法纯化粒细胞

将人中性粒细胞分离溶液(Solarbio，#P2410/P9040)加入清洁的15mL离心管中，然后将单细胞悬浮液滴加到分离液上方，室温下800g离心20min后，可见明显的三层液相：最上层为淋巴细胞，中层为粒细胞，最下层为红细胞。将粒细胞小心地移入干净的离心管中，用PBS洗涤。

2.6定量RT-PCR

用TRIzol试剂(Invitrogen，#15596018)提取分离细胞的总RNA，并使用用于第一链cDNA合成的UEIris RT-PCR系统(US.Everbright，#R2020-100T)逆转录为cDNA。在Applied Biosystems 7500实时PCR系统上使用Fast Super EvaGreen Qpcr master mix(美国光大，#S2008-500T)进行定量RT-PCR。每个定量RT-PCR至少独立进行3次。利用GAPDH[Chromosome 12，NC_000012.12(6534517..6538371)]表达量校正相关基因表达水平。

定量RT-PCR所用基因特异性引物如下：

GAPDH正向5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAT-3'和反向5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'；

CEACAM8(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)正向5'-CTCTAATCCACCCTCCAGTATTC-3'和反向5'-AGGATCCGCTGTTCTTTGGTAG-3'；

ITGAM(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)正向5'-ACTTGCAGTGAGAACACGTATG-3'和反向5'-TCATCCGCCGAAAGTCATGTG-3'；

FUT4(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)正向5'-TTGGGACCTCCTAGTTCCAC-3'和反向5'-TGTAAGGAAGCCATTGGA-3'；

CD44(核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)正向5'-ACCACAAGTTTACTAACGCAAGT-3'和反向5'-TCACTAATAGGGCCAGCCTC-3'；

PTPRC(核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)正向5'-TTTGAGGGGGATTCCAGGTAAT-3'和反向5'-GCTCCTCAGCTTGCAGAT-3'；

具体操作如下：

1)cDNA的合成：

试剂盒：UEIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis(withdsDNase)，US.EVERBRIGHT，

在冰浴的无核酸酶离心管中配制逆转录体系如表1，轻轻混匀后瞬时离心。

表1

逆转录反应程序：

(1)37℃孵育2min以去除基因组污染；

(2)55℃孵育10min

(3)85℃孵育10s。

将获得的逆转录反应产物迅速置于冰上或保存于-20℃。

2)Real-time PCR反应：

试剂盒：Fast Super

①冰浴融化试剂盒各组分，按表2所示比例制备反应体系，轻轻混匀后瞬时离心；

表2

②利用ABI 7500完成表3所示条件的反应：

表3

③获取Ct值及溶解曲线。

2.7统计分析

所有分组数据以均值±均值标准误差(SEM)表示。用Prism软件(v8，GraphPad)进行t检验，分析各组间的统计学意义。用统计产品与服务解决方案(SPSS软件)进行卡方检验分析。P<0.05被认为有统计学意义(*P<0.1，**P<0.05，***P<0.01，****P<0.0001)。本发明遵循随机化原则。

3、结果与分析

3.1中性粒细胞样细胞选择性浸润高级别弥漫性胶质瘤

为了评估中性粒细胞在人脑胶质瘤组织中的分布，发明人在苏木精-伊红染色的WHO分级II级(n＝2)，III级(n＝3)，IV级(n＝8)胶质瘤组织和正常脑组织(n＝8)中观察了含有豌豆样分叶状核的细胞(图1C和D中，用箭头指出)，发现中性粒细胞样细胞在WHO分级III级(图1C)和IV级(图1D)胶质瘤组织中浸润，而在WHO分级II级(图1B)胶质瘤组织和正常脑组织中未见浸润(图1A)。

具体而言，每2.5×10

上述结果表明，中性粒细胞样细胞浸润量与胶质瘤分级呈正相关。

3.2木瓜蛋白酶有效分离胶质瘤组织中的活性单细胞

从实体瘤中获取肿瘤细胞或间质细胞的第一步是组织分离，在方法学上，组织分离通常涉及通过物理或化学分离破坏细胞与细胞之间的接触。研磨法作为一种典型的物理解离方法，可以快速地将组织匀浆化，有利于保持解离后单细胞的原始生理状态。胰蛋白酶是典型的化学工具，常用于分离贴壁细胞，木瓜蛋白酶广泛应用于脑组织中神经和胶质细胞的分离。

为了评价本发明木瓜蛋白酶在原发胶质瘤组织分离中的优势，首先收集高级别胶质瘤标本，将其随机分成三组。一组用陶瓷珠物理研磨(图2A)，另两组分别用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶消化(图2B)。用台盼蓝染色法计数单细胞悬液中的活细胞数。发现，物理研磨产生的活细胞平均数量约为1.8×10

为了进一步研究木瓜蛋白酶处理肿瘤组织细胞后是否会破坏其细胞表面的蛋白，发明人用木瓜蛋白酶连续处理肿瘤组织获取分离细胞，同时流式细胞仪检测木瓜蛋白酶处理0min，15min，30min，45min四个不同时间点所得分离细胞的抗原性。发明人根据白细胞FSC-SSC图分析粒细胞分离率，以及CD66B(中性粒细胞常见的表面蛋白)阳性率。所有木瓜蛋白酶处理组和未处理组，均以未染色的样品为阴性对照，分析CD66B

3.3CD66B在GANs分离中发挥独特的表面标记作用

不同的免疫细胞可能表达相同的表面蛋白。例如，CD15和CD66B一般在中性粒细胞和嗜酸性粒细胞中表达，CD44在T细胞和中性粒细胞中高表达。(表4)。这些表面蛋白通常结合起来识别外周血中的中性粒细胞。在胶质瘤组织中，脑保护系统血脑屏障(BBB)选择性地限制某些免疫细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)的进入。为了探讨哪种组合可用于GANs的分离，发明人用流式细胞术分析了APC结合抗CD15抗体和FITC结合抗CD66B抗体共染色的血液或胶质瘤组织来源的单细胞悬液。结果发现，血源性活细胞主要分为CD15

表4

为了进一步证实上述结果，发明人将CD44和CD66B结合起来评估胶质瘤组织中的中性粒细胞。免疫荧光分析清楚显示高级别胶质瘤中浸润的CD66B

3.4CD66B介导的流式细胞术大大提高了分离的GANs的纯度

从机理上讲，组织浸润免疫细胞纯化的常用方法包括基于密度梯度离心的Ficoll分离法和FACS(图4A)。为了研究本发明FACS对中性粒细胞纯化有效性，发明人用Ficoll法分离分析结合作为对比。

首先用Ficoll法从人外周血中分离出中性粒细胞，将收集的细胞进一步用FITC偶联的抗CD66B抗体染色，流式细胞仪分析，发现CD66B

为了进一步证实分离的CD66B

上述结果表明：对于含有大量异种细胞的胶质瘤组织，基于CD66B的流式细胞术可以更准确地标记中性粒细胞，提高GANs分离的纯度。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 天津医科大学肿瘤医院

<120> 一种高效分离人实体瘤相关中性粒细胞的方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggggccca tctcagcccc ttcctgcaga tggcgcatcc cctggcaggg gctcctgctc 60

acagcctcac ttttcacctt ctggaacccg cccaccactg ctcagctcac tattgaagct 120

gtgccatcca atgctgcaga ggggaaggag gttcttctac ttgtccacaa tctgccccag 180

gaccctcgtg gctacaactg gtacaaaggg gaaacagtgg atgccaaccg tcgaattata 240

ggatatgtaa tatcaaatca acagattacc ccagggcctg catacagcaa tcgagagaca 300

atatacccca atgcatccct gctgatgcgg aacgtcacca gaaatgacac aggatcctac 360

accctacaag tcataaagct aaatcttatg agtgaagaag taactggcca gttcagcgta 420

catccggaga ctcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaccccgt ggaggacaag 480

gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcagaaca caacctacct gtggtgggta 540

aatggtcaga gtctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600

actctactca gtgtcacaag gaatgacgta ggaccctatg aatgtgaaat acagaaccca 660

gcgagtgcaa acttcagtga cccagtcacc ctgaatgtcc tctatggccc agatgccccc 720

accatttccc cttcagacac ctattaccat gcaggggtaa atctcaacct ctcctgccat 780

gcggcctcta atccaccctc acagtattct tggtctgtca atggcacatt ccagcaatac 840

acacaaaagc tctttatccc caacatcact acaaagaaca gcggatccta tgcctgccac 900

accactaact cagccactgg ccgcaacagg accacagtca ggatgatcac agtctctgat 960

gctttagtac aaggaagttc tcctggcctc tcagctagag ccactgtcag catcatgatt 1020

ggagtactgg ccagggtggc tctgatatag 1050

<210> 2

<211> 4629

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctctca gagtccttct gttaacagcc ttgaccttat gtcatgggtt caacttggac 60

actgaaaacg caatgacctt ccaagagaac gcaaggggct tcgggcagag cgtggtccag 120

cttcagggat ccagggtggt ggttggagcc ccccaggaga tagtggctgc caaccaaagg 180

ggcagcctct accagtgcga ctacagcaca ggctcatgcg agcccatccg cctgcaggtc 240

cccgtggagg ccgtgaacat gtccctgggc ctgtccctgg cagccaccac cagcccccct 300

cagctgctgg cctgtggtcc caccgtgcac cagacttgca gtgagaacac gtatgtgaaa 360

gggctctgct tcctgtttgg atccaaccta cggcagcagc cccagaagtt cccagaggcc 420

ctccgagggt gtcctcaaga ggatagtgac attgccttct tgattgatgg ctctggtagc 480

atcatcccac atgactttcg gcggatgaag gagtttgtct caactgtgat ggagcaatta 540

aaaaagtcca aaaccttgtt ctctttgatg cagtactctg aagaattccg gattcacttt 600

accttcaaag agttccagaa caaccctaac ccaagatcac tggtgaagcc aataacgcag 660

ctgcttgggc ggacacacac ggccacgggc atccgcaaag tggtacgaga gctgtttaac 720

atcaccaacg gagcccgaaa gaatgccttt aagatcctag ttgtcatcac ggatggagaa 780

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aaggcaatca tggagttcaa tcccagggaa gtggcaagga atgtatttga gtgtaatgat 1920

caggtggtga aaggcaagga agccggagag gtcagagtct gcctccatgt ccagaagagc 1980

acacgggatc ggctaagaga aggacagatc cagagtgttg tgacttatga cctggctctg 2040

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aacgtgacag tgactgtgag aaatgatggt gaggactcct acaggacaca ggtcaccttc 2460

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agcaccagct gcagcataaa ccaccccatc ttcccggaaa actcagaggt cacctttaat 2640

atcacgtttg atgtagactc taaggcttcc cttggaaaca aactgctcct caaggccaat 2700

gtgaccagtg agaacaacat gcccagaacc aacaaaaccg aattccaact ggagctgccg 2760

gtgaaatatg ctgtctacat ggtggtcacc agccatgggg tctccactaa atatctcaac 2820

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gggcagagga gcctccccat cagcctggtg ttcttggtgc ccgtccggct gaaccagact 2940

gtcatatggg accgccccca ggtcaccttc tccgagaacc tctcgagtac gtgccacacc 3000

aaggagcgct tgccctctca ctccgacttt ctggctgagc ttcggaaggc ccccgtggtg 3060

aactgctcca tcgctgtctg ccagagaatc cagtgtgaca tcccgttctt tggcatccag 3120

gaagaattca atgctaccct caaaggcaac ctctcgtttg actggtacat caagacctcg 3180

cataaccacc tcctgatcgt gagcacagct gagatcttgt ttaacgattc cgtgttcacc 3240

ctgctgccgg gacagggggc gtttgtgagg tcccagacgg agaccaaagt ggagccgttc 3300

gaggtcccca accccctgcc gctcatcgtg ggcagctctg tcgggggact gctgctcctg 3360

gccctcatca ccgccgcgct gtacaagctc ggcttcttca agcggcaata caaggacatg 3420

atgagtgaag ggggtccccc gggggccgaa ccccagtagc ggctccttcc cgacagagct 3480

gcctctcggt ggccagcagg actctgccca gaccacacgt agcccccagg ctgctggaca 3540

cgtcggacag cgaagtatcc ccgacaggac gggcttgggc ttccatttgt gtgtgtgcaa 3600

gtgtgtatgt gcgtgtgtgc aagtgtctgt gtgcaagtgt gtgcacatgt gtgcgtgtgc 3660

gtgcatgtgc acttgcacgc ccatgtgtga gtgtgtgcaa gtatgtgagt gtgtccaagt 3720

gtgtgtgcgt gtgtccatgt gtgtgcaagt gtgtgcatgt gtgcgagtgt gtgcatgtgt 3780

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gaaacacagc agcttctctc cactgaaaga agtgggactt cccgtcgcct gcgagcctgc 4020

ggcctgctgg agcctgcgca gcttggatgg agactccatg agaagccgtg ggtggaacca 4080

ggaacctcct ccacaccagc gctgatgccc aataaagatg cccactgagg aatgatgaag 4140

cttcctttct ggattcattt attatttcaa tgtgacttta attttttgga tggataagct 4200

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atattcaagt cacctcctta aaggtagtca agattgtgtt ttgaggtttc cttcagacag 4320

attccaggcg atgtgcaagt gtatgcacgt gtgcacacac accacacata cacacacaca 4380

agctttttta cacaaatggt agcatacttt atattggtct gtatcttgct ttttttcacc 4440

aatatttctc agacatcggt tcatattaag acataaatta ctttttcatt cttttatacc 4500

gctgcatagt attccattgt gtgagtgtac cataatgtat ttaaccagtc ttcttttgat 4560

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<210> 3

<211> 1593

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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gaggaggtgg atctgcgcgt gttggactac gaggaggcag cggcggcggc agaagccctg 840

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gtgaccgtgg acgtgttcgg ccggggcggg ccggggcagc cggtgcccga aattgggctc 1200

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<210> 4

<211> 2229

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agcacctttg aaagagaaaa tgacttctca gagaccacaa cttctcttag tccagacaat 240

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ctgacagaac tgaaacatgg agaccaggaa atctgtgctc agtactgggg agaaggaaag 3240

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cttcgtgtct ttgaactgag acattccaag aggaaagact ctcgaactgt gtaccagtac 3360

caatatacaa actggagtgt ggagcagctt cctgcagaac ccaaggaatt aatctctatg 3420

attcaggtcg tcaaacaaaa acttccccag aagaattcct ctgaagggaa caagcatcac 3480

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gctttgttaa atctcttaga aagtgcggaa acagaagagg tagtggatat ttttcaagtg 3600

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ctatatgacg tcattgccag cacctaccct gctcagaatg gacaagtaaa gaaaaacaac 3720

catcaagaag ataaaattga atttgataat gaagtggaca aagtaaagca ggatgctaat 3780

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gctttaaatc aaggttcata g 3921